Summary
نقدم هنا، على بروتوكول للسابقين فيفو الكشف النوعي من CD8 محددة مستضد+ تي الخلايا. من الممكن تحليل مع تعليق خلية واحدة فقط من الأجهزة أو من كميات صغيرة من الدم. تتطلب مجموعة واسعة من الدراسات تحليل استجابات الخلية cytotoxic T (التطعيم ودراسات السرطان العلاج المناعي).
Abstract
عند العدوى الفيروسية، CD8 محددة مستضد+ خلايا تي سيتوتوكسيك (CTLs) تنشأ والمساهمة في القضاء على الخلايا المصابة لمنع انتشار العوامل الممرضة. ولذلك، تواتر CTLs حدة مستضد يدل على قوة استجابة الخلية T ضد مستضد معين. هذا التحليل مهم في علم المناعة الأساسي وتطوير اللقاحات، وسرطان إيمونوبيولوجي وعلم المناعة التكيفية. في مجال اللقاحات، استجابة CTL الموجهة ضد عناصر ناقل فيروسي شارك يحدد مدى فعالية توليد خلايا محددة مستضد ضد المستضد للفائدة (أي، التحوير). يمكن اكتشاف CTLs مستضد محددة أما بالتحفيز مع الببتيدات محددة متبوعة تلطيخ سيتوكين داخل الخلايا أو تلطيخ مباشرة من مستقبلات خلية تي محددة مستضد (تكرس) وتحليل التدفق الخلوي. الطريقة الأولى مضيعة للوقت بل أنه يتطلب التضحية بالحيوانات لعزل الخلايا من الأجهزة. أيضا، فإنه يتطلب عزلة دم من الحيوانات الصغيرة التي من الصعب إجراء. الأسلوب الأخير بدلاً من ذلك بسرعة، ويمكن القيام به بسهولة مع كميات صغيرة من الدم ولا تعتمد على مهام محددة المستجيب، مثل النشاط عن. MHC tetramers أداة مثالية للكشف عن مستضد الخاصة تكرس.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول في نفس الوقت كشف CTLs على الببتيدات إيمونودومينانت من النواقل الفيروسية منظمة-سباق الجائزة الكبرى (LCMV-سباق الجائزة الكبرى، التي أرستها منظمة) محددة مستضد والمتسلسلات (البويضات، فيروس الورم الحليمي البشري 16 E7، اجفب) من MHC أنا تيترامير تلطيخ والتدفق الخلوي. تلوين الممكن مباشرة من الدم أو من تعليق خلية واحدة فقط من الأجهزة، مثل الطحال. الدم أو تعليق خلية واحدة فقط من الأجهزة هي المحتضنة مع تيتراميرس. بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد CD3 و CD8، كمياً CTLs مستضد الخاصة بالتدفق الخلوي. اختيارياً، الأجسام المضادة ضد CD43, CD44, CD62L أو غيرهم يمكن إدراجها لتحديد حالة التنشيط الخاصة مستضد CD8+تي الخلايا، وتميز بين الخلايا ساذجة والمستجيب.
Introduction
والهدف من هذا الأسلوب تقييم تواتر استجابات اللمفاويات T السامة للخلايا (CTL) إلى المستضدات (متعددة) في الماوس عن طريق تحليل تدفق سيتوميتريك دون الحاجة للتحفيز الببتيد تستغرق وقتاً طويلاً. ويحلل هذا الأسلوب خصوصية النمط الظاهري ومستضد CTL مجموعات فرعية، في تلطيخ مفردة. نحن الأمثل المجمع Histocompatibility الرئيسية أنا (MHC أنا) تيترامير تلطيخ البروتوكول لتحليل فعالية النهج اللقاحات الجديدة، مثل منظمة-سباق الجائزة الكبرى، متغير جديد لفيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة)، حيث تم استبدال بروتين سكري "ز منظمة" بروتين سكري سباق الجائزة الكبرى من1،تشوريومينينجيتيس اللمفاوية فيروس (لكمف)2. بالإضافة إلى استجابة خلطيه، هو قراءة هامة للفعالية من اللقاح تحريض استجابة CTL ضد المستضدات واحد أو عدة. الاتساق والمتانة الاستجابة الخلوية هي هامة في هذا السياق، أنها ملائمة لرصد حركية استجابات CTL من الحيوان نفسه. وهذا سيؤدي أيضا إلى خفض إعداد الحيوانات، جانبا هاما فيما يتعلق بمبادئ "3Rs"3. ومن ثم فتحليل من قدر ضئيل من 20 ميليلتر من الدم الأمثل لهذا الغرض.
ووضعت تيتراميرس في أواخر التسعينات4 وأصبح أداة هامة في مجال علم المناعة خلية تي. Tetramers مجمعات المسمى فلوريسسينتلي من أربعة MHC أنا/جزيئات الببتيد، التي تلزم لتكرس، محددة ببتيد واحد. في الوقت الحاضر، يمكن أن يكون أما اشتروا الجاهزة5، أمر مخصص مجاناً في "المرافق الأساسية تيترامير المعاهد الوطنية للصحة" في جامعة إيموري6 أو المنتجة في مختبر7. MHC الأول والثاني tetramers متاحة، أي ل CD8+ وخلايا CD4 خلايا+ T، على التوالي. الفاعلية لتلطيخ تيترامير يكمن في توفير الوقت، وبدلاً من ذلك بسيطة وسهلة لتوحيد البروتوكولات8 ، وحساسية9. أيضا، إذا كان يعمل مع الدم، الحيوانات لا تحتاج إلى التضحية وكميات ضئيلة من العينة المطلوبة. قياس واحد لا يقتصر مستضد واحد، ولكن يمكن تحليلها عدة مولدات المضادات في تلطيخ واحد عند الجمع بين tetramers مترافق مع فلوروفوريس مختلفة. يمكن بسهولة إدراجها في tetramers المستضدات المكتشفة حديثا، على سبيل المثال من شاشات الببتيد، وتستخدم للتحديد الكمي لمجموعة فرعية خلية T.
تلوين تيترامير لن تعطي معلومات حول وظيفة CTL (أي.، وإنتاج سيتوكين، وظائف المستجيب)، لكن خصوصية فقط. للحصول على معلومات حول وظيفة الخلية T أو سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ (ICS) أو الإنزيم إنزيم مرتبط المناعية سبوت (السبت) يجب أن يكون إجراء8،10. تلطيخ تيترامير و ICS/السبت، ومع ذلك، لا تكون زائدة عن الحاجة ولكن بل يكمل كل منهما الآخر. التحفيز في المختبر للحث على إنتاج سيتوكين ICS/السبت سوف يغير النمط الظاهري T الخلية الأصلي. تيترامير تلطيخ، على النقيض من ذلك، يترك الخلية T لم يمسها؛ يتم الاحتفاظ بالنمط الظاهري الأصلي ويمكن تحليلها. أيضا، ميزة كبيرة أخرى من تيتراميرس أن تلطيخ يمكن دمجها مع الفرز المغناطيسي والإثراء من خلايا محددة مستضد11. وهذا ما يسمح لتحليل السكان النادرة، فضلا عن استزراع الخلايا تم فرزها مع خصوصيات مستضد محدد – ميزة لا يكون ممكناً مع أساليب أخرى.
استخدام في البروتوكول المذكورة هنا، وتلطيخ تيترامير، فضلا عن ICS/السبت يمكن إجراء من جهاز واحد، لأنه سوى القليل جداً من المواد (الدم: 20 ميليلتر؛ والطحال: 1 × 106 خلايا) مطلوب لتلطيخ تيترامير. بيد تبعاً لتواتر خلايا محددة مستضد الفائدة، قوة تكر كل منهما وسياق تجريبي، قد تحتاج إلى كمية الخلايا المطلوبة للارتقاء أو الممغنطة التخصيب قد تحتاج إلى تطبيق.
تيتراميرس تستخدم على نطاق واسع، على سبيل المثال لتقييم الفعالية من اللقاحات (انتيتومور)12،13،،من1415 أو العلاج المناعي16،17، تحليل المظهرية والمكانية الترجمة لمجموعات فرعية محددة مستضد تي خلية18،20،19،21،22،23. الأسلوب الموصوفة هنا هي مناسبة للدراسات التي تهدف ليشمل القياس الكمي وتحليل المظهرية مورين محددة مستضد CD8+ تي الخلايا في تحليلها بطريقة سريعة وملائمة.
Protocol
أجريت جميع الأساليب المذكورة وفقا "الحيوان الوطنية النمساوية التجريب القانون" ("تيرفيرسوكهسجيسيتز")، وتم منح الإذن للمحاكمة الحيوان السلطات الوطنية النمساوية.
1-المخزن المؤقت إعداد وجمع العينة
ملاحظة: سلالة الماوس المستخدمة يعتمد على حانمه تم تحليلها. اختر تيترامير مناسبة التي تربط إلى نوع MHC المعرب عنها في الفئران، مثل، ح-2 كيلوبايت للفئران C57BL/6. نوع الجنس والسن من الحيوانات يعتمد على مسألة علمية. بالنسبة لمعظم التجارب الموصوفة هنا، استخدم الفئران الإناث في 6-8 أسابيع من العمر في بداية التجربة، أي، التحصين الأولى.
- إعداد المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + مصل العجل الجنين 1% (FCS) + أزيد الصوديوم 0.1% + حمض 2 مم الإيثيلين (يدتا) ونظام مراقبة الأصول الميدانية تحديد المخزن المؤقت (فورمالدهايد 1.5% (v/v) في برنامج تلفزيوني).
ملاحظة: من المستحسن أن تكون مستعدة على حد سواء مخازن مقدما. المخزنة في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. - الدم: جمع 20 ميليلتر من الدم الواحد الماوس من المنطلق ذيل الماوس في الأنابيب المغلفة يدتا، كما هو موضح سابقا24.
ملاحظة: ويمكن أيضا جمع الدم بطرق أخرى، مثل، فينا فاسيليس أو التهاب الجيوب الرجعية-المداري. ومع ذلك، الأسلوب لجمع الدم يجب أن يكون امتثالا للقانون الوطني التجارب الحيوانية والحيوانية التطبيقات التجريبية. جمع الدم من الوريد ذيل مثالي للدراسات التي تحتاج إلى كميات صغيرة مرارا وتكرارا من الدم. مواد إضافية مطلوب لضوابط التعويض وعنصر التحكم غير الملون. - الطحال: عزل الجهاز، ومع مساعدة المكبس لحقنه، اضغط من خلال 70 نانومتر ومصفاة خلية 40 ميكرومتر. إجراء تحلل الكريات الحمراء، كما هو موضح في الخطوة 6 والعد. ضبط التركيز إلى 1 × 107 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني. كل عينة، 1 × 106 الخلايا المطلوبة.
ملاحظة: دائماً تشمل بعض تحصين صورية أو مراقبة ناقلات تحصين الحيوانات كمراقبة سلبية. ل ovalbumin (OVA)-تيترامير، عينة من الفئران OT-1 يمكن أن تستخدم كمراقبة إيجابية. لا تنسوا أونستينيد وضوابط التعويض في الحساب. إذا لزم الأمر، يمكن تجميع عينات من الحيوانات المختلفة في التجربة لهذا. - بعد جمع العينات مباشرة المضي قدما في تلطيخ.
2-تلوين التشكيل
- إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية أنبوب واحد لكل عينة. قم بتسمية أنابيب بشكل صحيح ونقل 100 ميكروليتر من تعليق الجهاز (1 × 106 خلايا) أو 20 ميكروليتر من الدم في كل أنبوب.
- الطحال: الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 600 x ز في 4 – 8 درجة مئوية وتجاهل المادة طافية. الدوامة ريسوسبيند بيليه الخلية.
ملاحظة: وهذا سيؤدي إلى وحدة تخزين المتبقي من حوالي 20 ميليلتر، مماثلة كوحدة تخزين عينات الدم. - لكل قناة أن تستخدم أيضا إعداد أنبوب واحد من نظام مراقبة الأصول الميدانية لنموذج تعويض. إعداد نموذج إضافي واحد كعنصر تحكم أونستاينيد.
3-تيترامير تلطيخ
-
لكل نموذج، استخدم 50 ميكروليتر من تمييع تيترامير. ل tetramers المقترحة وتخفيف الأمثل، أرجع إلى الجدول 1.
ملاحظة: عند العمل مع تيتراميرس أو الأجسام المضادة، إيقاف ضوء السلامة الحكومة وحماية العينات من الضوء.- إعداد أنبوب مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (الحجم = 50 ميكروليتر × عدد العينات بالإضافة إلى إضافية 10% من الحجم الإجمالي للتعويض عن أخطاء بيبيتينج).
- إضافة tetramer(s) في تمييع المثلى، كما هو موضح في الجدول 1. دوامة الحل.
ملاحظة: عند استخدام لوحة جسم كامل (CD3، CD8، CD43، CD44، CD62L) مع فلوروفوريس المدرجة في القائمة، يمكن تضمين اثنين من تيتراميرس (في بي وآسيا والمحيط الهادئ). ويمكن الجمع بين كلا تيتراميرس في تلطيخ واحد، أي، تلطيخ الخلايا التي تحتوي على كلا تيتراميرس يمكن أن يؤديها في وقت واحد.
| تيترامير | الببتيد تسلسل | اليل | فلوروفوري | تمييع |
| MHC أنا/البويضات | سيينفيكل | ح-2 كيلو بايت | آسيا والمحيط الهادئ | 01:25 |
| MHC أنا/منظمة-NP | رجيفيقجل | ح-2 كيلو بايت | PE | 01:25 |
| MHC أنا/اجفب | هيلستقسال | ح-2Kd | PE | 01:25 |
| MHC أنا/لكمف--سباق الجائزة الكبرى | كافينفاتك | ح-2Db | آسيا والمحيط الهادئ | 01:25 |
| MHC أنا/فيروس الورم الحليمي البشري 16 E7 | راهينيفتف | ح-2Db | آسيا والمحيط الهادئ | 01:10 |
الجدول 1: اقترح تيتراميرس وتخفيف الأمثل. تيتراميرس الموصى بها لبعض الببتيدات إيمونودومينانت النموذجي المستضدات (Ovalbumin (OVA) والبروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)) أو مكونات الممرض (التهاب الفم الحويصلي الفيروس (منظمة) البروتين النووي (NP)، تشوريومينينجيتيس اللمفاوية فيروس (LCMV بروتين سكري) (GP) وفيروس الورم الحليمي البشري (فيروس الورم الحليمي البشري) E7 أونكوبروتين (E7)). لكل تسلسل الببتيد واليل المقابلة، يتم سرد فلوروفوري، وكذلك على النحو الموصى به، وتمييع الأمثل.
- إضافة 50 ميكروليتر من تمييع تيترامير لكل عينة ودوامه بلطف. إضافة نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت فقط (بدون تيترامير) ضوابط التعويض والعينة أونستاينيد.
- احتضان عينات لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، ومحمية من الضوء. لضمان انتقال سلس من تيترامير إلى جسم تلطيخ، إعداد مزيج الأجسام المضادة كما هو موضح في الخطوة 4 خلال فترة الحضانة.
ملاحظة: لكل تيترامير الفردية، الظروف المثلى (التخفيف ووقت الحضانة ودرجة الحرارة) تحتاج إلى تعديل.
4-إعداد الأجسام المضادة
-
لكل عينة، وإعداد 50 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة.
- إعداد أنبوب مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (الحجم = 50 ميكروليتر × عدد العينات بالإضافة إلى إضافية 10% من الحجم الإجمالي للتعويض عن أخطاء بيبيتينج).
- إضافة أجسام مضادة في تخفيف كما هو موضح في الجدول 2.
ملاحظة: اعتماداً على مسألة علمية، قد يتم استخدام تركيبات علامة أخرى عدا الموضحة هنا. تأكد لتشمل الأجسام المضادة ضد CD3 و CD8 دائماً في الفريق. - دوامة الحل.
| جسم مضاد | فلوروفوري | تمييع | ميكروغرام/عينة | علامة |
| CD3 | PE Cy7 | 1: 200 | 0.05 | CTLs (CD3+CD8+) |
| CD8 | المحيط الهادئ الأزرق | 1:750 | 0.013 | |
| V450 | 1: 100 | 0.1 | ||
| CD43 | فيتك | 1: 100 | 0.25 | التنشيط (CD43+) |
| CD44 | PE Cy5 | 1: 250 | 0.04 | ساذج (CD44–CD62L+) & المستجيب (CD44+CD62L–) |
| CD62L | آسيا والمحيط الهادئ--Cy7 | 1: 500 | 0.02 |
الجدول 2: الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول وتخفيف الأمثل. يتم سرد علامات السطح الموصى بها (CD3 و CD8، CD43، CD44 و CD62L) في العمود الأول. لكل منها، يتم سرد fluorophore الموصى بها، وتمييع الأمثل وكمية الأجسام المضادة/عينة. في العمود الأخير، يتم تحديد نوع الخلية المحددة مع كل علامة.
-
إعداد الأجسام المضادة لعناصر التعويض. لكل عنصر تحكم التعويض، استخدام جسم مضاد ضد CD8 باللون الخاصة بكل منها.
- لكل قناة، إعداد أنبوب مع 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وإضافة 1 ميكروليتر من جسم تمييع 1: 200 ضد CD8 باللون الخاصة بكل منها.
- دوامة الأنابيب.
- المضي فورا في تلطيخ.
5-تلوين العينات
- تغسل العينات مرة واحدة عن طريق إضافة ~ 1 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 600 x ز في 4 – 8 درجة مئوية. وبعد الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية واستنزاف قبالة السائل المتبقي في كومة من المناشف الورقية.
ملاحظة: عند العمل مع الدم، توخي الحذر عند سقوطها قبالة السائل المتبقية. قبل تحلل الكريات الحمراء، لن تتمسك الدم إلى الجزء السفلي من الأنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية. وبدلاً من ذلك، نضح المادة طافية. - إضافة 50 ميكروليتر من مزيج الأجسام المضادة لكل خلية بيليه ودوامه بلطف.
- إضافة 50 ميكروليتر من كل مزيج التعويض إلى بيليه الخلية التحكم المقابلة في التعويض ودوامه بلطف.
- إضافة 50 ميكروليتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لبيليه خلية لمراقبة أونستاينيد ودوامه بلطف.
- احتضان جميع العينات لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء.
- عند العمل مع الأجهزة: تخطي الخطوة 6. أغسل مرة واحدة عن طريق إضافة ~ 1 – 2 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 600 x ز في 4 – 8 درجة مئوية. وبعد الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية واستنزاف قبالة السائل المتبقي في كومة من المناشف الورقية.
- عند العمل مع الدم: انتقل إلى الخطوة 6 (تحلل الكريات الحمراء).
6-تحلل الكريات الحمراء
- إضافة 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت ACK (الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم)25 لكل عينة ودوامه بلطف.
ملاحظة: المخزن المؤقت ACK يؤدي إلى تورم ناضح وتحلل، على وجه التحديد من الكريات الحمراء. - احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- أضف 1 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 600 x ز في 4 – 8 درجة مئوية. وبعد الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية واستنزاف قبالة السائل المتبقي في كومة من المناشف الورقية.
ملاحظة: عندما يكون بيليه حمراء بدلاً من ذلك، كرر تحلل الكريات الحمراء. - أغسل مرة واحدة عن طريق إضافة ~ 1 – 2 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 600 x ز في 4 – 8 درجة مئوية. وبعد الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية واستنزاف قبالة السائل المتبقي في كومة من المناشف الورقية.
7-تدفق سيتوميتريك القياس والتحليل
- إضافة 150 – 300 ميكروليتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية تحديد المخزن المؤقت لكل أنبوبة ومزيج من فورتيكسينج. ل 20 ميليلتر من الدم، 150 ميليلتر من المخزن المؤقت غير كافية.
ملاحظة: قبل التثبيت، تأكد من أن الخلايا أيضا إعادة مع وقف التنفيذ للحيلولة دون تشكيل كتل. المضي قدما مع تدفق سيتوميتريك القياس، في أسرع وقت ممكن. - قياس عناصر التعويض وتصحيح أي التداخل الطيفي.
-
إقامة بوابات متتابعة، كما هو مبين في الشكل 1 لتحديد ل CD3+/CD8+ الخلايا.
- بوابة على الخلايا الليمفاوية استخدام مبعثر إلى الأمام وسيديوارد (منطقة) (مقياس غير لوغاريتمي).
- ضمن السكان اللمفاويات، وبوابة على خلايا مفردة استخدام مبعثر الأمام العرض مقابل منطقة (مقياس غير لوغاريتمي).
- ارسم لمفاوية خلية مفردة باستخدام قنوات CD3 و CD8 (مقياس لوغاريتمي). تحديد CD8+ تي الخلايا قبل النابضة في CD3+/CD8+ الخلايا.
- ارسم CD8+ مقابل تيترامير+ الخلايا وبوابة على CD8+ + تيترامير الخلايا، كما هو مبين في الشكل 2.
- إذا كان ذلك ممكناً، بتسجيل 20,000 الخلايا (خلايا 5,000 على الأقل من الدم) في CD3+/CD8+ بوابة لكل عينة وحفظه كملف FCS.
ملاحظة: كمية الخلايا لتسجيل قد تحتاج إلى تعديلها وفقا لتواتر خلايا محددة مستضد الفائدة. - تحليل ملفات السفح مع برمجيات التحليل الملائمة. استخدام استراتيجية النابضة، كما هو موضح أعلاه (المادة 7-3)، وقياس CD8+ تيترامير+ الخلايا.
Representative Results
الشكل 1 يوضح كيفية البوابة بشكل صحيح في الخلايا الهدف من هذا البروتوكول، هما CD3+/CD8+ الخلايا. هو أن نلاحظ أن تنشيط الخلايا غالباً ما دوونريجولاتي26،مستقبلات خلية تي27 ، وعليه، ينبغي أيضا إدراج خلايا CD3منخفضة في النابضة. بعد النابضة CD3+/CD8+ الخلايا, تيترامير الإيجابية يمكن أن تكون الخلايا المحددة (الشكل 2). اسطوانات يقوم الممثل لماوس السيطرة سلبية (السذاجة)، فضلا عن الحيوانات أما تطعيم مع أما إفراز البويضات إتش 5 (الغدد-البويضات) أو يرد التعبير عن البويضات منظمة-GP (منظمة-سباق الجائزة الكبرى-البويضات). كما رأينا في البقع أقل مختلفين ويمكن الجمع بين تيتراميرس في الأنبوب نفسه لتلطيخ. يسمح هذا الكمي المتزامن لاثنين من خصوصيات CTL مختلفة: (منظمة ن) الخاصة بالفيروس و CTLs التحوير الخاصة (OVA). وأكد أننا أن ستينينجس تيترامير مفردة ومزدوجة إعطاء نسب مئوية مماثلة من الخلايا إيجابية لكل تيترامير. باستخدام هذا البروتوكول، وأخرى خاصة بالفيروس (مثلاً.، لكمف سباق الجائزة الكبرى، فيروس الورم الحليمي البشري 16 E7) أو التحوير على حدة (مثلاً.، التجارة والنقل) تحليل الخلية تي يمكن أن يكون السكان (تكميلية الشكل 1). في تكميلية الجدول 1، يتم إظهار النتائج للحيوانات الخمسة بعد التحصين مع منظمة-سباق الجائزة الكبرى-البويضات – تشير إلى متانة تلطيخ تيترامير.
الشكل 1: الممثل النابضة استراتيجية لتحليل CD8+ تي الخلايا في الدم. التمثيل التخطيطي النابضة الاستراتيجية المستخدمة لتحليل تدفق سيتوميتريك. بعد تيترامير تلطيخ وتدفق قياس سيتوميتريك، وقد تم تحليل البيانات. تم تحديد الخلايا الليمفاوية المبعثر إلى الأمام وسيديوارد (منطقة) (مقياس غير لوغاريتمي). من هؤلاء، حددت الخلايا المفردة بتطبيق مبعثر الأمام العرض مقابل منطقة (مقياس غير لوغاريتمي). CD8+ ر وحدد الخلايا النابضة في CD3+/CD8 الخلايا+ (مقياس لوغاريتمي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: الممثل النابضة استراتيجية لقياس CD8 الخاصة بالبويضات ونون+ تي الخلايا في الدم. التمثيل التخطيطي النابضة الاستراتيجية المستخدمة لتدفق سيتوميتريك التقدير الكمي للخلايا تيترامير+ . CD3+/CD8+ الخلايا واستخدمت لتحليل تيترامير. الفريق الأعلى والأوسط: تم رسم علامة CD8 مقابل تيترامير كل منهما (مقياس لوغاريتمي). لوحة أسفل: كلا تيتراميرس كانت تآمرت ضد بعضها البعض (مقياس لوغاريتمي). اليسار: الماوس التحكم (السذاجة)؛ الأوسط: تم تحصين الماوس مع إفراز البويضات إتش 5 (الغدد-البويضات)؛ الحق: تم تحصين الماوس مع أوفالبومين (OVA)-الإعراب عن منظمة-سباق الجائزة الكبرى (منظمة-سباق الجائزة الكبرى-البويضات). تم جمع الدم من الوريد الذيل في اليوم السابع بعد التحصين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الإضافي رقم 1: نتيجة CD3 الممثل+/CD8+ الخلايا تيترامير+ بعد التطعيم. التمثيل التخطيطي لتدفق سيتوميتريك التقدير الكمي للخلايا تيترامير+ . CD3+/CD8+ الخلايا واستخدمت لتحليل تيترامير وتم رسم علامة CD8 مقابل تيترامير كل منهما (مقياس لوغاريتمي). اليسار: الفئران كانت ساذجة، الحق: الفئران تم تحصين مع منظمة-سباق الجائزة الكبرى (اللوحة العلوية)، وعزز "البروتينات الفلورية الخضراء" (اجفب)-الإعراب عن منظمة-سباق الجائزة الكبرى (الفريق الأوسط) أو التعبير عن فيروس الورم الحليمي البشري (فيروس الورم الحليمي البشري) E7 أونكوبروتين (E7) منظمة-سباق الجائزة الكبرى (أسفل اللوحة). جمعت من المنطلق الذيل الدم في اليوم السابع بعد التحصين وملطخة تيتراميرس (LCMV-سباق الجائزة الكبرى، اجفب وفيروس الورم الحليمي البشري E7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ميزة واحدة كبيرة من البروتوكول الموصوفة هنا أن ردود الخلية T من الماوس نفسها يمكن اتباعها مع مرور الوقت، هناك حاجة إلى كميات صغيرة فقط من الدم لكل قياس. ويبين الشكل 3 نتائج مثالية للخلية T الردود على مر الزمن. بالإضافة إلى كميات محددة مستضد CTLs، على النمط الظاهري يمكن أيضا تحليل استخدام هذا البروتوكول (الشكل 4).
الشكل 3: نتيجة الممثل من CD8+ تي الخلية الحركية في الدم بعد التطعيم. التمثيل التخطيطي النابضة الاستراتيجية المستخدمة لتدفق سيتوميتريك التقدير الكمي للخلايا تيترامير+ . CD3+/CD8+ الخلايا واستخدمت لتحليل تيترامير وكلا تيتراميرس كانت تآمرت ضد بعضها البعض (مقياس لوغاريتمي). لوحات العلوي: تم تحصين الماوس مع إفراز البويضات إتش 5 (الغدد-البويضات)؛ انخفاض اللوحات: تم تحصين الماوس مع أوفالبومين (OVA)-الإعراب عن منظمة-سباق الجائزة الكبرى (منظمة-سباق الجائزة الكبرى-البويضات). وجمعت الدم من الوريد الذيل في اليوم 3، 7 و 10 و 14 بعد التحصين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الممثل نتيجة CD8+ تي خلية التنشيط والتمايز إلى خلايا ساذجة والمستجيب بعد التطعيم. التمثيل التخطيطي النابضة الاستراتيجية المستخدمة للتدفق الكمي سيتوميتريك لتنشيط (CD43+)، ساذجة (CD44/CD62L–+) والمستجيب (CD44+/CD62L–) CD3+/CD8+ الخلايا ( مقياس لوغاريتمي). اليسار: الماوس التحكم (السذاجة)؛ الأوسط: تم تحصين الماوس مع إفراز البويضات إتش 5 (الغدد-البويضات)؛ الحق: تم تحصين الماوس مع أوفالبومين (OVA)-الإعراب عن منظمة-سباق الجائزة الكبرى (منظمة-سباق الجائزة الكبرى-البويضات). تم جمع الدم من الوريد الذيل في اليوم السابع بعد التحصين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| فأر # | % CD43+ | % N منظمة تيترامير+ | تيترامير البويضات %+ | |
| وهمية | 1 | 1.7 | 0.45 | 0.41 |
| 2 | 0.77 | 0.69 | 0.15 | |
| 3 | 1.34 | 0.35 | 0.31 | |
| 4 | 1.68 | 0.83 | 0.26 | |
| 5 | 0.84 | 0.47 | 0.23 | |
| منظمة-سباق الجائزة الكبرى-البويضات | 1 | 23 | 13.2 | 3.69 |
| 2 | 32.6 | 15.9 | 3.54 | |
| 3 | 22.1 | 11.7 | 2.43 | |
| 4 | 15.1 | 8.89 | 1.79 | |
| 5 | 29.1 | 14.7 | 5.64 |
تكميلية الجدول 1: النسب المئوية من CD3 المنشط ومحددة مستضد+/CD8+ الخلايا بعد التطعيم. الفئران هي أما ساذجة أو تحصين مع أوفالبومين (OVA)-الإعراب عن منظمة-سباق الجائزة الكبرى (منظمة-سباق الجائزة الكبرى-البويضات) (n = 5). جمعت من المنطلق ذيل الدم في اليوم السابع بعد التحصين والملون مع تيتراميرس (منظمة-ن والبويضات). المنشط (CD43+) و CD3 محددة مستضد (تيترامير+)+/CD8+ تم قياس كمية الخلايا بالتدفق الخلوي.
Discussion
تلوين تيترامير بروتوكول بدلاً من ذلك بسيطة وغير معقدة لتحليل خصوصية النمط الظاهري والببتيد اللمفاويات T. استخدام الدم للتحليل، كما هو موضح هنا، هو مينيملي ويتيح الرصد المستمر، وعلى سبيل المثال في دراسات التطعيم. في مجال التحصين، التقدير الكمي للاستجابات الخاصة المتجهات ومستضد الاهتمام، كما قد تعرقل الاستجابات الخاصة بناقلات استجابة مناعية فعالة ضد مستضد لقاح28. من المذكرة أن البروتوكول هو موضح هنا، كل السكان يمكن قياسها كمياً في وقت واحد في تلطيخ تيترامير واحد، مما يقلل من تقلب المصبوغة وكميات العينة. ومع ذلك، تحتاج بضع خطوات ينبغي القيام به بعناية لضمان القياس الصحيح وبيانات موثوق بها. إذا كان استخدام الدم من الوريد الذيل للتحليل، واحدة يجب التأكد من قبل الحارة الحيوانات للحث على توسع الأوعية24. وبالتالي يمكن جمع الدم كافية في وقت قصير ويتم تقليل الإجهاد على الحيوانات والتحليل أفضل بكثير، ومقارنة بحالة يتم جمع الدم ببطء. أيضا، بعد جمع العينات (الدم أو الأجهزة)، تلطيخ المباشر هو الموصى بها لتجنب النتائج السلبية الكاذبة بسبب downregulation تكر. وينطبق نفس الشيء على كافة الخطوات اللاحقة: ينبغي عدم توقف الإجراء وكل الغسيل خطوات خفض عدد الحد الأدنى (كما ورد في البروتوكول). للتأكد من تلطيخ السليم، ينبغي الحرص على دوامة جميع الحلول والعينات قبل وبعد حضانة. وهذا مهم بشكل خاص قبل تحديد العينات لتجنب التثاقل من الخلايا.
فيما يتعلق بتعديل البروتوكول، يمكن استخدام علامات السطحية وتيتراميرس الأخرى، تبعاً لهدف التحليل. ومع ذلك، ثم جميع الكواشف بحاجة إلى تكون معاير، على النحو الأمثل في تركيبة مع كله تلطيخ لوحة. كشف الأمثل لبعض تيتراميرس المحدد هنا، أنه يمكننا زيادة التخفيف الموصى بها من قبل الشركة المصنعة (مستحسن 01:10، 01:25 الأمثل) (الجدول 1). للتعويض عن التداخل الطيفي، يمكن استخدام الخرز التعويض بدلاً من الخلايا الملون. فيما يتعلق باختيار fluorochrome تيترامير مقترنة، ينبغي للمرء أن يتصور باستخدام فلوروتشروميس مشرق، كهذا يسهل الكشف عن--لا سيما عند الإشارة منخفضة. ك Dolton والزملاء29، نحن نفضل أن استخدام تيتراميرس إلى جانب بي أو آسيا والمحيط الهادئ، التي يمكن دمجها تماما في تلطيخ واحدة و CD8+ تي يمكن أن تكون الخلايا مع خصوصية مستضد واحد لطيف الكشف عن (الشكل 2). فيما يتعلق بأوقات الحرارة والحضانة، توجد مجموعة متنوعة من تيترامير تلطيخ الظروف. في عملية التحسين لدينا، ونحن قد تناول هذه المسألة وتيترامير تلطيخ في ظروف مختلفة (مثل 4 درجة مئوية، ودرجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية). من النتائج التي تم الحصول عليها، نحن ننصح بوصمة عار لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وفي التوافق مع الأدب30،31. وينبغي تجنب حضانة طويلة، وهذا يمكن أن يؤدي إلى استيعاب تيترامير النتائج السلبية30 وكاذبة.
اختيار جسم الصحيح للكشف عن CD8+ الخلايا هو مسألة هامة أخرى والذي يتعين النظر بعناية (ويحتمل أن تكون مكيفة). وهذا ينبع من حقيقة أن بعض الأجسام المضادة-CD8 استنساخ ربط كتلة من تيتراميرس إلى تكر، في البشرية32 ، فضلا عن عينات33 الماوس. تيترامير لدينا تلطيخ البروتوكول، اخترنا استنساخ 53 – 6.7 وصمة عار ل CD8 مورين+ الخلايا – استنساخ الذي لا يمنع، ولكن بدلاً من ذلك يعزز تلطيخ تيترامير.
تلوين تيترامير غير معقدة بدلاً من ذلك عند تحليل الاستجابات المناعية بارزة في ذروة استجابة الخلية T، على سبيل المثال. ومع ذلك، قد يكون هناك السكان التي أكثر قليلاً من 'إشكالية'. هذه الأمثلة على الخلايا المحددة لتقارب منخفضة المستضدات (الورم، النفس)، ومؤخرا تم تنشيطه الخلايا التي تنظم في وقت لاحق من أسفل على مستقبلات أو خلية النادرة مجموعات فرعية (السذاجة. على سبيل المثال السلائف أو ذاكرة السكان الخلية). وفي هذه الحالات، قد تحتاج تيترامير الكلاسيكية تلطيخ البروتوكول تحسين أو جنبا إلى جنب مع أساليب أخرى. على سبيل المثال، يحول دون استيعاب تكر داساتينيب المانع (PKI) كيناز البروتين ويمكن إدراجها قبل تيترامير تلطيخ. كما يمكن أن تستقر تيتراميرس بها بما في ذلك Abs الأولية أونكونجوجاتيد fluorochrome المضادة بعد تلطيخ تيترامير. بالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة كثافة الأسفار بالإضافة الثانية Ab المضادة مترافق fluorochrome Ab29،34،35،36. نحن الأمثل شروط tetramers المحددة في هذا البروتوكول بطريقة انتقائية، ولم تتضمن PKI أو تقاسم المنافع الإضافية. ومع ذلك، لأي تيترامير الأخرى، أن الظروف المثلى يمكن تعديلها بشكل فردي. فيما يتعلق بالسكان نادرة، قد تحتاج تلطيخ تيترامير تكون جنبا إلى جنب مع تخصيب اليورانيوم المغناطيسي11.
تيسير والتحقق من صحة تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية تيترامير تلطيخ، ينبغي إدراج عناصر سلبية وإيجابية. كعنصر سلبي، ونحن دائماً وصمة عار الخلايا بالماوس ساذجة من نفس السلالة مع لدينا تيترامير للفائدة. وبدلاً من ذلك، يمكن ملطخة عينات tetramers مع الببتيدات غير ذات صلة، ولكن مع fluorochrome نفسه تيترامير للفائدة. هذه الضوابط ضرورية لاستبعاد الإشارات الإيجابية الكاذبة، على سبيل المثال.، التي تنشأ من خلايا الموت. وبالإضافة إلى ذلك، من المستحسن لتشمل وصمة عار يعيش الميت، مثل يوديد propidium (PI). وهذا أهمية خاصة إذا كانت الخلايا غير ملطخة مباشرة بعد عزلة. قد يكون هناك استراتيجية أخرى لإزالة الخلفية أوتوفلوريسسينسي تشمل عدة علامات خلية غير تي في قناة واحدة. باستثناء الخلايا إيجابية في هذه القناة، يمكن استبعاد السكان-خلية تي. كعنصر إيجابي، يمكن استخدام عينة من ماوس 1 بعد التمديد للبويضات تيترامير، على سبيل المثال. لأخرى تيتراميرس، وهذا قد يتم اختياره على حدة (على سبيل المثال.، عينة من ماوس، الذي تم تحصين عدة مرات). على حد سواء الآخرين37، نلاحظ أيضا أسفل لائحة من مستقبلات CD8 أثناء التنشيط CTL في يوم 7 من المستجيب استجابة الخلايا T. ولذلك، لتجنب فقدان خلايا المستجيب تي تيترامير المنشط+ ، نوصي بتضمين الخلايا CD8منخفضة في التحليل (على الأقل إذا كان قياس في مرحلة المستجيب).
نوعية وكمية المعلومات التي يمكن استرداد واحدة من هذا البروتوكول تعتمد على المعرفة حول antigen دراستها، وتوافر وخصوصية تيترامير ونوعية الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية (عدد من أشعة الليزر، وكاشفات المتاحة). إذا كان يعمل مع العينات الحيوانية، الاختلاف في الاستجابة المناعية الطبيعية ولا مفر منه. ولذلك، للحصول على نتائج ذات مغزى من تيترامير تلطيخ، ينبغي تحليل الحيوانات على الأقل 3-5. إذا فعلت ذلك، البروتوكول الموصوفة هنا سوف تعطي نتائج موثوقة واستنساخه (النتيجة المثالية من تجربة واحدة يمكن العثور عليها في الجدول الإضافي 1). وكما سبقت الإشارة إلى ذلك، هذا الأسلوب مناسبة تماما لتحديد النمط الظاهري وخصوصية مستضد من CD8+ تي الخلايا (الشكل 3، 4؛ الإضافي رقم 1)، ليس فقط في الماوس ولكن أيضا في البشر. ومع ذلك، لتحليل CD8+ المستجيب خلية T وظائف، مثل موت الخلايا المستحثة granzyme، ICS و/أو اليسبوت بحاجة إلى إجراء. ومع ذلك، أحد ينبغي أن نضع في اعتبارنا أن وظائف الخلية T، مقيسة بالتحفيز في المختبر قد لا تمثل الحالة الفعلية المجراة. بيئة قمعية المجراة، قد منع مهام الخلية T التي يتم قياسها في المختبر.
في تيترامير الخاصة، تلطيخ لا توفر جميع المعلومات، بل أنها تطورت لتصبح وسيلة أساسية لوصف ردود الخلية T والتحديد الكمي للخلية T مجموعات فرعية في المختبر ب طريقة حساسة جداً38. تيتراميرس لا يمكن استخدام فقط لتحديد مجموعات فرعية معينة، ولكن أيضا لعزل تلك39وترجمة لهم بالتهجين في الموقع19،20 والدراسة المستضدات تقارب منخفضة، مثل المرتبطة بورم40، 41. ومنذ اكتشاف تيترامير التكنولوجيا4، تلطيخ تيترامير أصبح أداة أساسية في تحليل خلايا تي والمجموعة من التطبيقات.
Disclosures
دوروثي فون ليير مخترع منظمة-سباق الجائزة الكبرى ويحمل أسهم الأقلية في شركة للتكنولوجيا الحيوية فيراثيرابيوتيكس GmbH، والتي تملك حقوق الملكية الفكرية لمنظمة-سباق الجائزة الكبرى. لمؤلفين آخرين، وجود لا تضارب في المصالح المالية.
Acknowledgments
وكان تمويل هذا المشروع من صندوق العلوم النمساوية FWF (رقم المشروع ف 25499-B13) ومنح أفق 2020 البحث الاتحاد الأوروبي في والابتكار برنامج تحت الاتفاق رقم 681032. وحصل الكاشف التالية من خلال "مرفق الأساسية تيترامير المعاهد الوطنية للصحة": فئة I MHC تيترامير للبروتين النووي فيروس التهاب الفم الحويصلي (رجيفيقجل).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
| Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
| Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
| Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
| Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
| Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
| Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
| Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
| Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
| Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
| Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
| Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
| Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
| Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
| 12.5 mL Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
| Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
| Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
| FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
| PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
| Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
| Sodium azide | Roth | K305.1 | |
| PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
| Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
| FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
| PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
| APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
| OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
| VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
| EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
| LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
| HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |
References
- Tober, R., et al. VSV-GP: a potent viral vaccine vector that boosts the immune response upon repeated applications. Journal of virology. 88 (9), 4897-4907 (2014).
- Muik, A., et al. Re-engineering vesicular stomatitis virus to abrogate neurotoxicity, circumvent humoral immunity, and enhance oncolytic potency. Cancer Reseaerch. 74 (13), 3567-3578 (2014).
- Eales, L. J., Farrant, J., Helbert, M., Pinching, A. J. Peripheral blood dendritic cells in persons with AIDS and AIDS related complex: loss of high intensity class II antigen expression and function. Clinical and Experimental Immunology. 71, 423-427 (1988).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Tetramers and Monomers. , Available from: https://www.mblintl.com/products/research/monomer-tetramers/filter/product_type/monomer,peptide,tetramer (2016).
- NIH Tetramer Core Facility. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/ (2010).
- Class I MHC Tetramer Preparation: Overview. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/support/protocols (2010).
- Wolfl, M., et al. Quantitation of MHC tetramer-positive cells from whole blood: evaluation of a single-platform, six-parameter flow cytometric method. Cytometry A. 57 (2), 120-130 (2004).
- Burrows, S. R., et al. Peptide-MHC class I tetrameric complexes display exquisite ligand specificity. The Journal of Immunology. 165 (11), 6229-6234 (2000).
- Sims, S., Willberg, C., Klenerman, P. MHC-peptide tetramers for the analysis of antigen-specific T cells. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 765-774 (2010).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. The Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Xie, Y., et al. A novel T cell-based vaccine capable of stimulating long-term functional CTL memory against B16 melanoma via CD40L signaling. Cellular & Molecular Immunology. 10 (1), 72-77 (2013).
- Nanjundappa, R. H., Wang, R., Xie, Y., Umeshappa, C. S., Xiang, J. Novel CD8+ T cell-based vaccine stimulates Gp120-specific CTL responses leading to therapeutic and long-term immunity in transgenic HLA-A2 mice. Vaccine. 30 (24), 3519-3525 (2012).
- Bowers, E. V., Horvath, J. J., Bond, J. E., Cianciolo, G. J., Pizzo, S. V. Antigen delivery by alpha(2)-macroglobulin enhances the cytotoxic T lymphocyte response. Journal of Leukocyte Biology. 86 (2), 1259-1268 (2009).
- Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. The Journal of Immunology. 88 (20), 12006-12016 (2014).
- Sakai, K., et al. Dendritic cell-based immunotherapy targeting Wilms' tumor 1 in patients with recurrent malignant glioma. Journal of Neurosurgery. 123 (4), 989-997 (2015).
- Rosaely, C. G., et al. Immune responses to WT1 in patients with AML or MDS after chemotherapy and allogeneic stem cell transplantation. International Journal of Cancer. 138 (7), 1792-1801 (2016).
- Shane, H. L., Reagin, K. L., Klonowski, K. D. The Respiratory Environment Diverts the Development of Antiviral Memory CD8 T Cells. The Journal of Immunology. , (2018).
- Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. The Journal of Visualized Experiments. (127), e56130 (2017).
- De Vries, I. J. M., et al. In situ detection of antigen-specific T cells in cryo-sections using MHC class I tetramers after dendritic cell vaccination of melanoma patients. Cancer Immunology Immunotherapy. 56 (10), 1667-1676 (2007).
- Tan, H. X., et al. Induction of vaginal-resident HIV-specific CD8 T cells with mucosal prime-boost immunization. Mucosal Immunology. , (2017).
- Huang, H., et al. CD8(+) T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), (2017).
- Hensel, M. T., et al. Selective Expression of CCR10 and CXCR3 by Circulating Human Herpes Simplex Virus-Specific CD8 T Cells. Journal of Virology. 91 (19), (2017).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- ACK Lysis Buffer. , Available from: http://www.cshprotocols.cshlp.org/content/2014/11/pdb.rec083295.short (2014).
- San Jose, E., Borroto, A., Niedergang, F., Alcover, A., Alarcon, B. Triggering the TCR complex causes the downregulation of nonengaged receptors by a signal transduction-dependent mechanism. Immunity. 12 (2), 161-170 (2000).
- Dietrich, J., Hou, X., Wegener, A. M., Geisler, C. CD3 gamma contains a phosphoserine-dependent di-leucine motif involved in down-regulation of the T cell receptor. EMBO Journal. 13 (9), 2156-2166 (1994).
- Schone, D., et al. Immunodominance of Adenovirus-Derived CD8(+) T Cell Epitopes Interferes with the Induction of Transgene-Specific Immunity in Adenovirus-Based Immunization. Journal of Virology. 91 (20), (2017).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide–MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Whelan, J. A., et al. Specificity of CTL Interactions with Peptide-MHC Class I Tetrameric Complexes Is Temperature Dependent. The Journal of Immunology. 163 (8), 4342-4348 (1999).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide–MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Denkberg, G., Cohen, C. J., Reiter, Y. Critical role for CD8 in binding of MHC tetramers to TCR: CD8 antibodies block specific binding of human tumor-specific MHC-peptide tetramers to TCR. The Journal of Immunology. 167 (1), 270-276 (2001).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. The Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 335-346 (2000).
- Tungatt, K., et al. Antibody stabilization of peptide-MHC multimers reveals functional T cells bearing extremely low-affinity TCRs. The Journal of Immunology. 194 (1), 463-474 (2015).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. Journal of Immunological Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Rius, C., et al. Peptide-MHC Class I Tetramers Can Fail To Detect Relevant Functional T Cell Clonotypes and Underestimate Antigen-Reactive T Cell Populations. The Journal of Immunology. 200 (7), 2263-2279 (2018).
- Xiao, Z., Mescher, M. F., Jameson, S. C. Detuning CD8 T cells: down-regulation of CD8 expression, tetramer binding, and response during CTL activation. The Journal of Experimental Medicine. 204 (11), 2667-2677 (2007).
- McMichael, A. J., O'Callaghan, C. A. A New Look at T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 187 (9), 1367-1371 (1998).
- Hunsucker, S. A., et al. Peptide/MHC tetramer-based sorting of CD8(+) T cells to a leukemia antigen yields clonotypes drawn nonspecifically from an underlying restricted repertoire. Cancer Immunology Research. 3 (3), 228-235 (2015).
- Pittet, M. J., et al. Ex vivo analysis of tumor antigen specific CD8+ T cell responses using MHC/peptide tetramers in cancer patients. International Immunopharmacology. 1 (7), 1235-1247 (2001).
- Cohen, C. J., et al. Isolation of neoantigen-specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3981-3991 (2015).
