Summary
여기, 선물이 형광 단백질 유전자 결합된 괴기 하 게 명료한 photoactivatable를 포함 하는 프로토콜. 이러한 형광 단백질 키메라 photoactivation 효율성 즉, 형광, 수의 photoactivated는 PA FP 분수의 정량화를 허용 합니다. 프로토콜은 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 산출을 보여준다.
Abstract
Photoactivatable 및-컨버터블 형광 성 단백질 (PA-FPs) 세포와 단백질 앙상블의 역학을 분석 하기 위한 형광 라이브 셀 현미경에 사용 되었습니다. 지금까지, 방법은 없습니다 대량에서 계량 수 되었으며 라이브에서 PA-FPs의 얼마나 많은 표현 세포 형광을 photoactivated 있습니다.
여기, 우리가 현재 내부 통치자를 포함 하는 프로토콜, 즉, 유전자 결합 spectrally 별개 (photoactivatable) 형광 단백질, ratiometrically 모든 PA-FPs의 것에 전환 하는 셀에 표시의 일부분을 계량 형광. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 photoactivation의 다양 한 모드로 다른 photoactivation 효율성 나왔고 보여줍니다. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 짧은 고 전력 photoactivation CLSM으로 적용 하는 낮은 수준의 노출 또는 widefield 조명에 의해 적용 짧은 펄스의 수백 보다 4 배 더 낮은 photoactivation 효율까지 결과. 프로토콜 GFP (펜 실바 니 아-)와 (펜 실바 니 아-) 체리 여기 궁 행 되는, 하는 동안 그것은 원칙에 적용할 수 있습니다 어떤 괴기 하 게 명료한 photoactivatable 또는 photoconvertible 형광 단백질 쌍 및 모든 실험 설정.
Introduction
2002 년, 첫 번째 광범위 하 게 적용 가능한 photoactivatable (PA-GFP1) 및 photoconvertible (가2) 형광 단백질 설명 했다. 자외선과, 즉, 방사선 조사 시 스펙트럼 그들의 속성을 변경 하는이 광 형광펜 형광 단백질 그들은 밝은 될 (photoactivatable 형광 성 단백질, 즉, PA FPs), 또는 (photoconvertible 그들의 색상을 변경 FPs)입니다. 날짜 하려면, 여러 가지 되돌릴 수와 돌이킬 수 없는 photoactivatable 및 photoconvertible 형광 단백질 개발된3,4되었습니다. 앙상블 또는 대량 연구, 광학 형광펜 subcellular 구획의 연결 전체 셀 또는 단백질의 역학을 공부 하 고 사용 되었습니다. 또한, 광학 형광펜 사용 단일 분자 이미징 기술이 팜5 FPALM6해상도 기반으로 합니다.
비록 중 사진화학 처리 photoactivation 또는-변환 설명 되었습니다. 많은 광학 형광펜 및 심지어 결정학 구조 photoactivation 전후 /-변환 사용할 수7 되었습니다. , 8, photoactivation 및-변환의 기본 사진물리적 메커니즘 완전히 이해 하지는. 또한, 지금까지 원유 추정 존재의 photoactivation-변환 효율의 즉, 즉 표현 형광 단백질의 분수 실제로 photoconverted 또는 형광 수 photoactivated. 네이티브의 양과 흡수 스펙트럼의 변화를 측정 하 고 젤9,,1011에 단백질 활성화 앙상블 연구 생체 외에서 보고 되었습니다.
여기, 선물이 photoactivated 형광 단백질 대량에서 및 라이브 셀에 분수를 평가 하기 위해 형광 단백질 키메라를 포함 하는 프로토콜. 때마다 형광 단백질 유전자 인코딩된 작업, 표현 하는 단백질의 절대 크기가 셀에서 변화 하 고 알. PA FP를 표현 하는 하나의 셀 다른 셀 보다 photoactivation 후 밝은 신호를 보여줍니다, 경우이 밝은 신호 파 FP의 높은 식 또는 PA-FP의 더 효율적인 photoactivation 분화 될 수 없습니다. 셀에 식 수준 표준화, 유전자 결합된 spectrally 고유한 형광 단백질의 내부 통치자 소개 합니다. 괴기 하 게 뚜렷한 항상에 형광 단백질, 내부 통치자 photoactivatable 형광 단백질의 유전 정보가 만들어집니다 커플링으로는 여전히 표현 됩니다 알 수 없는 총 금액만의 고정 및 알려진 상대 금액에서 1:1.이이 전략 수 제도의 다른 UV 빛 photoactivation, 즉, 양적 특성 photoactivation, 다른 모드와 photoactivated 수를 그로 인하여 허용 PA FPs의 상대적인 양의 평가 다른 사람 보다 더 효과적인 photoactivation 스키마를 정의 합니다. 또한,이 전략 photoactivated PA FP 분수의 절대 정량화 평가 원리에 있습니다. 이 위해, 그것은 제시 앙상블 연구는 강도-기반 분석으로이 프로토콜에 누워 복잡 한 게 실현 하는 것이 중요. 측정 된 형광 강도, 즉, 다른 분자 밝기, 흡 광도 및 방출 스펙트럼 무서 워 효과 결정 하는 매개 변수 다른 형광 단백질의 형광 강도 비교할 때 고려 될 필요가 있다.
Photoactivation 효율성의 제시 비율 강도 기반 정량화 GFP PA 및 PA-벚꽃 라이브 셀에 대 한 예증 하지만 원칙적으로 광범위 하 게 적용 및 어떤 photoactivatable 형광 단백질에서 사용 될 수 있습니다. 실험 조건입니다.
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Protocol
1. 플라스 미드 건설
- 2 색 퓨전 프로브를 생성 합니다. 포유류 세포 식 벡터를 사용 하 여 ( 재료의 표참조)는 mCherry112 , PA mCherry113 제한으로 삽입 되어 있는 사이트 AgeI 및 BsrGI.
- 사용자 지정 올리고 뉴클레오티드 eGFP 및 PA eGFP A206K 돌연변이, 즉, mEGFP PA mEGFP14 사리 BamHI 단편으로 정지 codon 없이 포함 된 단위체 변종 증폭 주문. 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC 아 그 GGC 개 그 G 3'와 C 터미널 뇌관 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC 고양이 GC 3' N 맨끝 뇌관을 사용 하 고 식 벡터의 다중 복제 사이트에 삽입이 사리 BamHI 조각. 이것은 녹색과 적색 형광 단백질 사이 5 개의 아미노산 링커 RNPPV을 만듭니다. 우리 GFP fluorophore 키메라를 참조 한다-체리, PA-GFP-체리, 그리고 GFP-PA-벚꽃이 문서의 나머지 부분에 대 한.
참고: fluorophores의 커플링 및 photoactivation 효율성을 평가 하기 위해 내부 통치자의 창조 함께 할 수 있습니다 어떤 괴기 하 게 뚜렷한 fluorophore 쌍, 예: superfolder PA GFP 15/ PA-TagRFP 16, 등 Photoactivatable 형광 단백질의 많은 GFP에서 파생 됩니다. 따라서, 위에 제공 된 뇌관 순서 포유류 세포 식 벡터에 fluorophore 키메라를 만드는 데 많은 형광 단백질을 위해 사용할 수 있습니다.
2. 세포 배양과 Transfection
- 헬러, NRK, Cos-7 또는 특정 셀 라인 데 사용할 특정 photoactivation 실험 등 모든 표준 셀 라인 중 하나를 사용 합니다. DMEM (10% 태아 둔감 한 혈 청, 그리고 2mm 글루타민 보충)을 사용 하 여 트립 신 없이 페 놀 레드 ( 재료의 표참조)을 줄이기 위해 배경 형광.
- 트립 신 confluent 문화의 세포를 분리, 잘 당 Neubauer 챔버 및 씨앗 5000-10000 셀을 사용 하 여 셀에에서 셀의 수를 계산 합니다. T 25-세포 배양 플라스 크 또는 T 12.5-세포 배양 플라스 크에 성장 confluent 문화에서 5 mL 세포 현 탁 액에서 3 방울 또는 성장 confluent 세포 배양에서 10 mL 세포 현 탁 액의 2 mL 피 펫에서 1 방울을 사용 합니다.
- #1.0 커버 8 잘 실에서 세포 성장 유리 ( 재료의 표참조) 형광 라이브 셀입니다.
- GFP와 배포자의 프로토콜 당 상업용 시 약 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 도금 후 셀 24 h transfect-체리, PA-GFP-체리, 그리고 GFP-PA-체리 키메라.
- 20 h의 총 후 이미지 세포 transfection 단백질 표정, 접는 및 성숙 수 있도록 게시 합니다.
3. 이미징 및 Photoactivation
- 섭씨 37도에서 습도 열 환경 챔버에 이미지 셀. 생리 적 pH에서 셀 미디어를 버퍼링 하 고 CO2렌더링-독립, 추가 20 mM HEPES, 또는 5 %flow 설정 하는 CO2 가스를 사용 하 여.
- 먼저, 이미지는 GFP를 표현 하는 세포-체리 구문. 공초점 이미지, 즉, 픽셀의 유지 시간 (마이크로초)에서, %, 및 디지털 줌 acousto 광학 가변 필터 (AOTF) 전송에서 픽셀 당 시간 통합 레이저 강도 정의 하는 매개 변수를 설정 합니다.
참고: 60 x 목표 및 3 x 디지털 줌 사용 하 여 충분 한 확대를 제공 하면서 전체에서 셀의 이미지를 수 있습니다. 이미지 어떤 표백 없이 좋은 신호 대 잡음 비율을 표시 하 고 형광 강도 채도 나타내는 아무 픽셀 2-4 μ 및 AOTF 전송 488 nm 및 561-nm 레이저에 대 한 픽셀의 유지 시간을 설정 합니다. - 이미지를 사용 하 여 설정된 레이저 전원, AOTF 전송, 픽셀의 유지 시간 및 디지털 줌, GFP를 표현 하는 15-20 셀-체리.
- 그런 다음, 동일한 설정된 레이저 전원, 픽셀의 유지 시간, AOTF 전송 및 디지털 줌 셀 GFP 표현 이미지-PA-체리와 PA-GFP-체리. 녹색 채널 또는 빨강 채널, 셀을 각각 표현에 대 한 검색. 형광 단백질을 표백 하지 위하여 세포를 표현 하기 위한 검색 하는 동안 셀의 긴 노출을 피하십시오.
- 하나의 사전 활성화 이미지와 세 후 활성화 이미지 미니 시계열을 설정 합니다. 후 정품 인증 이미지는 UV 빛에 노출 때문에 잠재적인 과도 어두운 상태를 식별 하는 데 도움이 됩니다.
참고: 우리 손에서 검출 된 형광 강도 임시 어두운 상태 때문에 변화 했다 < 1% 수 무시, 하지만 모든 실험 설정에 대 한 그 어두운 상태를 평가 합니다. - 확인 하려면 photoactivation 효율성, 즉, 이미 설정 된 특정 photoactivation 실험에서 형광 수 켜져 PA FPs의 분수 15-20 셀 같은 photoactivation 설정을 적용 하는 여기 소개 하는 내부 통치자를 표현 하 고 이미지 분석 (제 4). Photoactivation 실험 설정 하기 시작 하는 경우 찾기 여기 몇 가지 다른 설정을 PA GFP와 PA-체리; 우리의 실험 경험에 따라 필요에 따라 수정 합니다.
- PA GFP의 PA-체리 confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)를 사용 하 여 즉각적인 photoactivation에 대 한 405 nm 레이저 3 또는 5 반복에서 빛의 90 μW를 각각 적용 합니다.
참고: 우리의 미세한 설정 38 %AOTM 전송과 2 µs 픽셀 망설임 시간을 사용 하 여 우리 측정 대물 렌즈에 라인 스캔 모드에서이 405 nm 레이저 전원. 이러한 설정을 사용 하 여 약 8%와 16%의 PA-GFP와 PA-체리 표현 형광등 수를 photoactivated 수 있습니다. 즉각적인 photoactivation 되어 CLSM를 사용 하 여 전체 적정 시리즈 출판 이전17. - Photoactivated PA-GFP와 PA-체리 fluorophores의 높은 분수 유리 예: 높은 신호 대 잡음 비율을 달성 하 고 photoactivation 즉시 될 필요가 없습니다, 405 nm 레이저 2 μ 픽셀 유지 시간 및 6% 빛의 40 μW 적용 AOTF 전송 450 반복입니다. 다음, photoactivation는만 1-2 초 반대로 최대 4 분 소요 됩니다 하지만 PA GFP에 대 한 photoactivation 효율 29% 8%, 더 높은 신호 대 잡음 비율에 대 한 허용 됩니다.
- PA GFP의 PA-체리 confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)를 사용 하 여 즉각적인 photoactivation에 대 한 405 nm 레이저 3 또는 5 반복에서 빛의 90 μW를 각각 적용 합니다.
- 공간 광 변조기에 마이크로 미러 어레이 포함 하는 모자이크 디지털 조명 시스템을 사용할 수 있는 경우 widefield-photoactivation에 대 한 405 nm 레이저 빛을 사용할 수 있습니다. 효율적인 photoactivation 밀리초 내에 대 한 수 있습니다.
참고: 1.6 mW 레이저 전원 대물 렌즈와 250 ms의 노출 시간에 측정 된, PA GFP의 29% 형광등 수를 photoactivated 될 수 있습니다. - 매개 변수 설정된 photoactivation PA-GFP를 표현 하는 15-20 셀 이미지-체리와 GFP-PA-체리, 각각.
- 관심사의 단백질은 각각 subcellular micromilieu에 PA FPs의 photoactivation 효율성을 평가 하는 것이 중요 수 때문에 pH, 반응 산소 종 및 기타 환경 요인 photoactivation 효율성 영향을 미칠 수 있습니다, 위치 해 있습니다. Fluorophore 키메라 관심사의 단백질에 결합 하 여 저자 플라즈마 막 단백질 VSVG 18와 함께 할 관심의 특정 subcellular 구획에서 photoactivation 효율성 평가 수 있습니다.
4. Photoactivation 효율의 비율 기준 강도 기반 정량화에 대 한 이미지 분석 및 알고리즘
- 이미지 분석 플랫폼 ImageJ 또는 피지를 처리 하는 오픈 소스 이미지와 함께 할 수 있습니다. 비 페 셀 (B1) 녹색과 빨강 (B2) 채널에에서 배경 형광 강도 결정 합니다. Perinuclear 또는 어떤 증가 자동 형광 표시 하지 마십시오.
- Transfected 세포에 형광 강도 확인 하려면 셀 시체 자유형 선택 도구를 설명 합니다. 다시, perinuclear 또는 어떤 다른 자동 형광 표시 하지 마십시오.
- 각 채널에 측정 된 형광 강도에서 배경 빼기.
나G 나Green_measured -B1 =
내가연구 내가Red_measured -B2 를 = - GFP를 사용 하 여-빨강-녹색 비율 (RtoGr)와 기증자-형광 공명 에너지 전달 (무서 워) 때문에 냉각에 대 한 수정 벚꽃 구문. 무서 워 효율 E는 GFP에 대 한 이전 실험에서 0.3을 결정 했다-벚꽃 구문 두 fluorophores18사이 동일한 아미노산 링커를 사용 하 여.
RtoGr = (나Red_measured -B2) / (나Green_measured -B1)
RtoGr코어 RtoGr = * (1-E)
참고:이 강도-기반 접근, 냉각 하는 mEGFP 및 PA-mGFP에 대 한 기증자 수 있습니다 주어진 가능한 독특한 스펙트럼 속성 특징 되지. 무서 워 (kET)의 속도 Foerster 거리 (R0) mEGFP 및 PA-mGFP 결정 되지 않은 기증자의 양자 수율에 따라 달라 집니다. - GFP를 사용 하 여-photoactivated PA-체리의 분수를 평가 하기 위해 PA-체리 구문. PA-체리의 예상된 형광 강도 GFP의 측정된 unquenched 녹색 형광 강도 곱하여 결정-PA-체리 구성 이전 에 수정 된 레드--녹색-비에로 photoactivation (RtoGrcorr ).
내가Red_expected (IGreen_measured -B1) = * RtoGrcorr
참고: 위에 표시 된 대로 항상에 FP와 photoactivatable FP의 분자 밝기 달라질 수 있습니다. 이러한 차이 대 한 계정 하는 방법에 대 한 자세한 토론을 참조 하십시오. - PA-체리 photoactivation 효율성 측정된 빨간색 형광 강도 후 photoactivation 및 예상된 형광 강도 빨강 채널에의 한 분수를 계산 합니다.
(FPA-체리) = (나Red_measured -B2) / 나Red_expected - PA-GFP를 사용 하 여 — photoactivated PA-GFP의 분수를 평가 하기 위해 벚꽃 구문. PA-GFP의 측정 된 빨간 형광 강도 나누어 PA GFP의 예상된 형광 강도 결정-체리 레드-에-녹색-비율 (RtoGr)에 의해 이전 에 photoactivation 구성. 여기는 RtoGr GFP와 PA GFP 냉각 하는 동일한 금액을 기증 받습니다 때문에 냉각 하 고, 기증자에 대 한 수정 될 필요가 없습니다.
내가Green_expected = (나Red_measured -B2) / RtoGr - PA GFP photoactivation 효율성 측정된 녹색 형광 강도 후 photoactivation 및 녹색 채널에 예상된 형광 강도의 한 분수를 계산 합니다.
(FPA-GFP) = (나Green_measured -B1) / 나Green_expected
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Representative Results
여기에 제시 된 프로토콜 표시 photoactivated 형광 수은 형광 단백질의 분수의 비율 정량화 (그림 1). 이 분수는 photoactivation의 모드에 따라 다릅니다.
Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 짧은 시간 고 전력 photoactivation를 사용 하 여 일반적인 결과 그림 2 c에 표시 됩니다. 픽셀에 의해 대물 렌즈에서 측정 된 레이저 힘 titrating 후 연연 시간 및 ATOF 전송, 최대 photoactivation 효율 PA GFP가 약 8%와 PA-체리에 대 한 약 16%. PA GFP와 PA-체리의 comparably 낮은 photoactivation 효율성 동시 photoactivation 및-CLSM에 의해 광자의 지속적인 결정적 흐름에 노출 되 면 파괴에 의해 설명 될 수 있습니다. 짧은 형광 수명 및 빨강의, 오른쪽 이동 다른 흡수 스펙트럼 PA FPs의 PA-체리 PA GFP에 비해 더 높은 photoactivation 효율성에 기여할 수 있습니다.
낮은 레이저 파워 및 반복의 수백을 사용 하 여, 더 높은 photoactivation 효율성을 얻을 수 있습니다. 자외선 총 4 분의는 CLSM에 의해 전달의 450 반복 PA-GFP (그림 3c)에 대 한 29%의 photoactivation 효율을 얻지 못했다. 자외선 광자에 반복 노출으로 높은 photoactivation 효율성 다단계 photoactivation 과정을 제안할 수 있습니다. 또한 적용 된 자외선은 photoactivate 하지만 충분 하지 photodestruct photoactivated 형광 단백질의 더 높은 부분을 시간이 지남에 따라 누적 리드를 충분히 강한.
Widefield 조명에 fluorophores 확률론 및 반복 노출 됩니다 405 nm 광자. 여기,만 250 ms에 대 한 노출을 PA GFP에 대 한 29 %photoactivation 효율을 얻지 못했다.
그림 1: photoactivation 효율성 대량 및 라이브 셀을 확인 하는 방법의 개념. 괴기 하 게 고유한 형광 단백질, 커플링으로 내부 통치자 photoactivation 효율성 비율 기준 강도 기반 평가 대 한 허용 하는 만들어집니다. PA-체리와 PA GFP의 측정된 농도 예상된 농도 관련 되었다. 예상된 농도 항상에 형광 단백질 GFP 체리, GFP-PA-체리 또는 photoactivation 전에 PA-GFP-체리 키메라의 형광 강도 결정 하는에서 파생 되었다. 그림에서 렌즈 및 Wunder 201717수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: PA-GFP-체리 (a)의 photoactivation 그리고 GFP-PA-체리 (b)으로 즉시 그리고 완전히 가능한 라이브 셀에 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 대량. PA-GFP 표현의 8% photoactivated 2 μ s의 픽셀 거 시간 및 90 μW의 레이저 전원 목표 렌즈 및 3 반복 (c)에서 측정 된 결과 38%의 AOTF 전송 했다. 405 nm 레이저 파워 증가 photoactivation 효율성을 증가 하지 않았다. 그림에서 렌즈 및 Wunder 201717수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: confocal 레이저 스캐닝 현미경 (a)와 짧은 고 전력 widefield 조명 (b) 수확량 더 높은 photoactivation 효율성 반복 저전력 photoactivation. PA GFP의 29 %2 μ s의 픽셀 망설임 시간 및 40 μW의 레이저 파워 대물 렌즈 및 450 반복 (c)에서 측정 된 결과 6%의 AOTF 전송 photoactivated 했다. 그림에서 렌즈 및 Wunder 201717수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
지금까지, 방법은 없습니다 대량에서 PA-FPs의 라이브 셀에서 표현 photoactivated 형광 하는 분수 결정에 존재. 어떤 괴기 하 게 고유한 형광 단백질 쌍 제시 프로토콜을 사용할 수 있습니다. PA FPs PA-GFP와 PA-체리는 돌이킬 수 없는 대 한 여기 exemplified, 동안이 방식은 원칙적으로 뿐만 아니라 photoconvertible 단백질에 적용 합니다. 그러나 괴기 하 게 고유한 형광 단백질,, 선택 되어야 합니다 신중 하 게 photoconvertible 형광 단백질 이동 그들의 흡수도 및 방출 스펙트럼, 예를 들면 녹색에서 빨간색 형광을 그 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해.
위에서 설명한 대로 제시 접근 비율입니다 상태로 중요 하 고 강도 기반입니다. 그것은 photoactivation의 다른 모드 셀에 알 수 없는 표현 레벨을 표준화 하 고 photoactivation 효율성에서 상대적인 차이 정의를 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 photoactivated PA FPs의 절대 부분을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 다음, 다른 FPs의 다른 스펙트럼 속성 고려 될 필요가 있다.
분자 밝기 (MB) 양자 수율 (QY), 소멸 계수 (EC)와 흡 광도 피크를 기준으로 주어진된 여기 파장에서 백분율 흡 광도의 제품 이다. 체리12 및 PA-체리13, QY와 EC의 각각 값 출판 되었습니다. 흡 광도 피크에 543 nm 친척의 주어진된 여기 파장에서 흡수 하는 백분율도 각각 0.5와 0.7 이다.
MB체리 = 0.22 * 72000 * 0.5 = 7,920
MBPA-체리 = 0.46 * 18000 * 0.7 = 5,796
따라서, 펜 실바 니 아-체리 체리에 비해 낮은 분자 밝기 반입할 수 있습니다 계정에 내가 나누어Red_expected 1.37 (7,920/5,796에서 파생 된)에 의해.
그러나, PA-체리의 게시 된 분자 밝기를 결정 하는 photoactivation 조건 하에서 불명 하다. 이것은 우리가 여기에 photoactivation의 모드 photoactivated PA FPs의 측정된 분수 변경 표시 때문에 중요 한. 또한, 단위체 버전 A206K 돌연변이 수록 되어 있음. 즉, mEGFP 및 PA-mEGFP, 아무 분자 밝기 게시 되었습니다.
이 비율 기준 강도 기반 접근 방식에서 PA-FPs의 분자 밝기 및 첫번째 근사에서 항상에 FP 대응 있다 간주 되었습니다 동일. 우리는이 접근에 결정 이후 일부 FPs (i)에 대 한 아무 분자 밝기 보고 되었습니다, 그리고 (ii) 그것은 지금까지 방법에 명확한까지 photoactivation의 다른 모드 수 있습니다 영향을 문학에서 보고 된 PA FPs의 분자 밝기. 또한, (iii) 분자 밝기의 지식을 비교 분석은 필수이; 그것만 photoactivated 위와 같이 계산할 수 있다 PA-FPs의 절대 분수의 강도 기반 결정 필요 합니다.
내부 통치자로 서 형광 단백질 키메라를 포함 하는 우리의 접근 방법-자외선에 다른 노출 다른 photoactivation 효율성 수익률 보여줍니다. 따라서, 그것은 photoactivate 더 큰 파 FP 분수 하는 방법으로 옵션을 정의 하 고 더 나은 신호 대 잡음 비율을 달성. 또한, 기회 차동 photoactivate 열어 그것을 노출 하 여 UV 빛 또는 차동 photoactivate 다른 subcellular 구획에 동일한 PA FP 차동 그들의 응답을 주어진 동일한 셀에서 다른 PA-FPs UV-빛을 다르게. 요약 하면, 우리의 프로토콜 라이브 셀 현미경에 PA-프레임을 사용 하 여 셀룰러 프로세스의 정량적 이해를 더 도울 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는이 프로젝트에 대 한 장비와 공간을 제공 하기 위한 Dorigo 실험실 그리고 스탠포드 대학의과 대학에서 신경 과학 이미징 서비스를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
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