Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático
Summary
Apresentamos um protocolo para avaliar os níveis de expressão de microRNA (miRNAs) em circulação em amostras de plasma de pacientes com câncer. Em particular, usamos um kit comercialmente disponível para circulação miRNA extração e transcrição reversa. Finalmente, analisamos um painel de 24 miRNAs selecionados usando placas personalizadas em tempo real sonda pre-manchado.
Abstract
Existe uma crescente interesse na biópsia líquida para câncer diagnóstico, prognóstico e monitorização terapêutica, criando a necessidade de biomarcadores confiáveis e úteis para a prática clínica. Aqui, apresentamos um protocolo para extrair, reverso transcrever e avaliar os níveis de expressão de miRNAs de amostras de plasma de pacientes com câncer colorretal (CRC) em circulação. microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNA não-codificante de 18-25 nucleotides no comprimento que regulam a expressão de genes-alvo a nível translacional e desempenham um papel importante, incluindo o da função de pro – e antiangiogênico, na fisiopatologia da vários órgãos. os miRNAs são estáveis em fluidos biológicos, tais como soro e plasma, que processa-los ideal circulando biomarcadores para tomada de decisão diagnóstico, prognóstico e tratamento do câncer e monitoramento. Extração de miRNA de circulação foi realizada usando um método rápido e eficaz que envolve metodologias orgânicas e baseados em colunas. Para miRNA retrotranscription, foi utilizado um processo de várias etapa que considera poliadenilação 3′ e a ligadura de um adaptador em 5′ dos miRNAs maduros, seguidos de Pre-amplificação aleatória miRNA. Selecionamos um painel personalizado 24-miRNA para ser testado por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR) e avistou as sondas de miRNA em placas personalizadas de matriz. Realizamos qRT-PCR placa é executado em um sistema de PCR em tempo real. Os miRNAs limpeza para normalização foram selecionados usando o software GeNorm (v. 3.2). Os dados foram analisados utilizando o software suite de expressão (v 1.1) e análises estatísticas foram realizadas. O método mostrou-se tecnicamente robusto e confiável e pode ser útil para avaliar os níveis de biomarcador em amostras líquidas, tais como o plasma ou soro.
Introduction
CRC representa o terceiro mais frequentemente diagnosticado malignidade e a quarta causa de morte relacionada com câncer em todo o mundo. Até à data, bevacizumab (B), um anticorpo monoclonal dirigido contra o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e cetuximab (C) ou panitumumab (P), anticorpos monoclonais dirigidos contra o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), foram aprovados para tratamento de primeira linha, em combinação com regimes de quimioterapia (CT).
Mutações nos genes K-RAS e N-RAS são os biomarcadores clinicamente útil única capazes de identificar os pacientes que são menos susceptíveis de beneficiar de anti EGFR-baseado em CT. Embora vários estudos têm sido conduzidos para procurar biomarcadores que são preditivos da resposta ao CT B-baseado, há ainda uma falta substancial de drogas confiáveis e eficazes para a prática clínica1.
os miRNAs são pequenos RNAs (18-25 nucleotides no comprimento) que regulamentam a tradução de genes-alvo e desempenham um papel crucial em inúmeros processos fisiopatológicos, incluindo embriogénese e carcinogénese. Estas moléculas são altamente estáveis em fluidos biológicos como plasma/soro, urina e escarro, que processa-los robustos biomarcadores para usar para a amostragem não-invasivo2. Usando um painel de miRNAs envolvidos na via angiogênico, tivemos como objetivo identificar circulando nova biomarcadores capazes de prever resultados clínicos em pacientes com metástase CRC (mCRC) tratados com um regime de CT B-baseado.
Analisamos uma série de 52 mCRC pacientes tratados com CT B-baseado dentro o multicêntrico prospectivo randomizado de fase III trial “italiano experimental em avançado câncer colorretal” (ITACa). O presente protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética Local (Comitato Etico área Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo por lo dei Tumori (IRST) IRCCS, n. º 674 Cura la do e Studio) em 19th de setembro de 2007. Todos os pacientes deram consentimento informado antes da coleta de amostra de sangue. Para cada paciente, amostras de sangue venoso foram coletadas antes do tratamento e na primeira avaliação clínica (após 8 semanas) para avaliar a expressão de miRNA de linha de base e sua modulação durante o tratamento em relação ao resultado do paciente.
Através de uma pesquisa da literatura, nós selecionamos 21 miRNAs correlacionados com o processo angiogênico que são conhecidos por serem detectáveis no plasma humano: p tem-miR-107, tem-miR-126-3, tem-miR-145-5 p, tem-miR-194-5 p, tem-miR-199a – 5p, tem-miR-200b – 3P, tem-miR-20b – 5P , tem-miR-21-5 p, tem-miR-210-3 p, tem-miR-221-3 p, tem-miR-24-3-p, tem-miR-27a – 3P, tem-miR-29oB – 3P, tem-miR-335-5 p, tem-miR-424-5 p, tem-miR-497-5 p, p tem-miR – 520d – 3P, tem-miR-92a – 3P, tem-miR-17-5 e tem-miR-155-5 p. Também selecionamos tem-miR-223-3 p… e tem-mir-484 para normalização endógena3,4,5,6e cel-miR-39 purificado de c. elegans como pico de normalização exógenos. Todas as normalizações de dados foram realizadas usando o método de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
A detecção de circulação miRNAs apresenta algumas dificuldades técnicas, porque as moléculas estão presentes em níveis muito baixos no plasma e sua amplificação é quimicamente um desafio, dada sua pequena sequência. Por estas razões, nós selecionamos um procedimento que considera tanto orgânica extração com fenol e uma metodologia baseada em coluna de fibra de vidro. MiRNA extração de circulação é um tema quente no campo da biópsia líquida, e nós selecionamos um kit comercial que tem demonstrado ser um dos mais confiável em termos de quantidade e qualidade dos rendimentos recuperado7,8. Nós selecionamos um protocolo para reverter transcrever os miRNAs pela adição de um adaptador em 5′ e uma cauda poli a 3′ da miRNA maduro para melhorar a seletividade e especificidade da reação.
Dada a robustez do método, projetamos placas personalizadas com sondas pre-manchadas por RT-PCR avaliar cada amostra em duplicado e analisados 2 pacientes em cada prato, como mostrado na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
os miRNAs são pequenos RNAs (18-25 nucleotides no comprimento) capazes de ligação 3′ UTR região do alvo do RNA mensageiro e inibindo e/ou degradante, não-codificante. Assim, podem ser considerados reguladores de expressão do gene no nível de translação. Na última década, vários miRNAs tem sido correlacionados com câncer iniciação e desenvolvimento, tornando-os úteis biomarcadores clínicos para diagnóstico, prognóstico e terapia. Protegido por RNases, miRNAs estão presentes em uma forma estável em flu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi parcialmente financiado pela Roche s.p.a. e a Agência italiana de medicamentos (AIFA).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
References
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