Summary
Hier presenteren we een protocol voor de ex vivo kwalitatieve detectie van antigeen-specifieke CD8+ T cellen. Analyse is mogelijk met eencellige schorsingen van organen of van kleine hoeveelheden bloed. Een breed scala van studies vereisen de analyse van de reacties van de cytotoxische T-cel (vaccinatie en kanker immunotherapie studies).
Abstract
Na virale infectie, antigeen-specifieke CD8+ cytotoxische T-cellen (CTL's) ontstaan en bij te dragen tot de opheffing van geïnfecteerde cellen dat de verspreiding van ziekteverwekkers voorkomen. De frequentie van antigeen-specifieke CTL's is daarom een indicatie van de sterkte van de T-cel-reactie tegen een specifiek antigeen. Een dergelijke analyse is belangrijk in fundamentele immunologie, ontwikkeling van een vaccin, Immunobiologie van kanker en de adaptieve immunologie. In het veld vaccin bepaalt de CTL reactie gericht tegen onderdelen van een virale vector mede hoe effectief de generatie van antigeen-specifieke cellen tegen het antigeen van belang (dat wil zeggen, transgenic) is. Antigeen-specifieke CTL's kunnen worden gedetecteerd door stimulatie met specifieke peptiden gevolgd door intracellulaire cytokine kleuring of door de directe kleuring van antigeen-specifieke T cel receptoren (TCRs) en analyse door stroom cytometry. De eerste methode is nogal tijdrovend, omdat het vereist offeren van dieren te isoleren van de cellen van organen. Het vereist ook, isolatie van bloed van kleine dieren die is moeilijk uit te voeren. De laatste methode is redelijk snel, kan gemakkelijk worden gedaan met een kleine hoeveelheid bloed en is niet afhankelijk van specifieke effector functies, zoals cytolytische activiteit. MHC tetramers zijn een ideaal hulpmiddel om op te sporen van antigeen-specifieke TCRs.
Hier beschrijven we een protocol op te sporen tegelijk antigeen-specifieke CTL's voor de immunodominante peptiden van de virale vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) en transgenen (eicellen, HPV 16 E7, eGFP) door MHC ik tetrameer kleuring en stroom cytometry. Kleuring is mogelijk direct bloed of vanuit één cel schorsingen van organen, zoals milt. Bloed of eencellige schorsingen van organen worden geïncubeerd met tetramers. Na kleuring met antilichamen tegen CD3 en CD8, zijn antigeen-specifieke CTL's gekwantificeerd door stroom cytometry. Optioneel, antilichamen tegen CD43, CD44, CD62L of anderen kunnen worden opgenomen om te bepalen van de status van de activering van antigeen-specifieke CD8+T cellen en te discrimineren tussen naïef en effector cellen.
Introduction
Het doel van deze methode is om te beoordelen van de frequentie van cytotoxische T-lymfocyten (CTL) Reacties op (meerdere) antigenen in de muis door flow analyse van de cytometrische zonder de behoefte aan tijdrovende peptide stimulatie. Deze methode analyseert de specificiteit van het fenotype en antigeen van CTL deelverzamelingen, in een enkele kleuring. We het Major Histocompatibility Complex geoptimaliseerd ik (MHC ik) tetrameer kleuring protocol om te analyseren van de werkzaamheid van nieuwe benaderingen van het vaccin, zoals VSV-GP, een nieuwe variant van de vesiculaire stomatitis-virus (VSV), waar de glycoproteïne G van VSV is vervangen door de glycoproteïne GP voor de lymfatische choriomeningitis virus (LCMV)1,2. Naast de humorale respons is een belangrijke uitlezing van de effectiviteit van een vaccin de inductie van een CTL reactie tegen één of meerdere antigenen. Als de consistentie en duurzaamheid van de cellulaire respons belangrijk in dit verband zijn, is het gunstig voor het controleren van de kinetiek van CTL reacties van hetzelfde dier. Dit zal ook leiden tot een vermindering van dierlijke cijfers, een belangrijk aspect met betrekking tot de beginselen van de "3Rs"3. Vandaar, is de analyse van zo weinig als 20 µL bloed optimaal voor dit doel.
Tetramers werden ontwikkeld in de late jaren 904 en werd een belangrijk instrument op het gebied van de T cel immunologie. Tetramers zijn fluorescently-geëtiketteerden complexen van vier MHC ik / peptide moleculen, die aan TCRs, specifiek voor een enkele peptide binden. Tegenwoordig, ze kunnen worden ofwel gekocht kant en klare5, aangepaste-besteld gratis inleveren bij de NIH tetrameer Core faciliteit in Emory University6 of daarmee zijn geproduceerd in de lab-7. MHC, I en II tetramers zijn beschikbaar, , dat wil zeggen voor CD8+ en CD4+ T-cellen, respectievelijk. De potentie van tetrameer kleuring ligt in tijdwinst, eerder eenvoudig en gemakkelijk te standaardiseren van protocollen van8 en9van de gevoeligheid. Ook, als u werkt met bloed, dieren hoeven niet te worden opgeofferd en minimale hoeveelheid monster nodig zijn. Een meting is niet beperkt tot een enkele antigeen, maar verschillende antigenen kunnen worden geanalyseerd in een kleuring wanneer geconjugeerd tetramers combineren met verschillende fluorophores. Nieuw ontdekte antigenen, b.v. van peptide de schermen, kunnen gemakkelijk worden opgenomen in tetramers en gebruikt voor de kwantificering van de T cel subset.
Tetrameer kleuring geeft geen informatie over CTL-functionaliteit (dwz., cytokine productie, effector functies), maar alleen specificiteit. Uitgevoerd8,10te krijgen informatie over T-cel-functionaliteit, intracellulaire cytokine kleuring (ICS) of enzym gekoppelde Immuno Spot (ELISpot) Assay moet worden. Tetrameer kleuring en ICS/ELISpot, echter niet overbodig maar elkaar eerder aanvullen. In vitro stimulatie voor het opwekken van cytokine productie voor ICS/ELISpot doet afbreuk aan het oorspronkelijke T cel fenotype. Tetrameer kleuring, daarentegen laat de T cel onaangeroerd; het oorspronkelijke fenotype wordt behouden en kan worden geanalyseerd. Ook is een ander groot voordeel van tetramers dat de kleuring kan worden gecombineerd met magnetische sorteren en verrijking van antigeen-specifieke cellen11. Dit zorgt voor de analyse van zeldzame populaties, evenals het kweken van gesorteerde cellen met gedefinieerde antigeen-specifieke kenmerken-een functie die is niet mogelijk met andere methoden.
Met behulp van het protocol beschreven hier, tetrameer kleuring, evenals ICS/ELISpot kan worden uitgevoerd vanuit één orgaan, omdat slechts weinig materiaal (bloed: 20 µL; milt: 1 x 106 cellen) is vereist voor tetrameer kleuring. Echter, afhankelijk van de frequentie van de antigeen-specifieke cellen van belang, de sterkte van de respectieve TCR en de experimentele context, de hoeveelheid cellen vereist wellicht worden opgeschaald of magnetische verrijking zou moeten worden toegepast.
Tetramers worden veel gebruikt, bijvoorbeeld voor het beoordelen van de effectiviteit van vaccins (antitumorale)12,13,14,15 of immunotherapie16,17, fenotypische analyse en ruimtelijke lokalisatie van antigeen-specifieke T cel subsets18,19,20,21,22,23. De hier beschreven methode is geschikt voor studies, die tot doel hebben de kwantificering en fenotypische analyse van lymfkliertest antigeen-specifieke CD8+ T cellen in hun analyse in een snelle en gemakkelijke manier.
Protocol
Alle beschreven methoden werden uitgevoerd met inachtneming van de Oostenrijkse nationale dier experimenten wet ("Tierversuchsgesetz"), en dierlijke proef toestemming werd verleend door de nationale autoriteiten.
1. buffer voorbereiding en proef van de collectie
Opmerking: De stam van de muis gebruikt, is afhankelijk van de epitoop geanalyseerd. Kies een passende tetrameer dat zich aan een MHC type uitgedrukt in de muizen, bijvoorbeeld, H - 2Kb voor C57BL/6 muizen bindt. Het geslacht en de leeftijd van de dieren hangt af van de wetenschappelijke vraag. Voor de meeste van de experimenten beschreven hier, gebruik vrouwelijke muizen op de leeftijd van 6-8 weken aan het begin van het experiment, dat wil zeggen, eerste immunisatie.
- Bereiden van FACS Buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) + 1% foetaal kalfsserum (FCS) + 0,1% natriumazide + 2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en FACS fixing buffer (1,5% (v/v) formaldehyde in PBS).
Opmerking: Het wordt aanbevolen dat beide buffers zijn voorbereid. Bij 4 ° C tot gebruik opgeslagen. - Bloed: 20 µL bloed per muis ophalen in de ader van de staart van de muis in EDTA-gecoate buizen, zoals eerder beschreven24.
Opmerking: Bloed mag ook door andere routes, bijvoorbeeld, vena facialis of retro-orbitaal sinus worden geïnd. De methode van bloed collectie moet echter worden met inachtneming van het nationale dierlijke proefneming recht en dierlijke proef toepassingen. Collectie van bloed uit de ader van de staart is ideaal voor studies waar herhaaldelijk kleine hoeveelheden bloed nodig zijn. Aanvullend materiaal is vereist voor de besturingselementen van de compensatie en de controle van niet-gekleurd. - Milt: Isoleren van het orgel en, met de hulp van de zuiger van een injectiespuit, drukt u op door een 70 nm en 40 µm cel zeef. Lysis van de erythrocyten, zoals beschreven in stap 6 en telling uitvoeren Aanpassen van de concentratie aan 1 x 107 cellen/mL in PBS. Per monster zijn 1 x 106 cellen vereist.
Opmerking: Altijd omvatten enkele mock geïmmuniseerd of vector geïmmuniseerd controledieren als negatieve controle. Voor ovoalbumine (OVA)-tetrameer, een monster uit de OT-1 muizen kan als positieve controle worden gebruikt. Vergeet niet onbevlekt en compensatie besturingselementen in de berekening. Eventueel kunnen monsters van verschillende dieren in de experiment hiervoor worden samengevoegd. - Na sample collectie, direct doorgaan met de kleuring.
2. kleuring Set-up
- Bereid een FACS buis voor elk monster. Label buizen goed en Pipetteer 100 μl van orgel vering (1 x 106 cellen) of 20 μL van bloed in elke buis.
- Milt: Centrifugeer gedurende 5 min op 600 x g bij 4-8 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen. Vortex aan resuspendeer de pellet cel.
Opmerking: Dit zal resulteren in een resterende hoeveelheid ongeveer 20 µL, soortgelijk als het volume voor de bloedmonsters. - Voor elk kanaal worden gebruikt ook voorbereiden op een FACS buis een compensatie monster. Het bereiden van één extra monster als een onbevlekt besturingselement.
3. tetrameer kleuring
-
Gebruik voor elk monster, 50 μl van tetrameer verdunning. Voor de voorgestelde tetramers en geoptimaliseerde verdunningen, verwijzen naar tabel 1.
Opmerking: Bij het werken met tetramers of antilichamen, schakelt u het licht van de veiligheid kabinet en monsters te beschermen tegen licht.- Bereiden van een buis met FACS buffer (volume = 50 μl × aantal monsters plus extra 10% van het totale volume te compenseren pipetting fouten).
- Add tetramer(s) bij optimale verdunning, zoals vermeld in tabel 1. Vortex de oplossing.
Opmerking: Als u het deelvenster van de hele antilichaam (CD3 CD8, CD43, CD44, CD62L) met beursgenoteerde fluorophores, kunnen twee tetramers (in PE en APC) worden opgenomen. Beide tetramers kunnen worden gecombineerd in een enkele kleuring, d.w.z., kleuring van cellen met beide tetramers tegelijkertijd kan worden uitgevoerd.
| Tetrameer | Peptide volgorde | Allel | Fluorophore | Verdunning |
| MHC IK / EICELLEN | SIINFEKL | H - 2Kb | APC | 1:25 |
| MHC IK/VSV-NP | RGYVYQGL | H - 2Kb | PE | 1:25 |
| MHC IK / EGFP | HYLSTQSAL | H-2Kd | PE | 1:25 |
| MHC IK/LCMV-GP | KAVYNFATC | H-2Db | APC | 1:25 |
| MHC IK / HPV 16 E7 | RAHYNIVTF | H-2Db | APC | 1:10 |
Tabel 1: voorgesteld tetramers en optimale verdunningen. Aanbevolen tetramers voor sommige immunodominante peptides pathogen onderdelen (vesiculaire stomatitis virus (VSV) nucleoproteïne (NP), lymfatische Choriomeningitis Virus (LCMV of model antigenen (ovoalbumine (OVA) en verbeterde groen fluorescent proteïne (eGFP)) ) Glycoproteïne (GP) en humaan papillomavirus (HPV) E7 oncoprotein (E7)). Voor elk, de volgorde van de peptide en bijbehorende allel, wordt zo goed als aanbevolen fluorophore en geoptimaliseerde verdunning vermeld.
- 50 μl van tetrameer verdunning zachtjes aan elk monster en de vortex toevoegen. FACS buffer alleen (zonder tetrameer) toe te voegen compensatie besturingselementen en aan het Onbevlekt monster.
- Incubeer monsters gedurende 20 minuten bij 37 ° C, beschermd tegen licht. Om te zorgen voor een naadloze overgang van tetrameer aan antilichaam kleuring, bereiden de antilichaam-mix, zoals beschreven in stap 4 tijdens de incubatietijd.
Opmerking: Voor elke individuele tetrameer, optimale omstandigheden (verdunning, incubatietijd en temperatuur) moeten worden aangepast.
4. voorbereiding van antilichamen
-
Voor elk monster, bereiden 50 µL van antilichaam mix.
- Bereiden van een buis met FACS buffer (volume = 50 μl × aantal monsters plus extra 10% van het totale volume te compenseren pipetting fouten).
- Antistoffen in de verdunningen toevoegen, zoals vermeld in tabel 2.
Opmerking: Afhankelijk van de wetenschappelijke vraag, kunnen andere markering combinaties afgezien van degene die hier beschreven worden gebruikt. Zorg ervoor om antilichamen tegen CD3 en CD8 altijd onder in het deelvenster. - Vortex de oplossing.
| Antilichaam | Fluorophore | Verdunning | µg/monster | Marker |
| CD3 | PE-Cy7 | 1:200 | 0,05 | CTL's (CD3+CD8+) |
| CD8 | Pacific Blue | 1:750 | 0.013 | |
| V450 | 1:100 | 0.1 | ||
| CD43 | FITC | 1:100 | 0,25 | Activering (CD43+) |
| CD44 | PE-Cy5 | 1:250 | 0.04 | Naïeve (CD44-CD62L+) & effector (CD44+CD62L-) |
| CD62L | APC-Cy7 | 1:500 | 0.02 |
Tabel 2: antilichamen gebruikt in dit protocol en de optimale verdunningen. Aanbevolen oppervlakte markeringen (CD3, CD8, CD43, CD44 en CD62L) worden vermeld in de eerste kolom. Voor elk, de aanbevolen fluorophore, de geoptimaliseerde verdunning en het bedrag van antilichaam/monster staan. In de laatste kolom, is het celtype geïdentificeerd met iedere markeerdraad opgegeven.
-
Antilichamen voorbereiden op compensatie besturingselementen. Voor elk besturingselement van compensatie, een antilichaam tegen CD8 in de respectieve kleur te gebruiken.
- Voor elk kanaal, bereiden een buis met 200 μL van FACS buffer en voeg 1 μl van een 1:200 verdunning antilichaam tegen CD8 in de respectieve kleur.
- Vortex de buizen.
- Meteen doorgaan met de kleuring.
5. kleuring van monsters
- Wassen van monsters eenmaal door toevoeging van ~ 1 mL van FACS buffer en Centrifugeer gedurende 5 min op 600 x g bij 4-8 ° C. Na het centrifugeren, verwijder het supernatant en afvoer van de resterende vloeistof op een stapel papieren handdoeken.
Opmerking: Bij het werken met bloed, wees voorzichtig bij het aftappen uit de resterende vloeistof. Voorafgaand aan de lysis van de erythrocyten, zal bloed niet vasthouden aan de onderkant van de buis FACS. U kunt ook gecombineerd het supernatant. - 50 μl van het mengsel van antilichaam aan elke cel pellet en vortex zachtjes toevoegen.
- 50 μl van elke mix van compensatie aan de pellet van de cel van de overeenkomstige compensatie controle en vortex zachtjes toevoegen.
- Voeg voorzichtig 50 μl van FACS buffer toe aan de pellet van de cel van de onbevlekt controle en vortex.
- Incubeer alle monsters gedurende 30 minuten bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
- Bij het werken met organen: stap 6 overslaan. Wassen eenmaal door het toevoegen van ~ 1-2 mL FACS buffer en Centrifugeer gedurende 5 min op 600 x g bij 4-8 ° C. Na het centrifugeren, verwijder het supernatant en afvoer van de resterende vloeistof op een stapel papieren handdoeken.
- Bij het werken met bloed: Ga verder met stap 6 (lysis van de erythrocyten).
6. lysis van de erythrocyten
- Voeg toe 500 μL van ACK (Ammonium-Chloride-kalium) buffer25 aan elk monster en zachtjes vortex.
Opmerking: ACK buffer zal leiden tot osmotische zwelling en lysis, specifiek van erytrocyten. - Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Voeg 1 mL FACS buffer en Centrifugeer gedurende 5 min op 600 x g bij 4-8 ° C. Na het centrifugeren, verwijder het supernatant en afvoer van de resterende vloeistof op een stapel papieren handdoeken.
Opmerking: Wanneer de pellet liever rood is, herhaal de lysis van de erythrocyten. - Wassen eenmaal door het toevoegen van ~ 1-2 mL FACS buffer en Centrifugeer gedurende 5 min op 600 x g bij 4-8 ° C. Na het centrifugeren, verwijder het supernatant en afvoer van de resterende vloeistof op een stapel papieren handdoeken.
7. het stromen van cytometrische Measurement and Analysis
- Voeg 150-300 μL van FACS fixing buffer aan elke buis en mengeling door vortexing. Voor 20 µL bloed is 150 µL van buffer voldoende.
Opmerking: Voor fixatie, door ervoor te zorgen dat cellen goed opnieuw geschorst zijn om te voorkomen dat de vorming van klonten. Gaat u verder met stroommeting cytometrische zo snel mogelijk. - Meten van de compensatie-besturingselementen en corrigeer eventuele spectrale overlappingen.
-
Instellen van opeenvolgende poorten, zoals afgebeeld in Figuur 1 te selecteren voor CD3+/CD8+ cellen.
- Poort op lymfocyten met behulp van de voorwaartse en zijwaartse scatter (gebied) (niet-logaritmische schaal).
- Binnen de lymfocyt bevolking, gate op afzonderlijke cellen met behulp van voorwaartse scatter breedte vs gebied (niet-logaritmische schaal).
- Plot eencellige lymfocyten met behulp van CD3 en CD8 kanalen (logaritmische schaal). Identificeren van CD8+ T cellen door gating op CD3+/CD8+ cellen.
- Uitzetten van CD8+ vs tetrameer+ cellen en gate op CD8+ tetrameer+ cellen, zoals afgebeeld in Figuur 2.
- Indien mogelijk, het opnemen van 20.000 cellen (ten minste 5.000 cellen uit bloed) in het CD3+/CD8+ poort voor elk monster en opslaan als een bestand van FCS.
Opmerking: Het bedrag van de cellen om te registreren moet mogelijk worden aangepast volgens de frequentie van de antigeen-specifieke cellen van belang. - FCS bestanden met passende analysesoftware analyseren. Gebruik de gating strategie, zoals eerder beschreven (sectie 7.3) en kwantificeren van CD8+ tetrameer+ cellen.
Representative Results
Figuur 1 laat zien hoe u poort correct op de doelcellen van dit protocol, namelijk CD3+/CD8+ cellen. Het is te merken dat geactiveerd cellen vaak de T cel receptor26,27 downregulate en daarom CD3laag cellen moeten ook worden opgenomen in de gating. Na de CD3 gating+/CD8+ cellen, tetrameer positieve cellen kunnen worden geïdentificeerd (Figuur 2). Vertegenwoordiger vlekken voor een negatieve controle (naïeve) muis, welke goed als dieren gevaccineerd hetzij met beide eicellen-afscheidende Adenovirus 5 (Adeno-OVA) of eicellen-uiten VSV-GP (VSV-GP-OVA) zijn aangegeven. Zoals te zien in de lagere vlekken twee verschillende kunnen tetramers worden gecombineerd in de dezelfde buis voor de kleuring. Hierdoor wordt gelijktijdige kwantificering van twee verschillende CTL specificiteit: virus-specifieke (VSV N) en transgenic-specifieke (OVA) CTL's. We hebben bevestigd dat een- en tweepersoonskamers tetrameer technieken vergelijkbare percentages van positieve cellen voor elk tetrameer geven. Met behulp van dit protocol, andere virus-specifieke (bijv.., LCMV GP, HPV 16 E7) of transgenic-specifieke (bijvoorbeeld., GFP) T-cel populaties kunnen worden geanalyseerd (aanvullende figuur 1). In de aanvullende tabel 1, resultaten voor vijf dieren na immunisatie met VSV-GP-eicellen worden weergegeven — met vermelding van de robuustheid van tetrameer kleuring.
Figuur 1: Vertegenwoordiger gating strategie voor het analyseren van CD8+ T cellen in bloed. Schematische weergave van de gating strategie gebruikt voor flow cytometrische analyse. Na tetrameer kleuring en flow cytometrische meting, was de gegevens geanalyseerd. Lymfocyten werden geïdentificeerd met de voorwaartse en zijwaartse scatter (gebied) (niet-logaritmische schaal). Uit degenen, werden afzonderlijke cellen geïdentificeerd door het toepassen van voorwaartse scatter breedte vs gebied (niet-logaritmische schaal). CD8+ T cellen werden geïdentificeerd door het gating op CD3+/CD8+ cellen (logaritmische schaal). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Vertegenwoordiger gating strategie te kwantificeren van eicellen - en N-specifieke CD8+ T cellen in bloed. Schematische weergave van de gating strategie gebruikt voor stroom cytometrische kwantificering van tetrameer+ cellen. CD3+/CD8+ cellen werden gebruikt voor tetrameer analyse. Bovenste en middelste paneel: de CD8-markering was uitgezet tegen de respectieve tetrameer (logaritmische schaal). Lagere paneel: beide tetramers werden uitgezet tegen elkaar (logaritmische schaal). Links: controle (naïeve) muis; Midden: muis was geïmmuniseerd met eicellen-afscheidende Adenovirus 5 (Adeno-OVA); rechts: muis was geïmmuniseerd met ovoalbumine (OVA)-VSV-GP (VSV-GP-OVA) uitdrukken. Bloed werd bijeengezocht uit staart ader op dag 7 na immunisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: Representatief resultaat van CD3+/CD8+ tetrameer+ cellen na de vaccinatie. Schematische weergave van flow cytometrische kwantificering van tetrameer+ cellen. CD3+/CD8+ cellen werden gebruikt voor tetrameer analyse en de CD8-markering was uitgezet tegen de respectieve tetrameer (logaritmische schaal). Links: muizen waren naïef, juiste: muizen werden geïmmuniseerd met VSV-GP (bovenste deelvenster), Green Fluorescent Protein (eGFP) verbeterd-uiting van VSV-GP (middelste deelvenster) of VSV-GP uiting van humaan papillomavirus (HPV) E7 oncoprotein (E7) (lagere paneel). Bloed was verzameld uit staart ader op dag 7 na immunisatie en gekleurd met tetramers (LCMV-GP, eGFP en HPV E7). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Een groot voordeel van het protocol hier beschreven is dat T cel reacties uit de dezelfde muis na verloop van tijd kunnen worden gevolgd als slechts kleine hoeveelheden bloed zijn nodig voor elke meting. Figuur 3 toont voorbeeldige resultaten voor de T cel reacties na verloop van tijd. Naast de hoeveelheid van antigeen-specifieke CTL's, kan ook hun fenotype worden geanalyseerd met behulp van dit protocol (Figuur 4).
Figuur 3: Representatief resultaat van CD8+ T cel kinetische in bloed na de vaccinatie. Schematische weergave van de gating strategie gebruikt voor stroom cytometrische kwantificering van tetrameer+ cellen. CD3+/CD8+ cellen werden gebruikt voor tetrameer analyse en beide tetramers werden uitgezet tegen elkaar (logaritmische schaal). Bovenste panelen: muis was geïmmuniseerd met eicellen-afscheidende Adenovirus 5 (Adeno-OVA); lagere panelen: muis was geïmmuniseerd met ovoalbumine (OVA)-VSV-GP (VSV-GP-OVA) uitdrukken. Bloed werd bijeengezocht uit staart ader op dag 3, 7, 10 en 14 na immunisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Representatief resultaat van CD8+ T cel activatie en differentiatie in effector en naïeve cellen na de vaccinatie. Schematische weergave van de gating strategie gebruikt voor stroom cytometrische kwantificering van geactiveerd (CD43+), naïef (CD44-/CD62L+) en effector (CD44+/CD62L-) CD3+/CD8+ cellen () logaritmische schaal). Links: controle (naïeve) muis; Midden: muis was geïmmuniseerd met eicellen-afscheidende Adenovirus 5 (Adeno-OVA); rechts: muis was geïmmuniseerd met ovoalbumine (OVA)-VSV-GP (VSV-GP-OVA) uitdrukken. Bloed werd bijeengezocht uit staart ader op dag 7 na immunisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Muis # | % CD43+ | % VSV-N tetrameer+ | % EICELLEN tetrameer+ | |
| mock | 1 | 1.7 | 0,45 | 0,41 |
| 2 | 0.77 | 0.69 | 0,15 | |
| 3 | 1.34 | 0.35 | 0.31 | |
| 4 | 1.68 | 0.83 | 0.26 | |
| 5 | 0.84 | 0.47 | 0.23 | |
| VSV-GP-EICELLEN | 1 | 23 | 13.2 | 3.69 |
| 2 | 32,6 | 15,9 | 3.54 | |
| 3 | 22.1 | 11.7 | 2.43 | |
| 4 | 15.1 | 8,89 inch | 1.79 | |
| 5 | 29.1 | 14,7 | 5.64 |
Aanvullende tabel 1: Percentages van geactiveerd en antigeen-specifieke CD3+/CD8+ cellen na de vaccinatie. Muizen zijn ofwel naïef of geïmmuniseerd met ovoalbumine (OVA)-VSV-GP (VSV-GP-OVA) uitdrukken (n = 5). Bloed was verzameld uit staart ader op dag 7 na immunisatie en gekleurd met tetramers (VSV-N en eicellen). Geactiveerd (CD43+) en CD3 van antigeen-specifieke (tetrameer+)+/CD8+ cellen werden gekwantificeerd door stroom cytometry.
Discussion
Tetrameer kleuring is een vrij eenvoudige en ongecompliceerde protocol om te analyseren fenotype en peptide specificiteit van een T-lymfocyten. Het gebruik van bloed voor analyse, zoals hier beschreven, is minimaal invasief en zorgt voor de continue opvolging, bijvoorbeeld vaccinatie studies. Op het gebied van vaccinatie is de kwantificering van vector - en antigeen-specifieke reacties van belang, zoals vector-specifieke reacties een effectieve immuunrespons tegen het vaccin antigeen28zouden kunnen belemmeren. Van belang is dat met het protocol beschreven hier, beide populaties kunnen worden gekwantificeerd gelijktijdig in een enkele tetrameer kleuring, waardoor kleuring variabiliteit en steekproef bedragen. Een paar stappen moeten echter zorgvuldig worden gedaan om te verzekeren van de juiste meting en betrouwbare gegevens. Als bloed van de ader van de staart gebruikt voor analyse, moet men ervoor zorgen om vooraf warm de dieren om te veroorzaken vasodilatatie24. Daarmee voldoende bloed kan worden verzameld in een korte tijd, stress bij de dieren wordt verminderd en de analyse is veel beter, vergeleken met als het bloed langzaam wordt verzameld. Ook na sample collectie (bloed of organen), wordt directe kleuring aanbevolen om te voorkomen dat valse negatieve resultaten te wijten aan TCR Downregulatie. Hetzelfde geldt voor alle volgende stappen: de procedure mag niet worden onderbroken en alle wassen stappen teruggebracht tot het minimale aantal (zoals vermeld in het protocol). Om ervoor te zorgen dat goede kleuring, moet worden gezorgd vortex alle oplossingen en monsters vóór en na incubatie. Dit is vooral belangrijk voor de vaststelling van de monsters om te voorkomen dat het samendoen van cellen.
Op het gebied van de wijziging van het protocol, kan andere oppervlakte markeringen en de tetramers worden gebruikt, afhankelijk van het doel van de analyse. Echter, alle reagentia dan moeten worden getitreerd, optimaal in combinatie met de hele deelvenster kleuring. Voor sommigen van de tetramers die u hier opgeeft, optimalisatie geopenbaard dat wij de door de fabrikant aanbevolen verdunning verhogen kunnen (1:10 aanbevolen, geoptimaliseerd 1:25) (tabel 1). Om dit te compenseren spectrale overlap, kunnen compensatie kralen worden gebruikt in plaats van gekleurde cellen. Met betrekking tot de keuze van de fluorescerende tetrameer-combinatie, een moet overwegen voor het gebruik van heldere fluorochromes, zoals Dit faciliteerd detectie - vooral wanneer het signaal laag is. Als Dolton en collega's29, we liever met PE - of APC-gekoppelde tetramers, die kunnen perfect worden gecombineerd in een enkele kleuring en CD8+ T cellen met een enkele antigeen specificiteit mooi kunnen worden waargenomen (Figuur 2). Met betrekking tot temperatuur en incubatie tijd allerlei tetrameer kleuring voorwaarden bestaan. In onze optimalisatieproces, wij deze kwestie behandeld en uitgevoerd tetrameer kleuring op verschillende omstandigheden (bijvoorbeeld 4 ° C, kamertemperatuur of 37 ° C). Van de verkregen resultaten, is het raadzaam om vlek gedurende 20 minuten bij 37 ° C, die in overeenstemming met de literatuur30,31 is. Langdurige incubatie moet worden voorkomen, aangezien dit tot een internalisering van de tetrameer30 en valse negatieve resultaten leiden kan.
De keuze van het juiste antilichaam voor de opsporing van CD8+ cellen is een andere belangrijke kwestie, die moet zorgvuldig overwogen (en eventueel aangepast). Dit vloeit voort uit het feit dat bepaalde anti-CD8 antilichaam klonen blok binding van tetramers aan de TCR, in menselijke32 evenals muis33 monsters. Voor onze tetrameer kleuring protocol, die we geselecteerd kloon 53 – 6,7 om vlek voor lymfkliertest CD8+ cellen — een kloon die niet zijn geblokkeerd, maar vrij verbetert tetrameer kleuring.
Tetrameer kleuring is vrij ongecompliceerd, bij het analyseren van prominente immuunrespons op het hoogtepunt van de T-cel-respons, bijvoorbeeld. Er kunnen echter bevolkingsgroepen die zijn een beetje meer 'problematisch'. Dergelijke voorbeelden zijn cellen specifiek voor lage affiniteit antigenen (tumor, zelf), onlangs geactiveerde cellen die vervolgens naar beneden-geregeld hun receptoren of zeldzame cel subsets (bv. naïef voorloper of geheugen cel populaties). In deze gevallen wellicht de klassieke tetrameer kleuring protocol worden verbeterd of in combinatie met andere methoden. Bijvoorbeeld, de proteïne kinase inhibitor van de omwenteling (PKI) dasatinib remt TCR internalisering en wellicht opgenomen vóór tetrameer kleuring. Tetramers kan ook worden gestabiliseerd door anti-fluorescerende unconjugated primaire Abs na tetrameer kleuring. Bovendien kan de intensiteit van de fluorescentie worden verhoogd door toevoeging van een tweede anti-Ab fluorescerende-geconjugeerde Ab29,34,35,,36. Wij de voorwaarden selectief op de tetramers in dit protocol vermelde geoptimaliseerd en PKI of extra Abs niet meegerekend. Echter, voor elke andere tetrameer, de optimale omstandigheden moeten individueel worden aangepast. Met betrekking tot zeldzame populaties, tetrameer kleuring mogelijk moet worden gecombineerd met magnetische verrijking11.
Om te vergemakkelijken en valideren van FACS analyse van tetrameer kleuring, moeten negatieve en positieve controles worden opgenomen. Als een negatieve controle vlek we altijd cellen van een naïef muis van dezelfde stam met onze tetrameer van belang. U kunt ook kunnen monsters worden gekleurd met tetramers met irrelevante peptiden, maar met de dezelfde fluorescerende als de tetrameer van belang. Dergelijke controles zijn van essentieel belang om uit te sluiten van valse positieve signalen, bijvoorbeeld., die afkomstig zijn van stervende cellen. Naast dit, is het aanbevolen om het opnemen van een live/dode vlek, zoals propidium jodide (PI). Dit is van bijzonder belang als cellen zijn niet gekleurd direct na isolatie. Een andere strategie om autofluorescence achtergrond te verwijderen zou kunnen zijn om meerdere niet-T-cel-markeringen onder één kanaal. Door met uitzondering van cellen positief in dit kanaal, kunnen niet-T-cel populaties worden uitgesloten. Als positieve controle, kan een monster van een OT-1 muis worden gebruikt voor eicellen tetrameer, bijvoorbeeld. Voor andere tetramers, dit moet individueel worden gekozen (bijvoorbeeld., monster van een muis, die meermaals werd geïmmuniseerd). Gelijk anderen37, zien we ook een down-regulatie van de CD8-receptor tijdens de activering van de CTL op dag 7 van de effector T-cel-respons. Daarom, om te voorkomen dat het verlies van geactiveerde tetrameer+ effector T cellen, raadzaam om de CD8laag cellen onder de analyse (ten minste als meten in de effector fase).
De kwaliteit en de hoeveelheid informatie die een uit dit protocol ophalen kunt is afhankelijk van de kennis over het antigeen worden bestudeerd, de beschikbaarheid en de specificiteit van tetrameer en de kwaliteit van de FACS machine (aantal lasers en beschikbare detectoren). Als werken met dierlijke monsters, is variatie in de immune reactie natuurlijk en onvermijdelijk. Daarom, om te krijgen zinvolle resultaten van tetrameer kleuring, ten minste 3-5 dieren moeten worden geanalyseerd. Als gedaan, geeft het protocol beschreven hier betrouwbare en reproduceerbare resultaten (voorbeeldig resultaat van een experiment kan worden gevonden in de Aanvullende tabel 1). Zoals eerder vermeld, deze methode is perfect afgestemd op het kwantificeren van de fenotype en antigeen-specificiteit van CD8+ T cellen (Figuur 3, 4; Aanvullende Figuur 1), niet alleen in de muis maar ook bij de mens. Echter voor het analyseren van CD8 functies+ T cel effector, zoals granzyme-veroorzaakte celdood, ICS-en/of ELISpot moeten worden uitgevoerd. Echter, moet men in gedachten dat T cel functies, zoals gemeten door in vitro stimulatie niet de werkelijke situatie in vivo vertegenwoordigen kunnen houden. In vivo een onderdrukkende milieu ertoe leiden dat T-cel-functies die zijn gemeten in vitro.
Op zijn eigen, tetrameer kleuring geeft alle informatie niet, maar het uitgegroeid tot een essentiële methode voor het karakteriseren van de T cel reacties en kwantificeren van de T cel subsets in vitro in een zeer gevoelige wijze38. Tetramers niet alleen bruikbaar te kwantificeren van bepaalde deelverzamelingen, maar ook om te isoleren die39, hen door kruising in situ19,20 te lokaliseren en bestuderen van lage-affiniteit antigenen, zoals tumor-geassocieerde40, 41. sinds de ontdekking van tetrameer technologie4, tetrameer kleuring is uitgegroeid tot een essentieel onderdeel van T-cel analyse en het aantal toepassingen.
Disclosures
Dorothee von Laer is een uitvinder van VSV-GP en bezit minderheid deelt in de biotechbedrijf ViraTherapeutics GmbH, die houdt van de intellectuele-eigendomsrechten voor VSV-GP. Voor de andere auteurs bestaan geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door het Fonds met Oostenrijkse wetenschap van FWF (projectnummer P 25499-B13) en de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma onder verlenen overeenkomst nr. 681032. De volgende reagens werd verkregen door de NIH tetrameer Core faciliteit: Class I MHC tetrameer voor vesiculaire stomatitis virus nucleoproteïne (RGYVYQGL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
| Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
| Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
| Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
| Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
| Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
| Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
| Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
| Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
| Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
| Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
| Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
| Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
| Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
| 12.5 mL Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
| Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
| Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
| FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
| PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
| Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
| Sodium azide | Roth | K305.1 | |
| PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
| Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
| FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
| PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
| APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
| OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
| VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
| EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
| LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
| HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |
References
- Tober, R., et al. VSV-GP: a potent viral vaccine vector that boosts the immune response upon repeated applications. Journal of virology. 88 (9), 4897-4907 (2014).
- Muik, A., et al. Re-engineering vesicular stomatitis virus to abrogate neurotoxicity, circumvent humoral immunity, and enhance oncolytic potency. Cancer Reseaerch. 74 (13), 3567-3578 (2014).
- Eales, L. J., Farrant, J., Helbert, M., Pinching, A. J. Peripheral blood dendritic cells in persons with AIDS and AIDS related complex: loss of high intensity class II antigen expression and function. Clinical and Experimental Immunology. 71, 423-427 (1988).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Tetramers and Monomers. , Available from: https://www.mblintl.com/products/research/monomer-tetramers/filter/product_type/monomer,peptide,tetramer (2016).
- NIH Tetramer Core Facility. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/ (2010).
- Class I MHC Tetramer Preparation: Overview. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/support/protocols (2010).
- Wolfl, M., et al. Quantitation of MHC tetramer-positive cells from whole blood: evaluation of a single-platform, six-parameter flow cytometric method. Cytometry A. 57 (2), 120-130 (2004).
- Burrows, S. R., et al. Peptide-MHC class I tetrameric complexes display exquisite ligand specificity. The Journal of Immunology. 165 (11), 6229-6234 (2000).
- Sims, S., Willberg, C., Klenerman, P. MHC-peptide tetramers for the analysis of antigen-specific T cells. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 765-774 (2010).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. The Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Xie, Y., et al. A novel T cell-based vaccine capable of stimulating long-term functional CTL memory against B16 melanoma via CD40L signaling. Cellular & Molecular Immunology. 10 (1), 72-77 (2013).
- Nanjundappa, R. H., Wang, R., Xie, Y., Umeshappa, C. S., Xiang, J. Novel CD8+ T cell-based vaccine stimulates Gp120-specific CTL responses leading to therapeutic and long-term immunity in transgenic HLA-A2 mice. Vaccine. 30 (24), 3519-3525 (2012).
- Bowers, E. V., Horvath, J. J., Bond, J. E., Cianciolo, G. J., Pizzo, S. V. Antigen delivery by alpha(2)-macroglobulin enhances the cytotoxic T lymphocyte response. Journal of Leukocyte Biology. 86 (2), 1259-1268 (2009).
- Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. The Journal of Immunology. 88 (20), 12006-12016 (2014).
- Sakai, K., et al. Dendritic cell-based immunotherapy targeting Wilms' tumor 1 in patients with recurrent malignant glioma. Journal of Neurosurgery. 123 (4), 989-997 (2015).
- Rosaely, C. G., et al. Immune responses to WT1 in patients with AML or MDS after chemotherapy and allogeneic stem cell transplantation. International Journal of Cancer. 138 (7), 1792-1801 (2016).
- Shane, H. L., Reagin, K. L., Klonowski, K. D. The Respiratory Environment Diverts the Development of Antiviral Memory CD8 T Cells. The Journal of Immunology. , (2018).
- Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. The Journal of Visualized Experiments. (127), e56130 (2017).
- De Vries, I. J. M., et al. In situ detection of antigen-specific T cells in cryo-sections using MHC class I tetramers after dendritic cell vaccination of melanoma patients. Cancer Immunology Immunotherapy. 56 (10), 1667-1676 (2007).
- Tan, H. X., et al. Induction of vaginal-resident HIV-specific CD8 T cells with mucosal prime-boost immunization. Mucosal Immunology. , (2017).
- Huang, H., et al. CD8(+) T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), (2017).
- Hensel, M. T., et al. Selective Expression of CCR10 and CXCR3 by Circulating Human Herpes Simplex Virus-Specific CD8 T Cells. Journal of Virology. 91 (19), (2017).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- ACK Lysis Buffer. , Available from: http://www.cshprotocols.cshlp.org/content/2014/11/pdb.rec083295.short (2014).
- San Jose, E., Borroto, A., Niedergang, F., Alcover, A., Alarcon, B. Triggering the TCR complex causes the downregulation of nonengaged receptors by a signal transduction-dependent mechanism. Immunity. 12 (2), 161-170 (2000).
- Dietrich, J., Hou, X., Wegener, A. M., Geisler, C. CD3 gamma contains a phosphoserine-dependent di-leucine motif involved in down-regulation of the T cell receptor. EMBO Journal. 13 (9), 2156-2166 (1994).
- Schone, D., et al. Immunodominance of Adenovirus-Derived CD8(+) T Cell Epitopes Interferes with the Induction of Transgene-Specific Immunity in Adenovirus-Based Immunization. Journal of Virology. 91 (20), (2017).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide–MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Whelan, J. A., et al. Specificity of CTL Interactions with Peptide-MHC Class I Tetrameric Complexes Is Temperature Dependent. The Journal of Immunology. 163 (8), 4342-4348 (1999).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide–MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Denkberg, G., Cohen, C. J., Reiter, Y. Critical role for CD8 in binding of MHC tetramers to TCR: CD8 antibodies block specific binding of human tumor-specific MHC-peptide tetramers to TCR. The Journal of Immunology. 167 (1), 270-276 (2001).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. The Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 335-346 (2000).
- Tungatt, K., et al. Antibody stabilization of peptide-MHC multimers reveals functional T cells bearing extremely low-affinity TCRs. The Journal of Immunology. 194 (1), 463-474 (2015).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. Journal of Immunological Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Rius, C., et al. Peptide-MHC Class I Tetramers Can Fail To Detect Relevant Functional T Cell Clonotypes and Underestimate Antigen-Reactive T Cell Populations. The Journal of Immunology. 200 (7), 2263-2279 (2018).
- Xiao, Z., Mescher, M. F., Jameson, S. C. Detuning CD8 T cells: down-regulation of CD8 expression, tetramer binding, and response during CTL activation. The Journal of Experimental Medicine. 204 (11), 2667-2677 (2007).
- McMichael, A. J., O'Callaghan, C. A. A New Look at T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 187 (9), 1367-1371 (1998).
- Hunsucker, S. A., et al. Peptide/MHC tetramer-based sorting of CD8(+) T cells to a leukemia antigen yields clonotypes drawn nonspecifically from an underlying restricted repertoire. Cancer Immunology Research. 3 (3), 228-235 (2015).
- Pittet, M. J., et al. Ex vivo analysis of tumor antigen specific CD8+ T cell responses using MHC/peptide tetramers in cancer patients. International Immunopharmacology. 1 (7), 1235-1247 (2001).
- Cohen, C. J., et al. Isolation of neoantigen-specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3981-3991 (2015).
