Summary
Her presenterer vi en protokoll for ex vivo kvalitativ påvisning av antigen-spesifikke CD8+ T celler. Analyse er mulig med enkeltcelle suspensjoner fra organer eller små mengder blod. En rekke studier krever analyse av cytotoxic T celle svar (vaksinasjon og kreft immunterapi studier).
Abstract
Ved virusinfeksjon, antigen-spesifikke CD8+ cytotoxic T-celler (CTLer) oppstår og bidra til eliminering av infiserte celler å hindre spredning av patogener. Hyppigheten av antigen-spesifikke CTLer er derfor indikasjon på styrken av T celle respons mot en bestemt antigen. Slike analyser er viktig i grunnleggende immunologi, vaksineutvikling, kreft immunobiology og det adaptive immunologi. I feltet vaksine bestemmer CTL svaret rettet mot komponentene i en viral vektor co hvor effektiv generasjonen av antigen-spesifikke celler mot antigen rundt (dvs., transgene) er. Antigen-spesifikke CTLer angis enten ved stimulering med bestemte peptider etterfulgt av intracellulær cytokin flekker eller ved den direkte flekker av antigen-spesifikke T celle reseptorer (TCRs) og analyse av flowcytometri. Den første metoden er ganske tidkrevende siden det krever å ofre dyr å isolere celler fra organer. Dessuten krever det isolering av blod fra små dyr som er vanskelig å utføre. Sistnevnte er ganske rask, kan enkelt gjøres med små mengder blod og er ikke avhengig av spesifikke effektor funksjoner som cytolytic aktivitet. MHC tetramers er et ideelt verktøy for å oppdage antigen-spesifikke TCRs.
Her beskriver vi en protokoll for samtidig oppdage antigen-spesifikke sertifikatklareringslister for immunodominant peptidene av viral vektoren VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) og effekter av transgener (OVA, HPV 16 E7, eGFP) av MHC jeg tetramer flekker og flyt cytometri. Flekker er mulig direkte fra blod eller fra enkelt celle suspensjoner av organer, som milten. Blod eller enkeltcelle suspensjoner organer er ruges med tetramers. Etter med antistoffer mot CD3 og CD8 er antigen-spesifikke CTLer kvantifisert av flowcytometri. Eventuelt antistoffer mot CD43, CD44, CD62L eller andre kan være med å bestemme aktiviseringen rang av antigen-spesifikke CD8+T celler og å forskjellsbehandle naiv og Effektor celler.
Introduction
Målet med denne metoden er å vurdere svarfrekvensen cytotoksisk T lymfocytt (CTL) mot (flere) antigener i musen flyt cytometric analysen uten behov for tidkrevende peptid stimulering. Denne metoden analyserer fenotypen og antigen spesifisitet av CTL undergrupper, i en enkelt flekker. Vi optimalisert Major Histocompatibility Complex jeg (MHC jeg) tetramer flekker protokollen for å analysere effekten av ny vaksine tilnærminger, slik som VSV-GP, en ny variant av vesicular stomatitt viruset (VSV), der glykoprotein G av VSV har blitt erstattet av den glykoprotein GP av lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV)1,2. Humoral respons er en viktig avlesing av effektiviteten av en vaksine induksjon av en CTL reaksjon mot én eller flere antigener. Som konsekvent og holdbarhet av cellulær respons er viktig i denne sammenheng, er det gunstig å overvåke kinetics CTL svar fra samme dyret. Dette vil også føre til en reduksjon av dyr tall, et viktig aspekt om prinsippene i "3Rs"3. Dermed er analyse fra så lite som 20 µL av blod optimal for dette formålet.
Tetramers ble utviklet sent på 90-tallet4 og ble et viktig verktøy i T celle immunologi. Tetramers er fluorescently-merket komplekser av fire MHC jeg / peptid molekyler, som binder seg til TCRs, spesifikk for en enkelt peptid. I dag kan enten kjøpes ferdige5, tilpasset bestilt gratis på NIH Tetramer Core anlegget ved Emory University6 eller produsert i laboratoriet7. MHC jeg og II tetramers er tilgjengelig, dvs. for CD8+ og CD4+ T celler, henholdsvis. Styrken på tetramer flekker ligger i tidsbesparelser, ganske enkel og lett å standardisere8 protokoller og følsomhet9. Også, hvis arbeider med blod, dyr trenger ikke å bli ofret og minimale mengder eksempel kreves. Ett mål er ikke begrenset til en enkelt antigen, men flere antigener kan analyseres på en flekker når kombinere tetramers konjugert med ulike fluorophores. Nyoppdagede antigener, for eksempel fra peptid skjermer, kan enkelt innarbeides i tetramers og brukes for kvantifisering av T-celle delsett.
Tetramer flekker vil ikke gi informasjon om CTL-funksjonalitet (i.e., cytokin produksjon, funksjoner effektor), men bare spesifisitet. Få informasjon om T celle funksjonalitet, intracellulær cytokin flekker (ICS) eller enzym koblede Immuno sted (ELISpot) analysen må utføres8,10. Tetramer flekker og ICS/ELISpot, men er ikke redundant, men heller utfyller hverandre. In vitro stimulering å indusere cytokin produksjon for ICS/ELISpot vil endre opprinnelige T celle fenotypen. Tetramer flekker, i motsetning forlater T cellen urørt; opprinnelige fenotypen beholdes og kan analyseres. En annen stor fordel av tetramers er også at flekker kan kombineres med magnetiske sortering og berikelse av antigen-spesifikke celler11. Dette gir analyse av sjeldne befolkninger, samt dyrking av sorterte celler med definerte antigen-særegenheter – en funksjon som er ikke mulig med andre metoder.
Ved hjelp av protokollen beskrevet her tetramer flekker, samt ICS/ELISpot kan utføres fra ett organ, fordi bare svært lite materiale (blod: 20 µL, milt: 1 x 106 celler) kreves for tetramer flekker. Imidlertid avhengig av frekvensen av antigen-spesifikke cellene rundt styrken til de respektive TCR og eksperimentelle sammenheng, hvor mye celler kreves må skaleres eller magnetiske berikelse må brukes.
Tetramers er mye brukt, for eksempel å vurdere effektiviteten av (antitumor) vaksiner12,13,14,15 eller immunterapi16,17, fenotypiske analyse og romlig lokalisering av antigen-spesifikke T-celle delsett18,19,20,21,22,23. Metoden beskrevet her er egnet for studier som mål å inkludere kvantifisering og fenotypiske analyse av murine antigen-spesifikke CD8+ T celler i sine analyser på en rask og enkel måte.
Protocol
Alle metodene beskrevet ble utført i samsvar med den østerrikske nasjonale dyr eksperimentering loven ("Tierversuchsgesetz"), og dyr prøve tillatelse ble gitt av Østerrikes nasjonale myndigheter.
1. buffer forberedelse og samling
Merk: Musen påkjenningen brukes, avhenger av epitope analysert. Velg en passende tetramer som binder til en MHC type uttrykt i mus, f.eks, H - 2Kb for C57BL/6 mus. Kjønn og alder av dyrene avhenger av vitenskapelige spørsmålet. For de fleste av eksperimenter beskrevet her, bruk kvinnelige mus for 6-8 ukens av alderen på begynnelsen av eksperimentet, i.e., første immunisering.
- Forberede FACS Buffer (fosfat-bufret saltvann (PBS) + 1% fosterets kalv serum (FCS) + 0,1% Natriumazid + 2 mM Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og FACS fikse buffer (1,5% (v/v) formaldehyd i PBS).
Merk: Det anbefales at begge buffere er forberedt på forhånd. Lagret på 4 ° C før bruk. - Blood: Samle 20 µL av blod per musen fra halen åre musen i EDTA-belagt rør, som beskrevet tidligere24.
Merk: Blod kan også samles av andre ruter, f.eks, vena facialis eller retro-orbital sinus. Metoden for blodgivning har imidlertid med nasjonale dyr eksperimentering lov og dyr prøveversjoner. Samling av blod fra halen venen er ideell for studier der gjentatte ganger små mengder blod er nødvendig. Tilleggsmateriale kreves for kompensasjon kontroller og kontrollen ikke-farget. - Milt: Isolere orgelet, og med hjelp av stempelet til en sprøyte, trykk gjennom en 70 nm og 40 µm celle sil. Utføre lysis av erytrocytter, som beskrevet i trinn 6 og antall. Juster til konsentrasjonen til 1 x 107 celler/mL i PBS. Per eksempel kreves 1 x 106 celler.
Merk: Alltid inkludere noen mock vaksineres eller kontrollere vektor vaksineres dyr som negativ kontroll. For ovalbumin (OVA)-tetramer, et utvalg av OT-1 mus kan brukes som positive kontroll. Ikke glem unstained kvinne og kompensasjon kontroller i beregningen. Om nødvendig, kan prøver fra forskjellige dyr i eksperimentet samordnes for dette. - Etter prøvetakingen, direkte fortsette med den flekker.
2. flekk oppsett
- Forberede en FACS tube for hvert utvalg. Merk rør riktig og overføre 100 μL orgel suspensjon (1 x 106 celler) eller 20 μL av blod i hver retning.
- Milt: Sentrifuge for 5 min 600 x g på 4-8 ° C og kast nedbryting. Vortex å resuspend celle pellets.
Merk: Dette vil resultere i et gjenværende volum på rundt 20 µL, lignende volumet for blodprøvene. - Forberede en FACS tube en kompensasjon prøve for hver kanal som skal brukes også. Forberede en flere eksempler som en unstained kvinne kontroll.
3. tetramer flekker
-
For hver prøve, bruk 50 μL av tetramer fortynning. Foreslåtte tetramers og optimalisert fortynninger, se tabell 1.
Merk: Når du arbeider med tetramers eller antistoffer, slå av lyset sikkerhet regjering og beskytte prøvene fra lys.- Forberede en tube med FACS buffer (volum = 50 μL × antall prøver pluss ytterligere 10% av det totale volumet å kompensere for pipettering feil).
- Legge til tetramer(s) på optimal fortynning, som vist i tabell 1. Vortex løsningen.
Merk: Når du bruker hele antistoff panelet (CD3, CD8, CD43, CD44, CD62L) med nevnte fluorophores, kan to tetramers (i PE og APC) være inkludert. Begge tetramers kan kombineres i en enkelt flekker, dvs, farging av celler med begge tetramers kan utføres samtidig.
| Tetramer | Peptid sekvens | Allelet | Fluorophore | Fortynning |
| MHC JEG / OVA | SIINFEKL | H - 2Kb | APC | 1:25 |
| MHC JEG/VSV-NP | RGYVYQGL | H - 2Kb | PE | 1:25 |
| MHC JEG / EGFP | HYLSTQSAL | H-2Kd | PE | 1:25 |
| MHC JEG/LCMV-GP | KAVYNFATC | H-2Db | APC | 1:25 |
| MHC JEG / HPV 16 E7 | RAHYNIVTF | H-2Db | APC | 1:10 |
Tabell 1: tetramers og optimal fortynninger. Anbefalte tetramers for noen immunodominant peptider modell antigener (Ovalbumin (OVA) og forbedret grønne fluorescerende protein (eGFP)) eller patogen komponenter (Vesicular stomatitt virus (VSV) nucleoprotein (NP), lymfatisk Choriomeningitis Virus (LCMV ) Glykoprotein (GP) og humant papillomavirus (HPV) E7 oncoprotein (E7)). For hver, peptid sekvens og tilsvarende allelet vises det også anbefalt fluorophore og optimalisert fortynning.
- Legge til 50 μL av tetramer fortynning hvert utvalg og vortex forsiktig. Legge til FACS buffer (uten tetramer) kompensasjon kontroller og unstained kvinne prøven.
- Inkuber prøver for 20 min på 37 ° C, beskyttet mot lyset. For å sikre en problemfri overgang fra tetramer til antistoff flekker, klargjør antistoff blandingen som beskrevet i trinn 4 under inkubasjon tid.
Merk: For hver enkelt tetramer må optimale forhold (fortynning, inkubasjonstiden og temperatur) justeres.
4. forberedelse av antistoffer
-
For hver prøve, forberede 50 µL av antistoff blanding.
- Forberede en tube med FACS buffer (volum = 50 μL × antall prøver pluss ytterligere 10% av det totale volumet å kompensere pipettering feil).
- Legge til antistoffer i fortynninger som vist i tabell 2.
Merk: Avhengig av vitenskapelige spørsmålet, kan andre markør kombinasjoner bortsett fra det som er beskrevet her brukes. Pass på å alltid inkludere antistoffer mot CD3 og CD8 i panelet. - Vortex løsningen.
| Antistoff | Fluorophore | Fortynning | µg/sample | Markør |
| CD3 | PE-Cy7 | 1:200 | 0,05 | Sertifikatklareringslister (CD3+CD8+) |
| CD8 | Pacific Blue | 1:750 | 0.013 | |
| V450 | 1: 100 | 0,1 | ||
| CD43 | FITC | 1: 100 | 0,25 | Aktivisering (CD43+) |
| CD44 | PE-Cy5 | 1:250 | 0,04 | Naive (CD44-CD62L+) & effektor (CD44+CD62L-) |
| CD62L | APC-Cy7 | 1:500 | 0,02 |
Tabell 2: antistoffer brukes i denne protokollen og optimal fortynninger. Anbefalte overflate markører (CD3, CD8, CD43, CD44 og CD62L) vises i den første kolonnen. For hver vises den anbefalte fluorophore, optimalisert fortynning og beløpet av antistoff/prøve. I den siste kolonnen angis celle type identifisert med hver indikator.
-
Forberede antistoffer kompensasjon kontroller. Bruk et antistoff mot CD8 i respektive farge for hver erstatning kontroll.
- For hver kanal, forberede en rør med 200 μL FACS bufferen og tilsett 1 μL av en 1:200 fortynning antistoff mot CD8 i respektive farge.
- Vortex rørene.
- Gå rett med flekker.
5. farging av prøver
- Vask prøver en gang ved å legge ~ 1 mL av FACS buffer og sentrifuge for 5 min på 600 x g på 4-8 ° C. Etter sentrifugering, forkaste nedbryting og renne av gjenværende flytende på en stabel med papirhåndklær.
Merk: Når du arbeider med blod, være forsiktig når drenering av gjenværende væske. Før lysis av erytrocytter, blod vil ikke holde seg til bunnen av FACS røret. Alternativt Sug opp nedbryting. - Legge til 50 μL av antistoff blandingen i hver celle pellets og vortex forsiktig.
- Legge til 50 μL av hver kompensasjon i cellen pellet tilsvarende kompensasjon kontroll og vortex forsiktig.
- Tilsett 50 μL av FACS buffer celle pellet unstained kvinne kontroll og vortex forsiktig.
- Inkuber alle prøver for 30 min ved 4 ° C, beskyttet mot lyset.
- Når du arbeider med organer: hopp over trinn 6. Vask en gang ved å legge til ~ 1-2 mL FACS buffer og sentrifuge for 5 min 600 x g på 4-8 ° C. Etter sentrifugering, forkaste nedbryting og renne av gjenværende flytende på en stabel med papirhåndklær.
- Når du arbeider med blod: Fortsett med trinn 6 (lysis av erytrocytter).
6. lysis av erytrocytter
- Legg til 500 μL ACK (Ammonium-klor-kalium) buffer25 hvert utvalg og forsiktig vortex.
Merk: ACK buffer vil føre til osmotisk hevelse og lyse, spesielt av erytrocytter. - Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Legge 1 mL av FACS buffer og sentrifuge for 5 min på 600 x g på 4-8 ° C. Etter sentrifugering, forkaste nedbryting og renne av gjenværende væske på en stabel med papirhåndklær.
Merk: Når pellet er ganske rød, gjenta lysis av erytrocytter. - Vask en gang ved å legge til ~ 1-2 mL FACS buffer og sentrifuge for 5 min 600 x g på 4-8 ° C. Etter sentrifugering, forkaste nedbryting og renne av gjenværende flytende på en stabel med papirhåndklær.
7. flyt Cytometric måling og analyse
- Tilsett 150-300 μL FACS fikse bufferen hver rør og bland av vortexing. For 20 µL av blod er 150 µL bufferen tilstrekkelig.
Merk: Før fiksering, kontroller at cellene er godt nytt suspendert for å unngå dannelse av klumper. Fortsett med måling av cytometric så raskt som mulig. - Måle kompensasjon kontrollene og korrigere eventuelle spectral overlapper.
-
Definere sekvensielle porter, som vist i figur 1 for å velge for CD3+/CD8+ celler.
- Gate på lymfocytter med fremover og sidelengs xy (område) (ikke logaritmisk skala).
- I lymfocytt befolkningen, gate på enkeltceller bruker frem scatter bredde vs området (ikke logaritmisk skala).
- Tegne enkelt celle lymfocytter bruke CD3 og CD8 kanaler (logaritmisk skala). Identifisere CD8+ T celler av gating på CD3+/CD8+ celler.
- Plot CD8+ vs Tetramer+ celler og gate på CD8+ Tetramer+ cellene, som vist i figur 2.
- Hvis mulig, registrere 20.000 celler (minst 5 000 celler fra blod) i CD3+/CD8+ gate for hver prøve og lagre som en FCS-fil.
Merk: Mengden av celler til posten må justeres i henhold til frekvensen av antigen-spesifikke cellene rundt. - Analysere FCS filer med riktig analyseprogramvare. Bruk gating strategien, som beskrevet ovenfor (inndelingen 7.3) og kvantifisere CD8+ Tetramer+ celler.
Representative Results
Figur 1 viser hvordan du gate riktig på målcellene i denne protokollen, nemlig CD3+/CD8+ celler. Det er å merke seg at aktivert celler ofte downregulate de T-celle reseptor26,27 , og derfor CD3lav celler bør også inkluderes i den gating. Etter gating CD3+/CD8+ celler, tetramer positive celler kan identifiseres (figur 2). Representant blotter for en negativ kontroll (naiv) musen, samt dyr enten vaksinert med enten egg-sekresjon Adenovirus 5 (Adeno-OVA) eller OVA-uttrykke VSV-GP (VSV-GP-OVA) vises. Sett i de lavere blots to forskjellige kan tetramers kombineres i samme røret til farging. Dette tillater samtidig kvantifisering av to forskjellige CTL særegenheter: virus-spesifikke (VSV N) og transgene-spesifikke (OVA) CTLer. Vi bekreftet at enkle og doble tetramer stainings gi tilsvarende stor positiv celler for hver tetramer. Bruker denne protokollen, andre virus-spesifikke (f.eks., LCMV GP, HPV 16 E7) eller transgene-spesifikke (f.eks., GFP) T celle populasjoner kan være analysert (supplerende figur 1). Supplerende tabell 1resultater for fem dyr etter immunisering med VSV-GP-OVA vises, indikerer robust tetramer flekker.
Figur 1: Representant gating strategi å analysere CD8+ T celler i blodet. Skjematisk fremstilling av det gating strategien anvendt for flyt cytometric analyse. Etter tetramer flekker og flyt cytometric måling, ble data analysert. Lymfocytter ble identifisert med fremover og sidelengs xy (område) (ikke logaritmisk skala). Fra de, ble enkeltceller identifisert ved å bruke frem scatter bredde vs området (ikke logaritmisk skala). CD8+ T celler ble identifisert av gating på CD3+/CD8+ celler (logaritmisk skala). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant gating strategi å kvantifisere OVA - og N-spesifikk CD8+ T celler i blodet. Skjematisk fremstilling av det gating strategien anvendt for flyt cytometric kvantifisering av tetramer+ celler. CD3+/CD8+ celler ble brukt for tetramer analyse. Øverste og midterste panelet: CD8 markøren var plottet mot respektive tetramer (logaritmisk skala). Nedre panel: begge tetramers var plottet mot hverandre (logaritmisk skala). Venstre: kontroll (naiv) mus; midten: musen ble vaksinert med OVA-sekresjon Adenovirus 5 (Adeno-OVA); høyre: musen ble vaksinert med ovalbumin (OVA)-uttrykke VSV-GP (VSV-GP-OVA). Blodet ble samlet inn fra halen blodåre, på dagen 7 etter immunisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: Representant resultatet av CD3+/CD8+ tetramer+ celler etter vaksinasjon. Skjematisk fremstilling av flyt cytometric kvantifisering av tetramer+ celler. CD3+/CD8+ celler ble brukt for tetramer analyse og CD8 markøren var plottet mot respektive tetramer (logaritmisk skala). Venstre: mus var naiv, høyre: mus ble vaksinert med VSV-GP (øvre panel), forbedret Green fluorescerende Protein (eGFP)-uttrykke VSV-GP (midten panel) eller VSV-GP uttrykke humant papillomavirus (HPV) E7 oncoprotein (E7) (nedre panel). Blodet ble samlet inn fra halen blodåre på dag 7 etter immunisering og farget med tetramers (LCMV-GP, eGFP og HPV E7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En stor fordel av protokollen beskrevet her er at T celle svar fra samme musen kan følges over tid som bare små mengder av blod er nødvendig for hver måling. Figur 3 viser eksemplarisk resultater for T celle svar over tid. I tillegg til mengder av antigen-spesifikke sertifikatklareringslister, kan deres fenotypen også analyseres ved hjelp av denne protokollen (Figur 4).
Figur 3: Representant resultatet av CD8+ T celle kinetic i blod etter vaksinasjon. Skjematisk fremstilling av det gating strategien anvendt for flyt cytometric kvantifisering av tetramer+ celler. CD3+/CD8+ celler ble brukt for tetramer analyse og begge tetramers var plottet mot hverandre (logaritmisk skala). Øvre paneler: mus ble vaksinert med OVA-sekresjon Adenovirus 5 (Adeno-OVA); lavere paneler: mus ble vaksinert med ovalbumin (OVA)-uttrykke VSV-GP (VSV-GP-OVA). Blodet ble samlet inn fra halen blodåre, på dag 3, 7, 10 og 14 etter immunisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representant resultatet av CD8+ T celle aktivering og differensiering inn naiv og Effektor celler etter vaksinasjon. Skjematisk fremstilling av det gating strategien anvendt for flyt cytometric kvantifisering av aktivert (CD43+), naiv (CD44-/CD62L+) og effektor (CD44+/CD62L-) CD3+/CD8+ celler () logaritmisk skala). Venstre: kontroll (naiv) mus; midten: musen ble vaksinert med OVA-sekresjon Adenovirus 5 (Adeno-OVA); høyre: musen ble vaksinert med ovalbumin (OVA)-uttrykke VSV-GP (VSV-GP-OVA). Blodet ble samlet inn fra halen blodåre, på dagen 7 etter immunisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Mus # | % CD43+ | % VSV-N Tetramer+ | % OVA Tetramer+ | |
| håne | 1 | 1.7 | 0.45 | 0.41 |
| 2 | 0.77 | 0.69 | 0,15 | |
| 3 | 1,34 | 0,35 | 0.31 | |
| 4 | 1.68 | 0,83 | 0.26 | |
| 5 | 0.84 | 0.47 | 0,23 | |
| VSV-GP-OVA | 1 | 23 | 13.2 | 3.69 |
| 2 | 32.6 | 15.9 | 3,54 | |
| 3 | 22.1 | 11,7 | 2.43 | |
| 4 | 15.1 | 8.89 | 1,79 | |
| 5 | 29.1 | 14.7 | 5.64 |
Ekstra tabell 1: Prosentandeler av aktivert og antigen-spesifikke CD3+/CD8+ celler etter vaksinasjon. Mus var enten naive eller vaksinert med ovalbumin (OVA)-uttrykke VSV-GP (VSV-GP-OVA) (n = 5). Blodet ble samlet inn fra halen blodåre på dag 7 etter immunisering og farget med tetramers (VSV-N og OVA). Aktivert (CD43+) og antigen-spesifikke (tetramer+) CD3+/CD8+ celler kvantifisert av flowcytometri.
Discussion
Tetramer flekker er en ganske enkel og ukomplisert protokoll analysere fenotypen og peptid spesifisitet av en T lymfocytt. Bruken av blod for analyse, som beskrevet her, er minimalt invasiv og tillater kontinuerlig overvåking, for eksempel i vaksinasjon studier. I feltet vaksinasjon er kvantifisering av vektor - og antigen-spesifikke tiltak av interesse, som vektor-spesifikke tiltak kan hindre en effektiv immunrespons mot vaksine antigen28. Merk er at med protokollen beskrevet her, populasjonene kan kvantifiseres samtidig i en enkelt tetramer flekker, og dermed redusere flekker variasjon og utvalg beløp. Noen skritt må imidlertid være forsiktig måling og pålitelige data. Hvis bruker blod fra halen venen for analyse, burde en sikre å forvarme dyrene å indusere vasodilatasjon24. Dermed tilstrekkelig blod kan samles på kort tid og stress på dyrene reduseres for å analysen er mye bedre sammenlignet hvis blod samles sakte. Etter prøvetakingen (blod eller organer) anbefales direkte flekker også å unngå falske negative resultater på grunn av TCR downregulation. Det samme gjelder for alle påfølgende trinnene: prosedyren skal ikke avbrytes og alle vask trinnene redusert til færrest (som nevnt i protokollen). For å sikre riktig flekker, bør omsorg tas til vortex alle løsninger og prøver før og etter inkubasjon. Dette er spesielt viktig før fikse prøvene for å unngå klumper av celler.
Når det gjelder å endre protokollen, kan andre overflate markører og tetramers brukes, avhengig av formålet med analysen. Reagenser så må imidlertid være titreres, optimalt i kombinasjon med hele flekker panelet. For noen av tetramers som er angitt her, optimalisering avslørte at vi kan øke fortynning anbefalt av produsenten (1:10 anbefalt, optimalisert 1:25) (tabell 1). For å kompensere spectral overlapping, kan kompensasjon perler brukes i stedet for farget celler. Angående valg av tetramer-kombinert fluorochrome, en skal forestille seg for å bruke lys fluorochromes, som dette forenkler detection - spesielt når signalet er lav. Som Dolton og kolleger29, vil vi bruke PE - eller APC-kombinert tetramers, som kan kombineres i en enkelt flekker og CD8 perfekt+ T celler med en enkelt antigen spesifisitet kan være pent oppdaget (figur 2). Om temperatur og inkubasjon ganger, en rekke tetramer flekker forhold eksisterer. I vår optimaliseringsprosessen, vi løst problemet og utført tetramer flekker på ulike forhold (f.eks 4 ° C, romtemperatur eller 37 ° C). Fra resultatene, anbefaler vi stain etter 20 min på 37 ° C, som er i samsvar med litteratur30,31. Langvarig inkubasjon bør unngås, da dette kan føre til internalization tetramer30 og falske negative resultater.
Valg av rett antistoffer for påvisning av CD8+ celler er en annen viktig sak, som må nøye vurdert (og potensielt tilpasset). Dette oppstår fra faktum at enkelte anti-CD8 antistoff kloner blokk binding av tetramers til TCR, menneskelige32 samt mus33 prøver. For våre tetramer flekker protokollen, vi valgte klone 53-6,7 stain for murine CD8+ celler – en klone som blokkerer ikke, men heller forbedrer tetramer flekker.
Tetramer flekker er ganske ukomplisert når analysere fremtredende immunreaksjoner på toppen av T celle svaret, for eksempel. Det kan imidlertid være populasjoner som er litt mer 'problematisk'. Slike eksempler celler spesifikke for lav affinitet antigener (svulst, selv), nylig aktivert celler som senere ned-regulert deres reseptorer eller sjeldne celle undergrupper (f.eks. naiv forløper eller minne celle populasjoner). I disse tilfellene kan det klassisk tetramer flekker protokollen må forbedret eller kombinert med andre metoder. For eksempel protein kinase inhibitor (PKI) dasatinib hemmer TCR internalisering og inkluderes før tetramer flekker. Tetramers kan også bli stabilisert av inkludert anti-fluorochrome unconjugated primære Abs etter tetramer flekker. I tillegg kan du øke fluorescens intensitet med tillegg av en andre anti-Ab fluorochrome-konjugerte Ab29,34,35,36. Vi optimalisert betingelsene selektivt for tetramers angitt i denne protokollen og inkluderte ikke PKI eller ekstra Abs. For alle andre tetramer har imidlertid optimale forhold justeres individuelt. Når det gjelder sjeldne befolkninger må tetramer flekker kombineres med magnetiske berikelse11.
For å lette og validere FACS analyse av tetramer flekker, skal negative og positive kontroller inkluderes. Som en negativ kontroll flekken vi alltid celler med en naiv mus på den samme stammen med våre tetramer rundt. Alternativt kan eksempler være farget med tetramers med irrelevante peptider, men med den samme fluorochrome som tetramer av interesse. Slike kontroller er avgjørende å ekskludere falske positive signaler, f.eks., fra døende celler. I tillegg er det anbefalt å inkludere en live/dead flekk, som propidium iodide (PI). Dette er av spesiell betydning hvis cellene ikke er flekket rett etter isolasjon. En annen strategi for å fjerne autofluorescence bakgrunnen kan være å inkludere flere T celle markører i én kanal. Ved å ekskludere celler positivt i denne kanalen, kan T celle populasjoner utelukkes. Som en positiv, kan et utvalg fra en OT-1 musen brukes for OVA tetramer, for eksempel. For andre tetramers, har dette velges individuelt (f.eks., eksempel fra en mus, som var vaksineres flere ganger). Både andre37, vi også ser en ned-regulering av CD8 reseptoren under CTL aktivering på dag 7 av effektor T celle respons. For å unngå tap av aktivert tetramer+ effektor T celler, anbefaler vi derfor for å inkludere CD8lav cellene i analysen (minst hvis måle i effektor fase).
Kvaliteten og mengde informasjon en kan hente fra denne protokollen er avhengig av kunnskap om antigen studier, tilgjengelighet og spesifisitet av tetramer og kvaliteten på FACS maskinen (antall lasere og tilgjengelig detektorer). Hvis arbeider med dyr prøver, er variant i immunforsvaret naturlige og uunngåelige. Derfor, for å få meningsfulle resultater fra tetramer flekker, minst 3-5 dyr skal analyseres. Hvis gjort det, gir protokollen beskrevet her pålitelig og reproduserbar resultater (eksemplarisk resultatet av et eksperiment kan bli funnet i Tilleggstabellen 1). Som nevnt før, denne metoden er perfekt å kvantifisere fenotypen og antigen spesifisitet av CD8+ T celler (Figur 3, 4; Supplerende figur 1), ikke bare i musen men også hos mennesker. Men analysere CD8 fungerer+ T-celler effektor som granzyme-indusert celledød, ICS og/eller ELISpot må utføres. Imidlertid bør man huske på at T celle funksjoner, målt ved i vitro stimulering ikke kanskje representerer den faktiske situasjonen i vivo. In vivo, et undertrykkende miljø kan hindre T celle-funksjoner som er målt i vitro.
På sin egen tetramer flekker ikke gir all informasjon, men det utfoldet for å bli en viktig metode for å beskrive T celle svar og kvantifisere T-celle delsett i vitro i en svært følsom måte38. Tetramers kan bare brukes å kvantifisere visse undergrupper, men også for å isolere de39, lokalisere dem av i situ hybridisering19,20 og studere lav-affinitet antigener, slik som tumor-assosiert40, 41. siden oppdagelsen av tetramer teknologi4, tetramer flekker har blitt et uunnværlig verktøy i T-celle analyse og utvalget av programmer.
Disclosures
Dorothee von Laer er en oppfinner av VSV-GP og minoritet aksjer i biotech selskapet ViraTherapeutics GmbH, som inneholder immaterielle rettigheter for VSV-GP. Andre forfattere finnes ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av FWF østerrikske Science Fund (prosjektnummeret P 25499-B13) og EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under gi avtalen nr. 681032. Følgende reagensen var oppnådd gjennom NIH Tetramer Core anlegget: klasse I MHC Tetramer for vesicular stomatitt virus nucleoprotein (RGYVYQGL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
| Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
| Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
| Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
| Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
| Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
| Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
| Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
| Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
| Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
| Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
| Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
| Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
| Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
| 12.5 mL Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
| Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
| Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
| FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
| PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
| Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
| Sodium azide | Roth | K305.1 | |
| PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
| Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
| FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
| PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
| APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
| OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
| VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
| EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
| LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
| HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |
References
- Tober, R., et al. VSV-GP: a potent viral vaccine vector that boosts the immune response upon repeated applications. Journal of virology. 88 (9), 4897-4907 (2014).
- Muik, A., et al. Re-engineering vesicular stomatitis virus to abrogate neurotoxicity, circumvent humoral immunity, and enhance oncolytic potency. Cancer Reseaerch. 74 (13), 3567-3578 (2014).
- Eales, L. J., Farrant, J., Helbert, M., Pinching, A. J. Peripheral blood dendritic cells in persons with AIDS and AIDS related complex: loss of high intensity class II antigen expression and function. Clinical and Experimental Immunology. 71, 423-427 (1988).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Tetramers and Monomers. , Available from: https://www.mblintl.com/products/research/monomer-tetramers/filter/product_type/monomer,peptide,tetramer (2016).
- NIH Tetramer Core Facility. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/ (2010).
- Class I MHC Tetramer Preparation: Overview. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/support/protocols (2010).
- Wolfl, M., et al. Quantitation of MHC tetramer-positive cells from whole blood: evaluation of a single-platform, six-parameter flow cytometric method. Cytometry A. 57 (2), 120-130 (2004).
- Burrows, S. R., et al. Peptide-MHC class I tetrameric complexes display exquisite ligand specificity. The Journal of Immunology. 165 (11), 6229-6234 (2000).
- Sims, S., Willberg, C., Klenerman, P. MHC-peptide tetramers for the analysis of antigen-specific T cells. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 765-774 (2010).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. The Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Xie, Y., et al. A novel T cell-based vaccine capable of stimulating long-term functional CTL memory against B16 melanoma via CD40L signaling. Cellular & Molecular Immunology. 10 (1), 72-77 (2013).
- Nanjundappa, R. H., Wang, R., Xie, Y., Umeshappa, C. S., Xiang, J. Novel CD8+ T cell-based vaccine stimulates Gp120-specific CTL responses leading to therapeutic and long-term immunity in transgenic HLA-A2 mice. Vaccine. 30 (24), 3519-3525 (2012).
- Bowers, E. V., Horvath, J. J., Bond, J. E., Cianciolo, G. J., Pizzo, S. V. Antigen delivery by alpha(2)-macroglobulin enhances the cytotoxic T lymphocyte response. Journal of Leukocyte Biology. 86 (2), 1259-1268 (2009).
- Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. The Journal of Immunology. 88 (20), 12006-12016 (2014).
- Sakai, K., et al. Dendritic cell-based immunotherapy targeting Wilms' tumor 1 in patients with recurrent malignant glioma. Journal of Neurosurgery. 123 (4), 989-997 (2015).
- Rosaely, C. G., et al. Immune responses to WT1 in patients with AML or MDS after chemotherapy and allogeneic stem cell transplantation. International Journal of Cancer. 138 (7), 1792-1801 (2016).
- Shane, H. L., Reagin, K. L., Klonowski, K. D. The Respiratory Environment Diverts the Development of Antiviral Memory CD8 T Cells. The Journal of Immunology. , (2018).
- Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. The Journal of Visualized Experiments. (127), e56130 (2017).
- De Vries, I. J. M., et al. In situ detection of antigen-specific T cells in cryo-sections using MHC class I tetramers after dendritic cell vaccination of melanoma patients. Cancer Immunology Immunotherapy. 56 (10), 1667-1676 (2007).
- Tan, H. X., et al. Induction of vaginal-resident HIV-specific CD8 T cells with mucosal prime-boost immunization. Mucosal Immunology. , (2017).
- Huang, H., et al. CD8(+) T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), (2017).
- Hensel, M. T., et al. Selective Expression of CCR10 and CXCR3 by Circulating Human Herpes Simplex Virus-Specific CD8 T Cells. Journal of Virology. 91 (19), (2017).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- ACK Lysis Buffer. , Available from: http://www.cshprotocols.cshlp.org/content/2014/11/pdb.rec083295.short (2014).
- San Jose, E., Borroto, A., Niedergang, F., Alcover, A., Alarcon, B. Triggering the TCR complex causes the downregulation of nonengaged receptors by a signal transduction-dependent mechanism. Immunity. 12 (2), 161-170 (2000).
- Dietrich, J., Hou, X., Wegener, A. M., Geisler, C. CD3 gamma contains a phosphoserine-dependent di-leucine motif involved in down-regulation of the T cell receptor. EMBO Journal. 13 (9), 2156-2166 (1994).
- Schone, D., et al. Immunodominance of Adenovirus-Derived CD8(+) T Cell Epitopes Interferes with the Induction of Transgene-Specific Immunity in Adenovirus-Based Immunization. Journal of Virology. 91 (20), (2017).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide–MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Whelan, J. A., et al. Specificity of CTL Interactions with Peptide-MHC Class I Tetrameric Complexes Is Temperature Dependent. The Journal of Immunology. 163 (8), 4342-4348 (1999).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide–MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Denkberg, G., Cohen, C. J., Reiter, Y. Critical role for CD8 in binding of MHC tetramers to TCR: CD8 antibodies block specific binding of human tumor-specific MHC-peptide tetramers to TCR. The Journal of Immunology. 167 (1), 270-276 (2001).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. The Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 335-346 (2000).
- Tungatt, K., et al. Antibody stabilization of peptide-MHC multimers reveals functional T cells bearing extremely low-affinity TCRs. The Journal of Immunology. 194 (1), 463-474 (2015).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. Journal of Immunological Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Rius, C., et al. Peptide-MHC Class I Tetramers Can Fail To Detect Relevant Functional T Cell Clonotypes and Underestimate Antigen-Reactive T Cell Populations. The Journal of Immunology. 200 (7), 2263-2279 (2018).
- Xiao, Z., Mescher, M. F., Jameson, S. C. Detuning CD8 T cells: down-regulation of CD8 expression, tetramer binding, and response during CTL activation. The Journal of Experimental Medicine. 204 (11), 2667-2677 (2007).
- McMichael, A. J., O'Callaghan, C. A. A New Look at T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 187 (9), 1367-1371 (1998).
- Hunsucker, S. A., et al. Peptide/MHC tetramer-based sorting of CD8(+) T cells to a leukemia antigen yields clonotypes drawn nonspecifically from an underlying restricted repertoire. Cancer Immunology Research. 3 (3), 228-235 (2015).
- Pittet, M. J., et al. Ex vivo analysis of tumor antigen specific CD8+ T cell responses using MHC/peptide tetramers in cancer patients. International Immunopharmacology. 1 (7), 1235-1247 (2001).
- Cohen, C. J., et al. Isolation of neoantigen-specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3981-3991 (2015).
