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Biochemistry

कैसे थोक में और जीने की कोशिकाओं में Photoactivated फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अंश को बढ़ाता है

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58588
Automatic Translation
1, 1
1Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि आनुवंशिक रूप से शामिल वर्णक्रमीय अलग photoactivatable और फ्लोरोसेंट प्रोटीन मौजूद । इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन chimeras की अनुमति ठहराव PA-FP अंश है कि photoactivated है फ्लोरोसेंट हो, यानी, photoactivation दक्षता । प्रोटोकॉल से पता चलता है कि photoactivation के विभिंन तरीकों अलग photoactivation क्षमता उपज ।

Abstract

Photoactivatable और-परिवर्तनीय फ्लोरोसेंट प्रोटीन (PA-एफपीएस) कोशिकाओं और प्रोटीन पहनावे की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए प्रतिदीप्ति लाइव सेल माइक्रोस्कोपी में इस्तेमाल किया गया है । इस प्रकार अब तक, कोई विधि के लिए थोक में और जीने की कोशिकाओं में नहीं है उपलब्ध है पीए-एफपीएस के कितने व्यक्त fluoresce को photoactivated हैं ।

यहां, हम एक आंतरिक शासकों, यानी, आनुवंशिक रूप से युग्मित वर्णक्रमीय अलग (photoactivatable) फ्लोरोसेंट प्रोटीन शामिल प्रोटोकॉल मौजूद है, ratiometrically सभी फिलीस्तीनी अथॉरिटी के अंश-एफपीएस एक सेल है कि पर बंद कर रहे है में व्यक्त की है फ्लोरोसेंट. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम बताते है कि photoactivation के विभिंन तरीकों अलग photoactivation क्षमता उपज । लघु उच्च शक्ति photoactivation एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (CLSM) के साथ अप करने के लिए चार बार कम स्तर CLSM या एक छोटे widefield रोशनी द्वारा लागू पल्स द्वारा लागू जोखिम के सैकड़ों से photoactivation क्षमता कम हुई । जबकि प्रोटोकॉल (फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए यहां उदाहरण गया है) GFP और (फिलीस्तीनी अथॉरिटी-) चेरी, यह सिद्धांत रूप में किसी भी वर्णक्रमीय विशिष्ट photoactivatable या photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन जोड़ी और किसी भी प्रयोगात्मक सेट अप करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

२००२ में पहले मोटे तौर पर लागू photoactivatable (पीए-GFP1) और photoconvertible (Kaede2) फ्लोरोसेंट प्रोटीन्स बताए गए । ये ऑप्टिकल हाइलाइटर फ्लोरोसेंट प्रोटीन यूवी प्रकाश, यानी के साथ विकिरण पर उनके वर्णक्रमीय गुण बदल जाते हैं , वे (photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन, यानी, PA-एफपीएस) उज्ज्वल हो, या अपने रंग बदल (photoconvertible एफपीएस) । तिथि करने के लिए, कई प्रतिवर्ती और अपरिवर्तनीय photoactivatable और photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन3,4विकसित किया गया है । पहनावा या थोक अध्ययन में, ऑप्टिकल हाइलाइट्स पूरे कोशिकाओं या प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और उपसेलुलर डिब्बों की कनेक्टिविटी. इसके अलावा, ऑप्टिकल हाइलाइट्स सक्षम एकल-अणु आधारित superresolution इमेजिंग तकनीक जैसे पाम5 और FPALM6।

हालांकि फोटोरासायनिक प्रक्रियाओं photoactivation या रूपांतरण के दौरान कई ऑप्टिकल हाइलाइटर्स और यहां तक कि crystallographic संरचनाओं के लिए वर्णित किया गया है पहले और बाद photoactivation/रूपांतरण उपलब्ध कराया गया है7 , 8, photoactivation और रूपांतरण की अंतर्निहित तस्वीरभौतिक तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं है । इसके अलावा, इस प्रकार अभी तक केवल कच्चे तेल का अनुमान photoactivation और रूपांतरण की क्षमता के मौजूद है, कि, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अंश व्यक्त की है कि वास्तव में photoconverted या photoactivated है फ्लोरोसेंट है । इन विट्रो पहनावा अध्ययन में अवशोषण स्पेक्ट्रा और एक जेल9,10,11में देशी और सक्रिय प्रोटीन की मात्रा में बदलाव को बढ़ाता हुआ बताया गया है ।

यहां, हम एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन chimeras शामिल प्रोटोकॉल के लिए थोक में और जीने की कोशिकाओं में photoactivated फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अंश का आकलन उपस्थित । जब भी आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ काम करने, प्रोटीन की निरपेक्ष राशि व्यक्त सेल से कोशिका को बदलता है और अज्ञात है । अगर एक फिलीस्तीनी अथॉरिटी-fp एक्सप्रेस एक सेल से photoactivation के बाद एक उज्जवल संकेत दिखाता है, यह अंतर नहीं किया जा सकता है अगर यह उज्जवल संकेत पीए-fp या pa-fp के एक अधिक कुशल photoactivation की उच्च अभिव्यक्ति के कारण है । कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के स्तर का मानकीकरण करने के लिए, हम आनुवंशिक रूप से युग्मित वर्णक्रमीय विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन के आंतरिक शासकों परिचय । एक photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन की आनुवंशिक जानकारी को एक वर्णक्रमीय हमेशा अलग-फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर युग्मन से, आंतरिक शासकों कि अभी भी एक अज्ञात कुल राशि के लिए व्यक्त किया जाएगा, लेकिन एक निश्चित और ज्ञात सापेक्ष राशि में 1:1. इस रणनीति के विभिंन यूवी प्रकाश photoactivation योजनाओं के मात्रात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, अर्थात्, फिलीस्तीनी अथॉरिटी के सापेक्ष राशि का आकलन-एफपीएस कि photoactivation के विभिंन साधनों के साथ photoactivated जा सकता है, और इस तरह परमिट दूसरों की तुलना में अधिक प्रभावी photoactivation योजनाओं को परिभाषित करने के लिए । इसके अलावा, इस रणनीति सिद्धांत में अनुमति देता है photoactivated PA-FP अंश के निरपेक्ष ठहराव का आकलन । यह अंत करने के लिए, यह है कि प्रस्तुत पहनावा अध्ययन तीव्रता आधारित है जो विश्लेषण और अधिक जटिल के रूप में इस प्रोटोकॉल में निर्धारित करता है एहसास महत्वपूर्ण है । मापा फ्लोरोसेंट तीव्रता, यानी, विभिन्न आणविक चमक, अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और झल्लाहट प्रभाव का निर्धारण मापदंडों, जब विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना पर विचार किया जाना चाहिए ।

प्रस्तुत ratiometric तीव्रता आधारित ठहराव photoactivation दक्षता के लिए उदाहरण है फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-जी कोशिकाओं में चेरी, लेकिन सिद्धांत रूप में मोटे तौर पर लागू है और किसी भी photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रायोगिक शर्त ।

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Protocol

1. प्लाज्मिड निर्माण

  1. दो रंग फ्यूजन जांच उत्पंन करते हैं । एक स्तनधारी सेल अभिव्यक्ति सदिश का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) जिसमें mCherry112 और PA-mCherry113 प्रतिबंध साइटों AgeI और BsrGI के साथ डाला गया है ।
  2. आदेश कस्टम oligo-न्यूक्लियोटाइड eGFP और पीए-eGFP युक्त A206K उत्परिवर्तन, यानी, mEGFP और पीए-mEGFP14 एक codon एक SalI-BamHI टुकड़ा के रूप में एक रोक के रूप में शामिल के monomeric वेरिएंट बढ़ाना है । ' एन टर्मिनल प्राइमरी 5 का प्रयोग करें '-AAT ताा सीएजी TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC ढकोसला जी 3 ' और सी-टर्मिनल प्राइमरी 5 '-AAT ATA TGG एटीसी CCG CTT जीटीए सीएजी सीटीसी गोरखा प्रशिक्षण कैट 3 ' जीसी और अभिव्यक्ति वेक्टर के एकाधिक क्लोनिंग साइट में इस SalI-BamHI टुकड़ा डालें । इस हरी और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच पांच एमिनो एसिड linker RNPPV पैदा करेगा । हम GFP के रूप में fluorophore chimeras का उल्लेख होगा-चेरी, फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP-चेरी, और GFP-फिलीस्तीनी अथॉरिटी-इस अनुच्छेद के शेष के लिए चेरी ।
    नोट: fluorophores और आंतरिक शासकों के निर्माण के युग्मन photoactivation दक्षता का आकलन किसी भी वर्णक्रमीय विशिष्ट fluorophore जोड़ी के साथ किया जा सकता है, जैसे superfolder pa-GFP 15/पीए-TagRFP 16, आदि photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन से कई GFP से प्राप्त कर रहे हैं । इसलिए, प्राइमरी अनुक्रम के ऊपर प्रदान की कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक स्तनधारी सेल अभिव्यक्ति वेक्टर में एक fluorophore कल्पना का निर्माण ।

2. सेल कल्चर और अभिकर्मक

  1. या तो किसी भी मानक सेल लाइन जैसे हेला, केरलवासियों, क्योंकि-7 या विशिष्ट photoactivation प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक विशिष्ट सेल लाइन का उपयोग करें । DMEM का प्रयोग करें (10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, और 2 मिमी glutamine) और trypsin बिना phenol लाल ( सामग्री की तालिकादेखें) पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए.
  2. trypsin के साथ एक धाराप्रवाह संस्कृति की कोशिकाओं को अलग, एक Neubauer चैंबर का उपयोग कर सेल निलंबन में कोशिकाओं की संख्या की गणना, और बीज ५,००० – १०,००० कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से. वैकल्पिक रूप से, एक 2-एमएल पिपेट से एक 10 मिलीलीटर सेल निलंबन के एक टी 25-सेल संस्कृति कुप्पी या एक टी १२.५ में हो एक धाराप्रवाह संस्कृति से 5 मिलीलीटर सेल निलंबन से 3 बूंदें में हो एक से 1 ड्रॉप का उपयोग करें-सेल संस्कृति कुप्पी ।
  3. प्रतिदीप्ति लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए #1 .0 कवर ग्लास ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ 8-well कक्षों में सेल बढ़ाएँ ।
  4. Transfect कोशिकाओं 24 एच के बाद वाणिज्यिक रिएजेंट का उपयोग कर चढ़ाना ( सामग्री की तालिकादेखें) GFP के साथ वितरणकर्ता प्रोटोकॉल प्रति-चेरी, फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP-चेरी, और GFP-pa-चेरी chimeras ।
  5. 20 एच पोस्ट अभिकर्मक की कुल के बाद छवि कोशिकाओं को प्रोटीन अभिव्यक्ति, तह और परिपक्वता के लिए अनुमति देते हैं ।

3. इमेजिंग और Photoactivation

  1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified और गर्म पर्यावरण चैंबर में छवि कोशिकाओं । शारीरिक पीएच में सेल मीडिया बफर और यह2-स्वतंत्र सह प्रदान करते हैं, 20 मिमी HEPES, या उपयोग सह2 गैस 5% प्रवाह के लिए सेट जोड़ें ।
  2. सबसे पहले, छवि कोशिकाओं GFP-चेरी का निर्माण व्यक्त । निर्धारित पैरामीटर है कि समय को परिभाषित एक फोकल छवि, यानी, पिक्सेल प्रति में एकीकृत लेजर तीव्रता microseconds, acousto-ऑप्टिकल स्वरित्र फ़िल्टर प्रतिशत में (AOTF) संचरण में समय, और डिजिटल ज़ूम ।
    नोट: एक 60x उद्देश्य और 3x के एक डिजिटल ज़ूम का उपयोग करने की अनुमति देता है अपनी संपूर्णता में एक सेल के इमेजिंग, जबकि पर्याप्त इज़ाफ़ा प्रदान । सेट पिक्सेल 2-4 μs और ४८८-एनएम और ५६१ एनएम लेजर के लिए AOTF संचरण के लिए समय है कि छवियों को किसी भी ब्लीचिंग और कोई पिक्सल प्रतिदीप्ति तीव्रता संतृप्ति का संकेत के बिना एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात दिखा ।
  3. छवि, सेट लेजर पावर का उपयोग कर, AOTF संचरण, पिक्सेल आवास समय और डिजिटल ज़ूम, 15-20 कोशिकाओं GFP व्यक्त-चेरी ।
  4. फिर, एक ही सेट लेजर शक्ति के साथ छवि, पिक्सेल निवास समय, AOTF संचरण और डिजिटल ज़ूम GFP व्यक्त कोशिकाओं-pa-चेरी और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP-चेरी । ग्रीन चैनल या लाल चैनल में व्यक्त कोशिकाओं के लिए खोज, क्रमशः । कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए खोज के दौरान कोशिकाओं के लंबे समय से बचने के क्रम में ब्लीच फ्लोरोसेंट प्रोटीन नहीं करने के लिए ।
  5. एक पूर्व-सक्रियण छवि और तीन पोस्ट-सक्रियण छवियों के साथ एक मिनी-टाइम श्रृंखला सेट करें । बाद सक्रियण छवियों क्षमता क्षणिक अंधेरे यूवी प्रकाश के लिए जोखिम के कारण राज्यों की पहचान में मदद मिलेगी ।
    नोट: हमारे हाथ में, क्षणिक अंधेरे राज्यों के कारण पता लगाया प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन < 1% थे और उपेक्षित किया जा सकता है, लेकिन उन अंधेरे राज्यों हर प्रयोगात्मक सेट अप के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
  6. photoactivation दक्षता का निर्धारण करने के लिए, अर्थात, PA-एफपीएस के अंश जो फ्लोरोसेंट होने पर स्विच किए जाते हैं, विशिष्ट photoactivation प्रयोगों में जो पहले से ही स्थापित किए गए हैं, 15-20 कक्षों में वही photoactivation सेटिंग्स लागू करें जो आंतरिक शासकों यहां पेश किया और छवि विश्लेषण (धारा 4) के साथ आगे बढ़ना व्यक्त कर रहे हैं । photoactivation प्रयोगों को स्थापित करने के लिए शुरू करने के लिए, यहाँ पीए-GFP और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-चेरी के साथ हमारे प्रयोगात्मक अनुभव के आधार पर कुछ अलग सेटिंग्स मिल; आवश्यकतानुसार संशोधित करें ।
    1. pa-GFP और pa-चेरी का एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (CLSM) का उपयोग कर के तात्कालिक photoactivation के लिए, क्रमशः 3 या 5 पुनरावृत्तियों में ४०५-एनएम लेजर लाइट के ९० μW लागू होते हैं ।
      नोट: हमारे सूक्ष्म सेट अप के साथ, एक ३८% AOTM संचरण और एक 2 μs पिक्सेल का उपयोग कर समय है, हम इस लाइन में ४०५ एनएम लेजर शक्ति-स्कैन मोड उद्देश्य लेंस पर मापा । इन सेटिंग्स के साथ, के बारे में 8% और पीए-GFP और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-चेरी व्यक्त की 16% के लिए फ्लोरोसेंट हो photoactivated जा सकता है । तात्कालिक photoactivation के लिए CLSM का उपयोग करने वाली संपूर्ण अनुमापन श्रृंखला पहले१७प्रकाशित हो चुकी है.
    2. यदि photoactivated pa-GFP और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-चेरी fluorophores के एक उच्च अंश एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात को प्राप्त करने के लिए लाभप्रद उदाहरण है, और photoactivation के लिए तत्काल नहीं है, एक 2 μW पिक्सेल के साथ ४०५-एनएम लेजर प्रकाश के ४० μs लागू समय और 6% ४५० पुनरावृत्तियों के लिए AOTF संचरण । फिर, photoactivation 4 मिनट के रूप में केवल 1-2 सेकंड के लिए विरोध करने के लिए ले जाएगा, लेकिन PA-GFP के लिए photoactivation क्षमता 29% की बजाय 8% हो जाएगा, एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात के लिए अनुमति देता है ।
  7. यदि एक मोज़ेक डिजिटल रोशनी प्रणाली है कि एक स्थानिक प्रकाश मॉडुलन में माइक्रो दर्पण arrays शामिल है उपलब्ध है, ४०५ एनएम लेजर प्रकाश widefield-photoactivation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह मिसे के भीतर कुशल photoactivation के लिए अनुमति देता है ।
    नोट: के साथ १.६ मेगावाट लेजर बिजली के रूप में उद्देश्य लेंस और २५० एमएस, PA-GFP के 29% के एक जोखिम समय में मापा फ्लोरोसेंट हो photoactivated जा सकता है ।
  8. किसी भी सेट photoactivation मानकों 15-20 कोशिकाओं pa-GFP-चेरी और GFP-pa-चेरी, क्रमशः एक्सप्रेस के साथ छवि ।
  9. के बाद से पीएच, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और अंय पर्यावरणीय कारकों photoactivation क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं, यह फिलीस्तीनी अथॉरिटी के photoactivation क्षमता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है संबंधित सेलुलर micromilieu में एफपीएस जहां ब्याज की प्रोटीन है स्थित. युग्मन द्वारा fluorophore chimeras ब्याज के प्रोटीन के लिए, के रूप में लेखकों प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन VSVG 18के साथ किया है, photoactivation दक्षता ब्याज की विशिष्ट उपसेलुलर डिब्बे में मूल्यांकन किया जा सकता है ।

4. छवि विश्लेषण और Photoactivation दक्षता के Ratiometric तीव्रता आधारित ठहराव के लिए एल्गोरिथ्म

  1. छवि विश्लेषण खुला स्रोत छवि प्रसंस्करण प्लेटफार्मों ImageJ या फिजी के साथ किया जा सकता है । हरे (बी1) और लाल (बी2) चैनल में गैर transfected कोशिकाओं में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण । perinuclear से बचें या किसी भी क्षेत्र में वृद्धि हुई ऑटो प्रतिदीप्ति दिखा ।
  2. किसी transfected कक्ष में प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करने के लिए, कक्ष मुख्य भाग को मुक्तहस्त चयनों उपकरण से बाह्यरेखांकित करें । फिर से, perinuclear या ऑटो प्रतिदीप्ति दिखा किसी भी अंय क्षेत्रों से बचें ।
  3. प्रत्येक चैनल में मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता से पृष्ठभूमि घटाना.
    मैंजी = iGreen_measured – B1
    आईआर = iRed_measured – B2
  4. GFP का प्रयोग करें-चेरी लाल की गणना करने वाली हरी अनुपात (RtoGr) और दाता के लिए सही-प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) के कारण शमन का निर्माण । झल्लाहट दक्षता ई को GFP के लिए पिछले प्रयोग में ०.३-चेरी दो fluorophores18के बीच ही एमिनो एसिड लिंक का उपयोग कर के निर्माण के लिए निर्धारित किया गया था ।
    RtoGr = (iRed_measured – b2)/(iGreen_measured – b1)
    RtoGrcorr = RtoGr * (१ – इ)
    नोट: इस तीव्रता आधारित दृष्टिकोण में, mEGFP और फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए दाता शमन-mGFP अलग संभव विशिष्ट वर्णक्रमीय गुण है जो विशेषता नहीं किया गया है दिया जा सकता है । झल्लाहट की दर (kET) और Foerster दूरी (R0) दाता की क्वांटम उपज पर निर्भर करता है जो mEGFP और पीए-mGFP के लिए निर्धारित नहीं किया गया है.
  5. GFP का प्रयोग करें-pa-चेरी photoactivated pa-चेरी के अंश का आकलन करने के लिए निर्माण । पीए-चेरी की उंमीद प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित GFP की मापा अतृप्त हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता गुणा द्वारा-PA-चेरी सही लाल रंग के साथ photoactivation से पहले का निर्माण करने वाली-हरे-अनुपात (RtoGrcorr ).
    मैंRed_expected = (iGreen_measured – B1) * RtoGrcorr
    नोट: के रूप में ऊपर संकेत दिया, हमेशा की आणविक चमक-पर fp और photoactivatable fp अलग हो सकता है । इन अंतरों के लिए खाते के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें ।
  6. photoactivation और लाल चैनल में अपेक्षित प्रतिदीप्ति तीव्रता के बाद मापा लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता के एक अंश के रूप में पीए-चेरी photoactivation दक्षता की गणना ।
    (चपा-चेरी) = (iRed_measured – B2)/मैंRed_expected
  7. pa-GFP — चेरी का उपयोग photoactivated pa-GFP के अंश का मूल्यांकन करने के लिए करें । pa-GFP की मापी लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता को विभाजित करके pa-GFP की अपेक्षित प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करें — चेरी का निर्माण करने से पहले photoactivation को लाल-से-हरा-अनुपात (RtoGr). यहां, RtoGr की जरूरत नहीं है दाता शमन के लिए सही है, क्योंकि GFP और फिलीस्तीनी अथॉरिटी GFP एक ही राशि के लिए शमन दाता के अधीन हैं ।
    मैंGreen_expected = (iRed_measured – B2)/RtoGr
  8. photoactivation और ग्रीन चैनल में उम्मीद प्रतिदीप्ति तीव्रता के बाद मापा हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता के एक अंश के रूप में पीए-GFP photoactivation दक्षता की गणना.
    (चपा-GFP) = (iGreen_measured – B1)/मैंGreen_expected

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अंश के ratiometric ठहराव है कि फ्लोरोसेंट हो photoactivated है दिखाता है (1 चित्रा) । यह अंश photoactivation के मोड पर निर्भर करता है ।

एक विशिष्ट परिणाम एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (CLSM) के साथ कम समय उच्च शक्ति photoactivation का उपयोग कर चित्रा 2cमें दिखाया गया है. titrating के बाद लेजर शक्ति के रूप में पिक्सेल निवास समय और ATOF संचरण द्वारा उद्देश्य लेंस में मापा, फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए अधिकतम photoactivation क्षमता-GFP के बारे में 8% और फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए 16% के बारे में चेरी था । फिलीस्तीनी अथॉरिटी के कम photoactivation दक्षता-GFP और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-चेरी एक साथ photoactivation और विनाश द्वारा समझाया जा सकता है जब फोटॉनों द्वारा CLSM के एक सतत नियतात्मक स्ट्रीम करने के लिए संपर्क किया । छोटे प्रतिदीप्ति जंमों और अलग, सही लाल pa-एफपीएस के अवशोषण स्पेक्ट्रा स्थानांतरित पीए-GFP की तुलना में फिलीस्तीनी अथॉरिटी-चेरी के उच्च photoactivation क्षमता में योगदान कर सकते हैं ।

कम लेजर शक्ति और पुनरावृत्तियों के सैकड़ों का उपयोग करना, एक उच्च photoactivation दक्षता प्राप्त किया जा सकता है । ४५० पुनरावृत्तियां यूवी-प्रकाश की कुल पर एक CLSM द्वारा दिया 4 मिनट की एक photoactivation दक्षता के लिए 29% के पीए-GFP (चित्रा 3सी) झुकेंगे । यूवी प्रकाश फोटॉनों के लिए दोहराए जोखिम के साथ उच्च photoactivation दक्षता एक बहु कदम photoactivation प्रक्रिया का सुझाव हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, एप्लाइड यूवी प्रकाश photoactivate करने के लिए पर्याप्त मजबूत है, लेकिन पर्याप्त नहीं photodestruct जो photoactivated फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक उच्च अंश के लिए समय के साथ संचई होता है ।

widefield रोशनी के साथ, fluorophores stochastically और दोहराए ४०५-एनएम फोटॉनों के संपर्क में हैं । यहां, केवल २५० एमएस के लिए जोखिम पीए GFP के लिए एक 29% photoactivation क्षमता झुकेंगे ।

Figure 1
चित्रा 1: कैसे थोक में और जीवित कोशिकाओं में photoactivation दक्षता का निर्धारण करने की अवधारणा । वर्णक्रमीय विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन युग्मन द्वारा, आंतरिक शासकों जो photoactivation दक्षता के ratiometric तीव्रता आधारित आकलन के लिए अनुमति बनाई गई हैं । फिलीस्तीनी अथॉरिटी-चेरी और फिलीस्तीनी अथॉरिटी GFP की तीव्रता की उंमीद की तीव्रता से संबंधित थे । उंमीद की तीव्रता GFP-चेरी, GFP-pa-चेरी या फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP-चेरी chimeras से पहले photoactivation में फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर हमेशा की प्रतिदीप्ति गहनता का निर्धारण करने से व्युत्पंन थे । चित्रा Renz और wunder भागो २०१७17से संशोधित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: फिलीस्तीनी अथॉरिटी के थोक photoactivation-GFP-चेरी (क) और GFP-pa-चेरी (ख) के रूप में तुरंत और पूरी तरह से संभव के रूप में जीने की कोशिकाओं में एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । PA के 8%-GFP व्यक्त 2 μs और ३८% जो ९० μW के लेजर पावर में परिणाम के एक पिक्सेल के आवास के समय के साथ photoactivated था, के रूप में उद्देश्य लेंस और 3 पुनरावृत्तियों (सी) में मापा । ४०५-एनएम लेजर पावर बढ़ाने से photoactivation दक्षता में वृद्धि नहीं हुई । चित्रा Renz और wunder भागो २०१७17से संशोधित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: चलने कम शक्ति एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ photoactivation (क) और कम उच्च शक्ति widefield रोशनी (ख) उच्च photoactivation क्षमता उपज । PA-GFP के 29% 2 μs और 6% है, जो ४० μW की लेजर शक्ति में परिणाम के एक पिक्सेल निवास के समय के साथ photoactivated था, के रूप में उद्देश्य लेंस और ४५० पुनरावृत्तियों पर मापा (सी) । चित्रा Renz और wunder भागो २०१७17से संशोधित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

अब तक, कोई विधि थोक में पीए के अंश-जी कोशिकाओं है कि फ्लोरोसेंट हो photoactivated है में व्यक्त एफपीएस का निर्धारण करने के लिए अस्तित्व में है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल किसी भी वर्णक्रमीय विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन जोड़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जबकि अपरिवर्तनीय पीए के लिए यहां उदाहरण-एफपीएस pa-GFP और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-चेरी, इस दृष्टिकोण सिद्धांत में photoconvertible प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से लागू है । वर्णक्रमीय विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन, तथापि, ध्यान से वर्णक्रमीय दिया है कि photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन उनके अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा बदलाव, हरे रंग से लाल प्रतिदीप्ति के लिए उदाहरण के ओवरलैप को कम करने के लिए चुना जाना चाहिए ।

जैसा कि ऊपर उल्लिखित, यह राज्य के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रस्तुत दृष्टिकोण ratiometric और तीव्रता आधारित है । यह कोशिकाओं में अज्ञात अभिव्यक्ति स्तर के मानकीकरण और photoactivation के विभिन्न तरीकों से photoactivation दक्षता में सापेक्ष मतभेद को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल भी photoactivated PA-एफपीएस के निरपेक्ष अंश का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । फिर, अलग एफपीएस के विभिन्न वर्णक्रमीय गुणों को ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

आणविक चमक (एमबी) क्वांटम उपज के उत्पाद है (QY), विलुप्त होने गुणांक (ईसी) और दिए गए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के सापेक्ष अवशोषक शिखर पर प्रतिशत अवशोषक । 12 चेरी और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-चेरी13के लिए, QY और चुनाव आयोग के संबंधित मूल्यों को प्रकाशित किया गया है । अवशोषित चोटी के सापेक्ष ५४३ एनएम के दिए गए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर प्रतिशत अवशोषक क्रमशः ०.५ और ०.७ है ।
एमबीचेरी = ०.२२ * ७२,००० * ०.५ = ७,९२०
एमबीपीए-चेरी = ०.४६ * १८,००० * ०.७ = ५,७९६
इस प्रकार, फिलीस्तीनी अथॉरिटी की कम आणविक चमक चेरी की तुलना में मैं १.३७ द्वाराRed_expected विभाजित द्वारा खाते में लिया जा सकता है (7920/5796 से व्युत्पंन) ।

तथापि, यह अज्ञात है जिसके तहत पीए-चेरी की प्रकाशित आणविक चमक photoactivation परिस्थितियों का निर्धारण किया गया है. यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि हम यहां बताते है कि photoactivation के मोड photoactivated PA-एफपीएस के मापा अंश बदलता है । इसके अलावा, monomeric A206K उत्परिवर्तन शामिल संस्करणों के लिए । यानी, mEGFP और पीए-mEGFP, कोई आणविक चमक प्रकाशित नहीं हुई है.

इस ratiometric तीव्रता आधारित दृष्टिकोण में, फिलीस्तीनी अथॉरिटी की आणविक चमक-एफपीएस और हमेशा एक प्रथम सन्निकटन में FP समकक्षों पर एक समान माना गया है । हम इस दृष्टिकोण पर फैसला किया, के बाद से (मैं) कुछ एफपीएस कोई आणविक चमक के लिए सूचित किया गया है, और (ii) यह इस प्रकार अभी तक कैसे photoactivation के विभिंन साधनों में स्पष्ट नहीं है पीए की आणविक चमक को प्रभावित कर सकते है एफपीएस साहित्य में सूचना दी । इसके अलावा, (iii) एक तुलनात्मक विश्लेषण के लिए आणविक चमक का ज्ञान आवश्यक नहीं है; यह केवल photoactivated PA-एफपीएस जो ऊपर दिखाए गए के रूप में गणना की जा सकती है की निरपेक्ष अंश की तीव्रता आधारित निर्धारण के लिए आवश्यक है ।

हमारे आंतरिक शासकों के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन chimeras शामिल दृष्टिकोण है कि यूवी प्रकाश पैदावार अलग photoactivation क्षमता के लिए अलग जोखिम से पता चलता है । इस प्रकार, यह कैसे एक बड़ा PA-FP भिंन photoactivate और एक बेहतर संकेत प्राप्त करने के लिए शोर अनुपात के रूप में विकल्प परिभाषित करता है । इसके अलावा, यह करने के लिए अंतर को खोलता है एक ही सेल में अलग pa-एफपीएस photoactivate यूवी प्रकाश को अपनी विभेदक प्रतिक्रिया दी है या अंतर के लिए एक ही pa-विभिंन उपसेलुलर डिब्बों में FP यह उजागर द्वारा photoactivate अलग यूवी प्रकाश के लिए । संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल और सेलुलर प्रक्रियाओं की मात्रात्मक समझ में मदद मिलेगी PA का उपयोग कर जी-सेल माइक्रोस्कोपी में एफपीएस ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस परियोजना के लिए उपकरण और स्थान प्रदान करने के लिए Dorigo प्रयोगशाला और स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन में तंत्रिका विज्ञान इमेजिंग सेवा का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEGFP-N1 mammalian cell expression vector Clontech
DMEM w/o phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Trypsin w/o phenol red Thermo Fisher Scientific 15400054
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
Fugene 6 Promega E2691

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References

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जैव रसायन १४३ अंक Photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन photoactivation दक्षता ratiometric तीव्रता आधारित पहनावा अध्ययन photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP mCherry
कैसे थोक में और जीने की कोशिकाओं में Photoactivated फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अंश को बढ़ाता है
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Chen, V., Renz, M. How to Quantify… More

Chen, V., Renz, M. How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells. J. Vis. Exp. (143), e58588, doi:10.3791/58588 (2019).

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