मेटास्टेटिक कोलोरेक्टल कैंसर के साथ रोगियों में एक परिसंचारी microrna कस्टम पैनल का पता लगाने
Summary
हम कैंसर रोगियों से प्लाज्मा नमूनों में माइक्रोना (mirnas) परिसंचारी के अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । विशेष रूप से, हम mirna निष्कर्षण और रिवर्स transcription परिचालित के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का इस्तेमाल किया । अंत में, हम वास्तविक समय पूर्व देखा जांच कस्टम प्लेटों का उपयोग कर 24 चयनित mirnas के एक पैनल का विश्लेषण किया ।
Abstract
नैदानिक अभ्यास के लिए विश्वसनीय और उपयोगी बायोमार्कर की आवश्यकता पैदा करने, कैंसर निदान, रोग का निदान और चिकित्सीय निगरानी के लिए तरल बायोप्सी में रुचि बढ़ रही है । यहाँ, हम निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, रिवर्स ट्रांसक्राइब और कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) के साथ रोगियों के प्लाज्मा नमूनों से mirnas परिसंचारी के अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन. micrornas (mirnas) गैर की एक कक्षा हैं-कोडिंग rnas की लंबाई में 18-25 न्यूक्लियोटाइड की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए लक्ष्य जीन शोधों स्तर पर और एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, सहित कि समर्थक और विरोधी एंजियोजेनिक समारोह के फिजियोथोलॉजी में विभिन्न अंगों । mirnas इस तरह के सीरम और प्लाज्मा के रूप में जैविक तरल पदार्थ में स्थिर हैं, जो उन्हें कैंसर निदान, रोग का निदान और उपचार निर्णय लेने और निगरानी के लिए आदर्श परिचालित बायोमार्कर renders. मिरना निष्कर्षण परिचालित एक तेजी से और प्रभावी तरीका है कि दोनों कार्बनिक और कॉलम-आधारित तरीके शामिल है का उपयोग किया गया । mirna retrotranscription के लिए, हम एक बहु कदम प्रक्रिया है कि 3 पर polyadenylation समझता है ‘ और परिपक्व mirna के 5 ‘ पर एक एडाप्टर के बंधाव, यादृच्छिक mirna पूर्व प्रवर्धन द्वारा पीछा किया । हम एक 24 mirna कस्टम पैनल का चयन करने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qrt-पीसीआर) द्वारा परीक्षण किया और सरणी कस्टम प्लेटों पर mirna जांच देखा । हमने qrt-पीसीआर प्लेट का प्रदर्शन रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम पर चलता है । मानक के लिए हाउसकीपिंग mirnas का उपयोग कर genorm सॉफ्टवेयर (v. ३.२) का चयन किया गया । डेटा अभिव्यक्ति सुइट सॉफ्टवेयर (v १.१) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया । विधि विश्वसनीय और तकनीकी रूप से मजबूत साबित हुई और प्लाज्मा और/या सीरम जैसे तरल नमूनों में बायोमार्कर के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
Introduction
CRC तीसरी सबसे अक्सर निदान द्रोह और कैंसर से संबंधित मौत का चौथा कारण दुनिया भर में प्रतिनिधित्व करता है । तिथि करने के लिए, bevacizumab (बी), एक मोनोक्लोनल संवहनी-endothelial वृद्धि कारक (vegf) के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी, और सीटुक्जीमैब (सी) या panitumumab (पी), मोनोक्लोनल एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (egfr) के खिलाफ निर्देश एंटीबॉडी, के लिए अनुमोदित कीमोथेरेपी (सीटी) regimens के साथ संयोजन में पहली पंक्ति उपचार ।
K-ras और N-ras जीन में परिवर्तन केवल नैदानिक रूप से उपयोगी बायोमार्कर हैं, जो उन रोगियों की पहचान करने में सक्षम हैं, जिन्हें एंटी-ईजीएफआर-आधारित सीटी से कम लाभ होने की संभावना है । हालांकि कई अध्ययनों के लिए बायोमार्कर कि बी के जवाब की भविष्यवाणी कर रहे है के लिए खोज आयोजित किया गया है सीटी आधारित है, वहां अभी भी नैदानिक अभ्यास1में उपयोग के लिए विश्वसनीय और प्रभावी दवाओं की एक पर्याप्त कमी है ।
mirnas छोटे rnas (लंबाई में 18-25 ंयूक्लियोटाइड) कर रहे है कि लक्ष्य जीन के अनुवाद को विनियमित और कई फिजियोथोलॉजिकल प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, भ्रूणविज्ञान और कैंसरजनन सहित । ये अणु प्लाज्मा/सीरम, मूत्र और थूक जैसे जैविक तरल पदार्थों में अत्यधिक स्थिर होते हैं, जो गैर-इनवेसिव नमूनाकरण2के लिए उपयोग करने के लिए मजबूत बायोमार्कर को रेंडर करते हैं । एंजियोजेनिक मार्ग में शामिल mirnas के एक पैनल का उपयोग करना, हम एक बी आधारित सीटी आहार के साथ इलाज मेटास्टेटिक सीआरसी (mcrc) के साथ रोगियों में नैदानिक परिणाम की भविष्यवाणी करने में सक्षम नए घूम बायोमार्कर की पहचान करने के उद्देश्य से.
हम की एक श्रृंखला का विश्लेषण ५२ mcrc रोगियों के भीतर बी आधारित सीटी के साथ इलाज किया भावी multicenter यादृच्छिक चरण III परीक्षण “इतालवी परीक्षण उन्नत कोलोरेक्टल कैंसर में” (itaca). वर्तमान प्रोटोकॉल स्थानीय नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (comitato ईटीको क्षेत्र vasta ई इस्टिट्युटो scientifico romagnolo प्रति लो स्टूडियो ई ला cura देई तुमोरी (irst) irst, नहीं ६७४) 19वें सितंबर को २००७ । सभी मरीजों को ब्लड सैंपल कलेक्शन से पहले सूचित सहमति दे दी । प्रत्येक रोगी के लिए, शिरापरक रक्त के नमूने उपचार से पहले एकत्र किए गए थे और पहली नैदानिक मूल्यांकन (8 सप्ताह के बाद) में रोगी परिणाम के संबंध में उपचार के दौरान आधारभूत mirna अभिव्यक्ति और इसके मॉडुलन का मूल्यांकन करने के लिए ।
साहित्य की एक खोज के माध्यम से, हम 21 mirnas एंजियजेनिक प्रक्रिया है कि मानव प्लाज्मा में detectable होने के लिए जाना जाता है के साथ सहसंबद्ध का चयन किया: है-मीर-१०७, है-मीर-126-3p, है-मीर-145-5p, है-मीर-194-5p, है-मीर-199a-5p, है-मीर-200b-3p, है-मीर-20b-5p , है-मीर-21-5p, है-मीर-210-3p, है-मीर-221-3p, है-मीर-24-3p, है-मीर-27a-3p, है-मीर-29b-3p, है-मीर-335-5p, है-मीर-424-5p, है-मीर-497-5p, है-mir-520d-3p, है-मीर-92a-3p, है-mir-17-5p और है-मीर-155-5p । हम भी चुना है-मीर-223-3p और है-मीर-४८४ अंतर्जात सामान्यीकरण के लिए3,4,5,6, और cel-मीर-३९ exogenous सामान्यीकरण के लिए एक स्पाइक के रूप में सी एलिगेंस से शुद्ध. सभी डेटा normalizations का उपयोग किया गया 2 ̂ ̄ (…) विधि ।
प्रसारित mirnas का पता लगाने के कुछ तकनीकी कठिनाइयों प्रस्तुत करता है क्योंकि अणुओं प्लाज्मा में बहुत कम स्तर पर मौजूद हैं और उनके प्रवर्धन रासायनिक उनके छोटे अनुक्रम दिया चुनौतीपूर्ण है. इन कारणों के लिए, हम एक प्रक्रिया है कि phenol और एक गिलास फाइबर कॉलम आधारित कार्यप्रणाली के साथ दोनों कार्बनिक निष्कर्षण समझता है का चयन किया । प्रसारित mirna निष्कर्षण तरल बायोप्सी के क्षेत्र में एक गर्म विषय है, और हम एक वाणिज्यिक किट है कि राशि और बरामद पैदावार7,8की गुणवत्ता के मामले में सबसे विश्वसनीय में से एक होना दिखाया गया है का चयन किया । हम 5 पर एक एडाप्टर के अलावा द्वारा प्रतिलेखन mirnas रिवर्स करने के लिए एक प्रोटोकॉल का चयन ‘ और एक पाली (एक) पूंछ के लिए 3 ‘ परिपक्व mirnas की चयनात्मकता और प्रतिक्रिया की विशिष्टता बढ़ाने के लिए.
विधि की मजबूती को देखते हुए, हमने आरटी-पीसीआर के लिए पूर्व-देखा जांच के साथ कस्टम प्लेट को डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूने का आकलन करने के लिए डिजाइन किया है और प्रत्येक थाली के भीतर 2 रोगियों का विश्लेषण, जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
mirnas छोटे गैर कोडिंग कर रहे हैं rnas (लंबाई में 18-25 न्यूक्लियोटाइड) 3 ‘ अपने लक्ष्य दूत आरएनए के utr क्षेत्र बाध्यकारी और बाधा और/ वे इस प्रकार शोधों स्तर पर जीन अभिव्यक्ति नियामकों माना जा सकता है । पिछले दशक में, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को आंशिक रूप से roche स्पा और इतालवी दवाओं एजेंसी (aifa) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
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