Summary
Ici, nous présentons un protocole visant à implanter des cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de manière simple, façon invasive et facile à manipuler, moins et ce modèle murin orthotopique breast cancer avec un environnement approprié coussinets adipeux mammaire peut être utilisé pour étudier divers aspects de la cancer.
Abstract
Un modèle animal approprié est essentiel pour une meilleure compréhension des maladies. Animaux modèles établis par différentes méthodes (injections sous-cutanées, xénogreffes, manipulation génétique, induction de réactifs chimiques, etc.) ont des caractères pathologiques diverses et jouent un rôle important dans l’enquête sur certains aspects du maladies. Bien qu’aucun modèle ne peut imiter totalement la progression de la maladie humaine entière, modèles de maladies orthotopique organes avec un bon environnement stromal jouent un rôle irremplaçable dans la compréhension des maladies et de dépistage de médicaments potentiels. Dans cet article, nous décrivons comment implanter des cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de manière simple, de manière moins invasive et facile à manipuler et suivez la métastase à des organes éloignés. Avec les fonctionnalités appropriées de croissance de la tumeur primitive, du sein et des changements pathologiques de mamelon et une fréquence élevée de métastases des autres organes, ce modèle maximumly imite la progression du cancer du sein humain. Tumeur primitive croissance in situ, métastases à longue-distance et le microenvironnement tumoral du cancer du sein peuvent être étudiées à l’aide de ce modèle.
Introduction
Le cancer est la principale cause de mortalité féminine dans le monde entier. Avec son incidence augmentant progressivement, le cancer du sein est devenu un défi sérieux pour la santé publique1. Modèles murins de cancer sont de bonnes passerelles entre les études précliniques et cliniques, et un modèle de bonne maladie murine mimic va augmenter la précision de la recherche sur la maladie et la médecine.
Croissance de la tumeur primaire commence la progression de la maladie maligne, tandis que les métastases et les complications sont les principales causes de décès et les qualités de vie pauvre dans la plupart des patients de cancer. Plusieurs modèles murins sont utilisées pour imiter la pathologie du sein cancer2,3,4. Des modèles de xénogreffes sont largement utilisés pour l’étude sur le cancer comprendre les caractères pathologiques et à des médicaments de l’écran pour la sécurité et l’efficacité de6,5,7. Des souris génétiquement modifiées (GEM) sont générés pour imiter le cancer du sein humain en ciblant certains oncogènes ou tumeur de gènes suppresseurs8. GEM ont un fond relativement simple et uniforme, de comprendre le rôle des gènes en cours cancéreuses ; Toutefois, le milieu artificiel et l’arrière-plan sont limitées pour enquêter sur la pathologie de la métastase et associés à des thérapies9. Les cellules cancéreuses humaines, mais avec des caractéristiques pathologiques humains, peuvent seulement être implantés chez des souris immunodéficientes, et l’insuffisance de l’interaction immunitaire de tumeur-hôte peut conduire à des résultats biaisés10.
Où la tumeur solide initie a une influence directe sur les caractères biologiques et pathologiques de la maladie de12,11,13. Cancéreuses progrès étant le résultat complexe d’interactions entre les cellules tumorales, les cellules du stroma, cellules d’immunologie, des cellules inflammatoires, facteurs de croissance et des protéases, tumeurs primaires implantés in situ sera donner meilleure idée et imiter les processus cancéreux ont plus de précision que les tumeurs induites par des agents chimiques ou une injection sous-cutanée de tumeur cellules. Agents chimiques utilisés pour induire des tumeurs peuvent être nocives pour l’environnement et des chercheurs et sont même interdits dans certains pays. En raison de l’absence d’un environnement de coussinets adipeux mammaire, la progression pathologique d’une injection sous-cutanée peut-être différer avec que dans le véritable cancer, dont le cancer est originaire et irrite depuis les coussinets adipeux mammaire. Les inconvénients des injections sous-cutanées encouragent l’utilisation de modèles orthotopiques pour étudier la croissance tumorale. Dans des recherches antérieures, fortement métastatiques tumeurs MDA-MB-231, mis au point après la transplantation orthotopique sept, a indiqué l’importance de l’injection emplacement14. Récemment, l’implantation orthotopique de cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire par la chirurgie a été signalée15,16. Avec l’environnement pad mammaires, la croissance de la tumeur et la migration vers des organes éloignés de la couverture de l’ensemble du processus du cancer du sein sur sites pathologiquement concernés, qui en fait modèle miniature de la progression des maladies humaines. Cependant, après la chirurgie, la peau se tente automatiquement de se guérir lui-même, qui peut apporter le risque potentiel de porter atteinte à l’origine du cancer du sein normal et biaiser les résultats.
Nous avons comparé à certains modèles de cancer du sein et établi un modèle orthotopique minimalement invasive pour étudier l’effet potentiel des médicaments breast cancer progression17,18. Dans cette étude, un protocole vidéo sur la façon d’orthotopically injecter des cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de manière simple, manière moins invasive est présenté. Cette méthode d’injection orthotopique sans chirurgie est avantageuse à bien des égards. Tout d’abord, l’opération est simple et rapide, environ 1 minute de chaque souris. En second lieu, avec des foyers de tumeur primitive à partir des droite pathologiques sites, elle couvre le processus tumorigène ensemble de la progression du cancer du sein de la croissance de la tumeur à autres métastases d’organes, qui fournit un bon modèle animal expérimental pour l’étude de la interaction des cellules tumorales et microenvironnement tumoral. En outre, il peut être un modèle précieux pour évaluer les effets de traitement à tous les stades du cancer du sein. L’objectif de cette méthode est de fournir un modèle animal pour la progression du cancer maximumly maternel mimic.
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Protocol
Des expérimentations animales ont été effectuées conformément à la disposition et la recommandation générale de législation Administration chinoise animale expérimentale et ont été approuvées par l’Institution de la protection des animaux et l’utilisation Comité de médecine Université de la capitale (Ref pas. AEEI-2014-052). On a utilisé des souris Balb/c femelles âgés de 6 à 8 semaines.
1. préparation des cellules et des animaux
- Un jour avant l’opération, se raser les poils autour des mamelons quatrième pour exposer la zone de fonctionnement.
- Utilisez une main pour bien tenir la souris vers le haut pour s’assurer que la souris ne pas se déplacer librement, vous présentez à la souris pour exposer son ventre à l’opérateur et ensuite utiliser une autre main pour raser la fourrure autour des mamelons quatrième avec un rasoir électronique.
- Mettez une fine couche de l’épilation à la crème autour des mamelons pendant 30-60 s, nettoyer la crème avec de l’eau distillée et ensuite sécher la souris avec papier doux.
- Le jour de l’opération, recueillir des cellules cancéreuses murin (4 t 1-luc2), compter le nombre de cellules et ajuster la densité des cellules à 2 x 105 cellules/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans des tubes de microcentrifuge stérile et les conserver sur la glace. Pour chaque souris, 1 x 104 cellules/50 µL dans une seringue de 1 mL est prête.
2. orthotopique Injection
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Anesthésie des souris
- Induire l’anesthésie. Mettre les souris dans un récipient transparent fermé et allumez automne et 2 % isoflurane gaz à anesthésier les souris pendant environ 5 min, jusqu'à ce qu’ils sont tous couchent endormi.
- Maintenir l’anesthésie. Transférer les souris du conteneur aux masques d’anesthésie individuelles, mettre une pommade vétérinaire sur leurs yeux pour éviter la sécheresse, maintenez les souris passivement avec leurs seins exposés à l’opérateur et qu’ils continuent à inhaler gaz isoflurane pendant quelques minutes jusqu'à ce que le injection a été réalisée.
- Confirmer le succès de l’anesthésie par l’absence d’un réflexe de retrait orteil pincée.
- Appliquer la pommade ophtalmique aux yeux des souris pour prévenir le dessèchement de le œil.
Remarque : Selon la taille du conteneur et le nombre de masques d’anesthésie individuelles disponibles, un groupe de souris peut être anesthésié ensemble et injecté un sous anesthésie individuel.
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Performance de l’injection
- Utiliser la tente la peau d’une main autour du mamelon quatrième avec des pincettes, de mettre en place un « tunnel » soulevé pour la seringue à suivre. Utilisez l’autre main pour tenir la seringue avec l’aiguille tournée vers le haut pour entrer dans la peau par voie sous-cutanée à 5-10 mm de mamelon ; Ensuite, suivez le « tunnel » jusqu'à ce que la pointe de l’aiguille se rapproche du mamelon, déplacer délicatement l’aiguille pointe vers le haut dans les coussinets adipeux mammaire jusqu'à ce que le chas de l’aiguille sous la pointe du mamelon, jetez la pince à épiler et injecter les cellules lentement.
- Tournez autour de l’aiguille un peu et rentrer la seringue lentement ; Utilisez un coton-tige pour enfoncer l’aiguille enroulée pour 10-20 s pour s’assurer il n’y a aucune infiltration de liquide.
- Observer le quatrième mamelon pour confirmer une injection réussie : une sphère blanche de plate transparente avec le mamelon que le centre peut être observée (Figure 1).
- Gardez les souris anesthésiés pour une minute pour éviter de laisser les souris récupérer et se déplacent trop rapidement, qui provoquera l’injection enroulée pour ouvrir et les cellules tumorales à écouler.
3. analyse de la croissance tumorale et les métastases
Remarque : Les tumeurs primaires sont identifiés transparents ou boursouflure comme bosses après injections, ainsi que des morceaux solides sphériques ou ellipsoïdes avec le mamelon quelques jours plus tard. La croissance tumorale est évaluée par le volume de la tumeur et de la bioluminescence de la tumeur.
- Pour établir le volume de la tumeur, maintenez la souris d’une main. Exposer son ventre à l’opérateur et utilisez l’autre main pour étrier de la longueur (L) de la tumeur et la largeur (W). Calculer le volume de la tumeur (V) comme suit.
V = (L x W2) / 2 - Pour capturer la bioluminescence de la tumeur, injecter D-luciférine de 150 mg/kg à l’arrière du cou de la souris, 10 min avant l’imagerie. Anesthésier les souris au gaz isoflurane 2 % pendant 5 min et de les transférer aux masques d’anesthésie individuels pour les laisser respirer des gaz isoflurane pendant plus de 5 min. Suivant les instructions du fabricant, capturer des images de la bioluminescence de la tumeur primitive et les métastases, avec temps d’exposition automatique, moyen binning et f/stop à 1.
4. la cueillette de la tumeur primitive et les métastases organes pour l’analyse
Remarque : Lorsque l’atteinte du but de cette expérience, ou d’atteindre le point de terminaison sans cruauté, la tumeur primitive peut être récoltée pour complément d’étude. Dans cette étude, les tumeurs sont enlevées à 4 à 5 semaines après l’injection, lorsque le volume de la tumeur atteint environ 800 mm3. Les poumons sont enlevées à la semaine 8.
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Récolte de la tumeur primitive
- Effectuer la chirurgie sous une hotte stérile de maintenir une atmosphère stérile. Anesthésier les animaux par isoflurane. Confirmer le succès de l’anesthésie par l’absence de réflexes de retrait orteil pincée. Appliquer la pommade ophtalmique aux yeux des souris pour les empêcher de se dessécher.
- Dissocier la tumeur de la peau avec des ciseaux, goutte à goutte painkiller (1 mg/mL, tramadol, 1 goutte d’environ 50 µL par souris) pour soulager la douleur postopératoire.
- Piquer la peau avec une suture chirurgicale, couper les excès suture, drapé au large de l’incision.
- Couper la tumeur primitive en deux avec un scalpel, mettre 1/2 de la tumeur en paraformaldéhyde 4 % supplémentaire l’hématoxyline et éosine (H & E) souillant et immunohistochimie et geler immédiatement l’autre 1/2 avec l’azote liquide pour éponger occidental ou d’un ARN étude de l’isolement par la suite.
- Après suture, chauffer les souris avec une lampe jusqu'à ce qu’ils récupèrent, garder les souris en cage unique jusqu'à ce que complètement guéri. En permanence, administrer 10 mg/kg tramadol avec un gavage oral pendant 3 jours après la chirurgie.
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Récolte d’organes métastases
- Euthanasier les souris avec une surdose de pentobarbital, ouvrir leurs coffres avec des ciseaux, doucement sortir les poumons et les laver avec du PBS. Foyers de métastases pulmonaires peuvent être identifiés comme blanc transparent bosses qui sont morphologiquement différentes et distinguer des tissus pulmonaires rose normal.
- Mettre les poumons en paraformaldéhyde à 4 % pour vérifier la métastase de la coloration H & E.
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Representative Results
Après une injection réussie, une sphère blanche de plate transparente avec le mamelon comme l’out-surface ronde centre peut être observé (Figure 1). Croissance de la tumeur primaire peut être mesurée par le volume des tumeurs et les tumeurs de la vie cellulaire bioluminescence (Figure 2). Fois le volume de la tumeur et le flux total a augmenté au cours de l’expérience avant la résection. À un stade précoce, métastase est introuvable car aucune tumeur secondaire n’est arrivé ou les signaux forts bioluminescentes de la tumeur primitive entravent la détection des foyers de petites métastases avec les signaux faibles. Après la résection, le signal bioluminescent provenant des foyers métastatiques des organes éloignés peut être détecté et analysé. La morphologie de la tumeur mammaire primaire et les sections du poumon ont été étudiés avec une coloration H & E, tandis que l’angiogenèse a été étudiée par la coloration de la tumeur avec marqueur de navire CD31 de densité des microvaisseaux (MVD) (Figure 3).
Figure 1 : photos avant et après l’injection orthotopique aux coussinets adipeux mammaire de souris femelles Balb/c. L’opération a été effectuée, et les photos ont été prises alors que les souris étaient sous anesthésie isoflurane. A, avant l’injection, B, après injection de.
Figure 2 : Volume et le flux total de la tumeur primitive ont été mesurées de 7 jours après l’implantation. L’implantation de suspension cellulaire généré une tumeur primaire accrue tant en volume, ce qui a été visualisée et déterminée à l’aide d’étriers, en flux total, qui a été mesuré par le système du spectre. La figure montre les images bioluminescentes de tumeurs primaires et métastase observée à divers moments après le 7e jour de l’implantation. p/s = photons/seconde. Ce chiffre a été modifié par Zhang et al. 17. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : la coloration H & E et immunohistochemical souillant analyse des tumeurs primaires et des métastases pulmonaires. Tissus ont été fixés à 4 % de paraformaldéhyde, incorporés à la paraffine et teintés. (A et B) Sections ont été colorées à l’hématoxyline et éosine (H & E). (C et D) Sections ont été colorées avec de l’anticorps antiCD31. Coloration brunâtre, a indiqué CD31 + vaisseaux. Panneaux A et C actuel tissu de tumeur primitive, panneaux B et D présentent des métastases pulmonaires. CD = cluster de différenciation. Le grossissement utilisé = 200 X. La barre d’échelle = 50 µm. Ce chiffre a été modifié par Zhang et al. 17. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les cellules utilisées dans cette étude sont 4 t 1-luc2, murin triple négatif cellules cancéreuses avec luciférase d’étiquetage, qui constituent un outil utile pour investir les effets antitumoraux et antimétastatique des médicaments en raison de leur caractère très invasif2,19 . Luciférases, stables à la prochaine génération de cellule, sont utilisés pour indiquer la tumeur de la vie des cellules, à la glande mammaire, ainsi que chez les autres organes éloignés de20. Dans certains cas, l’hypoxie et carences nutritionnelles dans le résultat de la tumeur dans une diminution du signal de bioluminescent et le volume de la tumeur primitive n’est pas incompatible avec le signal de bioluminescent à un stade ultérieur de la progression tumorale. La technique de l’injection de l’orthotopic cellulaire (COI) de suspensions cellulaires peut également être effectuée avec autres poitrine lignées cellulaires cancéreuses, comme les humains cellules MDA-MB-231 (données non publiées). Dans cette étude, avec la glande mammaire comme son environnement, c’est un bon modèle animal pour étudier le microenvironnement tumoral, traversant parler entre cellules tumorales et des cellules stromales. Au cours de la progression de la tumeur, chez certaines souris, le mamelon peut s’ulcérer, Gale, grandir rouge tissu de granulation, aplatir ou même disparaître, similaire à ce qui se passe dans les mamelons humaines lors de cancer du sein. Souris peuvent éprouver un certain malaise à ulcérations ; tous les soins doivent être prises. Plus de changement mamelon a été trouvé chez la souris à l’aide de cette technique COI qu’avec la technique de chirurgie micro-invasive. L’implantation chirurgicale orthotopique (SOI) de tissus intacts sur le plan histologique de tumeur humaine, par rapport à l’injection de l’orthotopic cellulaire (COI) de suspensions cellulaires, montre plus malignes dans la vessie, poumon, estomac, des reins et du côlon21 imiter ce que l'on voit dans les patients22.
Avec une incidence élevée de métastases, en particulier pulmonaires, le modèle murine breast cancer dans cette étude est un modèle de cancer syngénique bon pour explorer les migrations spontanées et l’invasion, par rapport à un modèle de métastases artificiels, tels qu’un injection dans la veine queue. Les activités des cellules tumorales et les personnages jouent un rôle important dans les métastases. Autres lignées cellulaires, comme cellule de cancer du sein MCF-7, même implanté par une injection orthotopique les coussinets adipeux mammaire de souris Balb/c d’immunodéficientes, ont une plus faible capacité métastatique. Avec la modification de cellules ou de souris, tels que la surexpression ou bas-expression d’un gène donné, cette technologie peut être appliquée dans plusieurs domaines de recherche.
L’opération cruciale de cette injection doit soigneusement et lentement remonter la pointe de l’aiguille, de sous-cutanée dans les coussinets adipeux mammaire. Lorsque l’embout de la seringue se rapproche de la tétine, l’opérateur vous sentirez insistance du tissu. La glande de souris étant très petite, seulement un peu plus de pression est nécessaire pour laisser l’embout de la seringue à passer à travers l’insistance. Trop de pression se traduira par la pointe en passant par la glande et la rupture de la peau, ce qui mène à une défaillance de l’injection. Les cellules en phase logarithmique, une suspension de cellules individuelles, le protocole opératoire normalisée (SOP) et des opérateurs qualifiés sont tous tenus de réduire les variations chez les souris. Comportement des cellules tumorales est important pour la formation et le répétable des modèles de la tumeur. Récolter les cellules en phase logarithmique quand ils grandissent d’environ 80-90 % confluent ; la densité des cellules trop basse ou trop élevée interfèrent avec le modèle de tumeur et entraîner des variations entre les expériences. La suspension de cellules individuelles est également importante, puisque des touffes de cellule résultat dans les erreurs de calcul du nombre de cellules. La trypsine, une solution d’EDTA ou d’autres méthodes appropriées sont choisies pour détacher les cellules selon les objectifs de l’expérience et les objectifs, le chercheur est intéressé. Dépend de la densité d’échelle et de la cellule de seringue, le volume d’injection pourrait varier de 25 à 100 µL. Le montant de 1 x 104 à 1 x 106 cellules est couramment utilisé pour irriter la croissance tumorale selon différents types de cellules. Coloration bleu trypan est utilisée pour distinguer les cellules viables de morts. Plus de la viabilité cellulaire de 95 % est considéré comme une bonne situation pour induire une tumeur rapide croissance et métastase in vivo. Elles conviennent également pour d’autres modèles de la tumeur lors de la préparation des cellules tumorales. Pour correctement la taille de la tumeur primaire d’étrier et obtenir un signal de bioluminescent précis, la fourrure autour du mamelon doit être retirée à nouveau une fois qu’elle repousse. Lorsque la tumeur primaire se développe à une grande masse et son signal de bioluminescence est trop fort pour les chercheurs d’observer les autres métastases organe (par exemple, métastases pulmonaires), couvrez-la avec du ruban isolant noir avant de bioluminescence images sont prises, ou retirez-le par chirurgie. Un antalgique peut être utilisé pour la douleur post-opératoire.
L’inoculation réussie peut entraîner des métastases pulmonaires : avec un taux d’occurrence de plus de 90 %, des foyers métastatiques au seins non injectés, les os ou les ganglions lymphatiques sont assez communes, alors que la maladie coeliaque métastase est rare. Les tumeurs secondaires sont une masse translucide et se distinguent par les tissus normaux environnants. Une demande imprécise de l’injection peut conduire à des erreurs expérimentales dans des endroits de taille et de forme et de métastases tumorales. Toute fuite de la sphère plate après que l’injection va réduire la taille de la tumeur, toute fuite de la glande mammaire dans le « tunnel » se traduira par une tumeur long cylindrique qui entravera la détermination du volume tumoral lorsque nous utilisons un pied à coulisse numérique à la mesurer. Injections sous-cutanées autour les coussinets adipeux mammaire rarement mener à métastases pulmonaires et ne conviennent pas pour l’étude de métastases associées aux lointain. Pour rendre l’inoculation stable et réduire le risque de fuite, Matrigel peut être utilisé lorsque la suspension de cellules tumorales. Cependant, Matrigel n’est pas un solvant unique, il est considéré comme une sorte de matrice extracellulaire (ECM) et certains types de gel contiennent même des facteurs qui peuvent interférer avec les expériences. Dans une expérience visant à microenvironnement tumoral, ECM, traversant parler entre cellules tumorales ou avec des cellules stromales, il est préférable d’éviter d’utiliser le Matrigel. Pour les cellules injectées avec la luciférase tag D-luciférine, le substrat de la luciférase est injecté pour lier la vie chez les souris, les cellules tumorales. Dans cette étude, la dynamique de la bioluminescence in vivo suggère qu’à 10 minutes après l’injection de D-luciférine, le signal de bioluminescent atteindre le sommet et peut être stable pendant environ 10-15 minutes (variant entre différentes souris), savoir si avec un une injection intrapéritonéale ou une injection sous-cutanée. Considérant que le médicament testé est injecté par voie intrapéritonéale, pour éviter l’interaction du médicament testé avec D-luciférine et réduire l’irritation péritonéale, suggère une injection sous-cutanée.
En conclusion, l’injection d’orthotopique de cellules mammaires cancéreuses décrites dans le présent document est un outil puissant et très utile dans l’étude de la pathologie et la progression du cancer du sein. Il est facile à manipuler et peut être effectuée rapidement. La tumeur primitive prend sa source à la glande mammaire avec une fréquence élevée de métastases, qui maximumly imite le processus physiopathologique du carcinome du sein humain.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention No 81873111, 81673924, 81774039, 81503517), la Fondation des sciences naturelles de Pékin (subvention No 7172095, 7162084, 7162083) et la Xu Xia fondation de l’hôpital de Beijing de La médecine traditionnelle chinoise (subvention no, xx201701). Nous remercions le professeur Chang-Zhen Liu, du centre de recherche expérimental, China Academy of Sciences médicales chinoises, pour images bioluminescents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anesthesia machine | Midmark Corporation, Dayton, OH, USA | Matrx VMS | anesthesia |
| In-Vivo Imaging System | PerkinElmer | IVIS Spectrum | used for bioluminescence detecion |
| isoflurane | Hebei yipin chemical reagents company | O21400 | anesthesia |
| 1 ml syringe | Becton,Dickinson and Company | A257 | cell injection |
| digital caliper | Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd. | S-H | volume measurement |
| tramadol | Mundipharma company | - | pain killer |
| D-luciferin | Gold Biotechnology Inc. | LUCK-1G | used for bioluminescence detecion |
| The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31 | Abcam | ab28364 | used for MVD detection |
| hematoxylin and eosin staining kit | Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9615 | histology |
| hair removal cream | Veet | - | hair removal cream |
| Carbomer Eye Gel | Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH | - | ophthalmic ointment |
| sewing needle | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 17U0302J | suture |
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