Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

विरोधी के एक साथ ठहराव वेक्टर और विरोधी transgene-विशिष्ट सीडी 8+ टी कोशिकाओं के माध्यम से MHC मैं एक वायरल वेक्टर के साथ टीकाकरण के बाद दाग Tetramer

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58680
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Virology, Department of Hygiene, Microbiology, Social Medicine, Medical University of Innsbruck

Summary

यहां, हम प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8+ टी कोशिकाओं के पूर्व vivo गुणात्मक पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । विश्लेषण अंगों से या रक्त की छोटी मात्रा से एकल कोशिका निलंबन के साथ संभव है । अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला साइटोटोक्सिक टी सेल प्रतिक्रियाओं (टीकाकरण और कैंसर immunotherapy अध्ययन) के विश्लेषण की आवश्यकता है ।

Abstract

वायरल संक्रमण पर, प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8+ साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं (CTLs) उठता है और रोगजनकों के प्रसार को रोकने के लिए संक्रमित कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए योगदान । इसलिए, antigen-विशिष्ट CTLs की आवृत्ति के लिए कोई विशिष्ट antigen T कक्ष प्रत्युत्तर की क्षमता का संकेत है । इस तरह के विश्लेषण बुनियादी इम्यूनोलॉजी, वैक्सीन विकास, कैंसर immunobiology और अनुकूली इम्यूनोलॉजी में महत्वपूर्ण है । वैक्सीन क्षेत्र में, CTL प्रतिक्रिया एक वायरल वेक्टर सह के घटकों के खिलाफ निर्देशित-निर्धारित करता है कैसे प्रभावी प्रतिजन-विशिष्ट कोशिकाओं के हित के प्रतिजन के खिलाफ पीढ़ी (यानी, transgene) है । antigen-विशिष्ट CTLs या तो intracellular cytokine धुंधला या antigen-विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) और विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा प्रत्यक्ष धुंधला द्वारा पीछा विशिष्ट पेप्टाइड्स के साथ उत्तेजना द्वारा पता लगाया जा सकता है । पहली विधि बल्कि समय लेने वाली है क्योंकि यह पशुओं के त्याग की आवश्यकता है अंगों से कोशिकाओं को अलग । इसके अलावा, यह छोटे जानवरों जो प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है से खून की अलगाव की आवश्यकता है । बाद के तरीके के बजाय तेजी से है, आसानी से रक्त की छोटी मात्रा के साथ किया जा सकता है और ऐसे cytolytic गतिविधि के रूप में विशिष्ट प्रभाव कार्यों पर निर्भर नहीं है । MHC tetramers antigen-विशिष्ट TCRs का पता लगाने के लिए एक आदर्श उपकरण हैं ।

यहां, हम एक साथ एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए immunodominant पेप्टाइड्स के लिए एक साथ antigen-विशिष्ट CTLs का पता लगाने के वायरल वेक्टर VSV-जीपी (LCMV-जीपी, VSV-NP) और transgenes (ओवा, एचपीवी 16 E7, eGFP) द्वारा MHC मैं tetramer धुंधला और प्रवाह cytometry । दाग या तो सीधे रक्त से या अंगों के एकल कोशिका निलंबन से संभव है, जैसे तिल्ली । रक्त या अंगों के एकल कोशिका निलंबन tetramers के साथ मशीन हैं । CD3 और सीडी 8 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग के बाद, प्रतिजन-विशिष्ट CTLs प्रवाह cytometry द्वारा quantified हैं । वैकल्पिक रूप से, CD43, CD44, CD62L या दूसरों के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिजन विशिष्ट सीडी 8+टी कोशिकाओं के सक्रियकरण स्थिति निर्धारित करने के लिए और भोली और प्रभाव कोशिकाओं के बीच भेदभाव करने के लिए शामिल किया जा सकता है ।

Introduction

इस विधि का उद्देश्य समय लेने वाले पेप्टाइड उत्तेजना की आवश्यकता के बिना प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा माउस में (एकाधिक) प्रतिजनों के लिए साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (CTL) प्रतिक्रियाओं की आवृत्ति का आकलन करने के लिए है । इस विधि का विश्लेषण करती है phenotype और antigen विशिष्टता CTL सबसेट के एक एकल धुंधला में । हम प्रमुख Histocompatibility जटिल मैं (MHC मैं) tetramer धुंधला प्रोटोकॉल जैसे VSV-जीपी, vesicular stomatitis वायरस (VSV), जहां ग्लाइकोप्रोटीन के VSV जी के नए संस्करण के रूप में नई वैक्सीन दृष्टिकोण की प्रभावकारिता का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है लिम्फोसाईटिक choriomeningitis वायरस (LCMV) के ग्लाइकोप्रोटीन जीपी1,2. विनोदी प्रतिक्रिया के अलावा, एक टीका के effectivity के एक महत्वपूर्ण पढ़ा-बाहर एक या कई प्रतिजनों के खिलाफ एक CTL प्रतिक्रिया की प्रेरण है । सेलुलर प्रतिक्रिया की निरंतरता और स्थायित्व के रूप में इस संदर्भ में महत्वपूर्ण हैं, यह एक ही जानवर से CTL प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स पर नजर रखने के लिए अनुकूल है । यह भी पशुओं की संख्या में कमी के लिए नेतृत्व करेंगे, एक महत्वपूर्ण पहलू "3Rs"3के सिद्धांतों के बारे में । इसलिए, विश्लेषण के रूप में छोटे से रक्त के 20 µ एल इस प्रयोजन के लिए इष्टतम है ।

Tetramers देर से 90 के दशक में विकसित किए गए4 और टी सेल इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया । Tetramers चार MHC मैं/पेप्टाइड अणुओं है, जो TCRs को बांध, एक पेप्टाइड के लिए विशिष्ट की फ्लोरोसेंट लेबल परिसरों हैं । आजकल, वे या तो खरीदा तैयार किया जा सकता है5, कस्टम-एमोरी विश्वविद्यालय में NIH Tetramer कोर सुविधा पर नि: शुल्क का आदेश दिया6 या लैब7में उत्पादित । MHC I और II tetramers उपलब्ध हैं, अर्थात् सीडी 8+ और CD4+ टी कोशिकाओं के लिए क्रमशः । tetramer धुंधला की शक्ति समय में निहित है बचत, बल्कि सरल और आसान मानकीकरण करने के लिए8 प्रोटोकॉल, और संवेदनशीलता9. इसके अलावा, यदि रक्त के साथ काम कर रहे हैं, पशुओं और बलि की जरूरत नहीं है नमूना की ंयूनतम मात्रा में आवश्यक हैं । एक माप एक एकल प्रतिजन के लिए सीमित नहीं है, लेकिन कई एंटीजन अलग fluorophores के साथ tetramers संयुग्मित संयोजन जब एक धुंधला में विश्लेषण किया जा सकता है. नई खोज एंटीजन, पेप्टाइड स्क्रीन से उदा, आसानी से tetramers में शामिल किया जा सकता है और टी सेल सबसेट के ठहराव के लिए इस्तेमाल किया ।

Tetramer धुंधला CTL कार्यशीलता के बारे में जानकारी नहीं देना होगा (यानी, cytokine उत्पादन, प्रभाव कार्य), लेकिन केवल विशिष्टता । टी सेल कार्यशीलता के बारे में जानकारी हासिल करने के लिए, intracellular cytokine धुंधला (आईसीएस) या एंजाइम लिंक्ड इंयूनो स्पॉट (ELISpot) परख के लिए8,10प्रदर्शन की जरूरत है । Tetramer धुंधला और आईसीएस/ELISpot, हालांकि, बेमानी नहीं बल्कि एक दूसरे के पूरक हैं । इन विट्रो उत्तेजना आईसीएस के लिए cytokine उत्पादन प्रेरित करने के लिए/ELISpot मूल टी सेल phenotype बदल जाएगा । Tetramer धुंधला, इसके विपरीत, टी सेल अछूता छोड़ देता है; मूल phenotype संरक्षित है और विश्लेषण किया जा सकता है । इसके अलावा, tetramers का एक और बड़ा लाभ यह है कि धुंधला चुंबकीय छंटाई और प्रतिजन-विशिष्ट11कोशिकाओं के संवर्धन के साथ जोड़ा जा सकता है । यह दुर्लभ आबादी के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में परिभाषित प्रतिजन-विशिष्टताओं के साथ हल कोशिकाओं के संवर्धन-एक सुविधा है कि अंय तरीकों के साथ संभव नहीं है ।

प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, tetramer धुंधला, साथ ही साथ आईसीएस/ELISpot एक अंग से किया जा सकता है, क्योंकि केवल बहुत कम सामग्री (रक्त: 20 µ l; तिल्ली: 1 x 106 कोशिकाओं) tetramer धुंधला के लिए आवश्यक है । हालांकि, antigen-विशिष्ट ब्याज की कोशिकाओं की आवृत्ति के आधार पर, संबंधित TCR की ताकत और प्रयोगात्मक संदर्भ, आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा को बढ़ाया जा करने के लिए की आवश्यकता हो सकती है या चुंबकीय संवर्धन लागू करने की आवश्यकता हो सकती है ।

Tetramers व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए (अर्बुदरोधी) टीके12,13,14,15 या immunotherapy16,17, phenotypic विश्लेषण और स्थानिक के effectivity का आकलन करने के लिए antigen-विशिष्ट T कक्ष का स्थानीयकरण सबसेट18,19,20,21,22,23। यहां वर्णित विधि अध्ययन के लिए अनुकूल है, जो एक तेज और सुविधाजनक तरीके से उनके विश्लेषण में murine प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8+ टी कोशिकाओं के ठहराव और phenotypic विश्लेषण को शामिल करने का लक्ष्य है ।

Protocol

सभी वर्णित तरीके ऑस्ट्रिया के राष्ट्रीय पशु प्रयोग कानून ("Tierversuchsgesetz") के साथ अनुपालन में प्रदर्शन किया, और पशु परीक्षण की अनुमति ऑस्ट्रिया के राष्ट्रीय अधिकारियों द्वारा प्रदान किया गया था ।

1. बफर तैयारी और नमूना संग्रह

नोट: माउस का इस्तेमाल किया तनाव epitope विश्लेषण पर निर्भर करता है । एक उपयुक्त tetramer चुनें जो चूहों में व्यक्त किए गए किसी MHC प्रकार को बांधे, उदा., C57BL/6 चूहों के लिए H-2Kb । पशुओं का लिंग और आयु वैज्ञानिक प्रश्न पर निर्भर करेगा । यहां वर्णित प्रयोगों में से अधिकांश के लिए, प्रयोग के प्रारंभ में, आयु के 6-8 सप्ताह में मादा चूहों का उपयोग करें, अर्थात, प्रथम प्रतिरक्षण ।

  1. तैयार FACS बफर (फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) + 1% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) + ०.१% सोडियम azide + 2 मिमी Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) और FACS फिक्सिंग बफर (१.५% (वी/वी) formaldehyde में पंजाब).
    नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि दोनों बफ़र पहले से तैयार हैं । उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
  2. रक्त: EDTA-लेपित ट्यूबों में माउस की पूंछ नस से प्रति माउस खून की 20 µ एल लीजिए, जैसा कि पहले24वर्णित है ।
    नोट: रक्त भी अंय मार्गों, जैसे, वेना facialis या रेट्रो कक्षीय साइनस द्वारा एकत्र किया जा सकता है । हालांकि, रक्त संग्रह की विधि राष्ट्रीय पशु प्रयोग कानून और पशु परीक्षण अनुप्रयोगों के अनुपालन में होना है । पूंछ नस से रक्त का संग्रह अध्ययन के लिए आदर्श है जहां रक्त की एक बार छोटी मात्रा की जरूरत है । अतिरिक्त सामग्री मुआवजा नियंत्रण और गैर दाग नियंत्रण के लिए आवश्यक है ।
  3. तिल्ली: अंग को अलग और, एक सिरिंज के गोताख़ोर की मदद से, एक ७० एनएम के माध्यम से प्रेस और ४० µm सेल छलनी. lysis एरिथ्रोसाइट्स, चरण 6 और गणना में वर्णित के रूप में निष्पादित करें । 1 एक्स के लिए एकाग्रता समायोजित 107 कोशिकाओं/ प्रति नमूना, 1 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता है ।
    नोट: हमेशा नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कुछ नकली प्रतिरक्षित या नियंत्रण वेक्टर प्रतिरक्षित जानवरों में शामिल हैं । ovalbumin (ओवा)-tetramer के लिए, OT-1 चूहों से एक नमूना सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । गणना में दाग और क्षतिपूर्ति नियंत्रण मत भूलना । यदि आवश्यक हो, प्रयोग में विभिंन जानवरों से नमूने इस के लिए जमा किया जा सकता है ।
  4. नमूना संग्रह के बाद, सीधे धुंधला के साथ आगे बढ़ना ।

2. सेट अप धुंधला

  1. प्रत्येक नमूने के लिए एक FACS ट्यूब तैयार करें । लेबल ट्यूबों ठीक से और स्थानांतरण १०० अंग निलंबन के μL (1 एक्स 106 कोशिकाओं) या एक ट्यूब में रक्त की 20 μL.
  2. तिल्ली: 4-8 डिग्री सेल्सियस पर ६०० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । भंवर सेल गोली resuspend करने के लिए ।
    नोट: यह लगभग 20 µ एल, रक्त के नमूनों के लिए मात्रा के रूप में इसी तरह की एक शेष मात्रा में परिणाम होगा ।
  3. प्रत्येक चैनल के लिए भी इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक मुआवजा नमूना के लिए एक FACS ट्यूब तैयार । एक दाग नियंत्रण के रूप में एक अतिरिक्त नमूना तैयार करें ।

3. Tetramer धुंधला

  1. प्रत्येक नमूने के लिए, tetramer कमजोर पड़ने के ५० μL का उपयोग करें । सुझाए गए tetramers और अनुकूलित कमजोर पड़ने के लिए, तालिका 1 का संदर्भ लें ।
    नोट: जब tetramers या एंटीबॉडी के साथ काम कर, सुरक्षा कैबिनेट के प्रकाश बंद करो और प्रकाश से नमूनों की रक्षा ।
    1. FACS बफर के साथ एक ट्यूब तैयार (volume = ५० μL × कुल मात्रा के अतिरिक्त 10% से अधिक नमूनों की संख्या pipetting त्रुटियों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए) ।
    2. tetramer (s) इष्टतम कमजोर पड़ने पर जोड़ें, के रूप में तालिका 1में सूचीबद्ध । हल भंवर ।
      नोट: जब पूरे एंटीबॉडी पैनल (CD3, सीडी 8, CD43, CD44, CD62L) को सूचीबद्ध fluorophores के साथ प्रयोग करते हैं, तो दो tetramers (पीई और APC में) शामिल हो सकते हैं । दोनों tetramers एक ही दाग में संयुक्त किया जा सकता है , यानी, दोनों tetramers के साथ कोशिकाओं के दाग एक साथ प्रदर्शन किया जा सकता है ।
Tetramer पेप्टाइड अनुक्रम एलील Fluorophore पतलापन
MHC I/ओवा SIINFEKL H-2Kb Apc 1:25
MHC I/VSV-NP RGYVYQGL H-2Kb पीई 1:25
MHC I/EGFP HYLSTQSAL H-2Kd पीई 1:25
MHC I/LCMV-GP KAVYNFATC H-2Db Apc 1:25
MHC I/एचपीवी 16 E7 RAHYNIVTF H-2Db Apc 1:10

तालिका 1: सुझाया tetramers और इष्टतम कमजोर पड़ने । मॉडल एंटीजन (Ovalbumin (ओवा) और एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP)) या रोगज़नक़ घटकों के कुछ immunodominant पेप्टाइड्स के लिए अनुशंसित tetramers (Vesicular stomatitis वायरस (VSV) nucleoprotein (एनपी), लिम्फोसाईटिक Choriomeningitis वायरस (LCMV ) ग्लाइकोप्रोटीन (GP) और ह्यूमन papillomavirus (एचपीवी) E7 oncoprotein (E7)) । प्रत्येक के लिए, पेप्टाइड अनुक्रम और इसी एलील, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुशंसित fluorophore और अनुकूलित कमजोर पड़ने सूचीबद्ध है ।

  1. जोड़ें ५० μL tetramer कमजोर पड़ने के प्रत्येक नमूने और भंवर धीरे । केवल FACS बफ़र जोड़ें (बिना tetramer) क्षतिपूर्ति नियंत्रण और दाग नमूने के लिए ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए, प्रकाश से सुरक्षित की मशीन नमूने । tetramer से एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए एक निर्बाध संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए, एंटीबॉडी मिश्रण तैयार के रूप में गर्मी के समय के दौरान 4 कदम में वर्णित है ।
    नोट: प्रत्येक व्यक्ति tetramer के लिए, इष्टतम स्थितियों (कमजोर पड़ने, गर्मी समय और तापमान) को समायोजित करने की आवश्यकता है ।

4. एंटीबॉडी तैयार करना

  1. प्रत्येक नमूने के लिए, एंटीबॉडी मिश्रण के ५० µ एल तैयार करें ।
    1. FACS बफर के साथ एक ट्यूब तैयार (volume = ५० μL × कुल मात्रा के अतिरिक्त 10% से अधिक नमूनों की संख्या pipetting त्रुटियों की भरपाई के लिए) ।
    2. तालिका 2में सूचीबद्ध के रूप में कमजोर पड़ने में एंटीबॉडी जोड़ें ।
      नोट: वैज्ञानिक सवाल पर निर्भर करता है, यहां वर्णित एक के अलावा अंय मार्कर संयोजन इस्तेमाल किया जा सकता है । हमेशा पैनल में CD3 और सीडी 8 के खिलाफ एंटीबॉडी शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    3. हल भंवर ।
एंटीबॉडी Fluorophore पतलापन µ g का नमूना/ मार्कर
CD3 पे-Cy7 1:200 ०.०५ CTLs (CD3+सीडी 8+)
सीडी 8 प्रशांत नीला 1:750 ०.०१३
V450 1:100 ०.१
CD43 FITC 1:100 ०.२५ सक्रियण (CD43+)
CD44 पे-Cy5 1:250 ०.०४ नादान (CD44-CD62L+) व प्रभावर (CD44+CD62L-)
CD62L APC-Cy7 1:500 ०.०२

तालिका 2: इस प्रोटोकॉल और इष्टतम कमजोर पड़ने में इस्तेमाल एंटीबॉडी । अनुशंसित सतह मार्करों (CD3, सीडी 8, CD43, CD44 और CD62L) पहले स्तंभ में सूचीबद्ध हैं । प्रत्येक के लिए, अनुशंसित fluorophore, अनुकूलित कमजोर पड़ने और एंटीबॉडी/नमूना की राशि सूचीबद्ध हैं । अंतिम स्तंभ में, प्रत्येक मार्कर के साथ पहचाने गए कक्ष प्रकार निर्दिष्ट किए जाते हैं.

  1. मुआवजा नियंत्रण के लिए एंटीबॉडी तैयार करते हैं । प्रत्येक क्षतिपूर्ति नियंत्रण के लिए, संबंधित रंग में सीडी 8 के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करें ।
    1. प्रत्येक चैनल के लिए, FACS बफर के २०० μL के साथ एक ट्यूब तैयार करने और संबंधित रंग में सीडी 8 के खिलाफ एक 1:200 कमजोर पड़ने एंटीबॉडी के 1 μL जोड़ें ।
    2. भंवर ट्यूबों ।
  2. दाग के साथ तुरंत आगे बढ़ें ।

5. नमूनों का दाग

  1. FACS बफर के ~ 1 मिलीलीटर जोड़ने और 4-8 डिग्री सेल्सियस पर ६०० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक के द्वारा एक बार नमूने धो लो । केंद्रापसारक के बाद, supernatant त्यागें और कागज तौलिए के ढेर पर तरल शेष बंद नाली ।
    नोट: जब रक्त के साथ काम कर रहे हैं, जब बंद शेष तरल draining सतर्क हो । एरिथ्रोसाइट्स के lysis से पहले, रक्त FACS ट्यूब के नीचे करने के लिए छड़ी नहीं होगा । वैकल्पिक रूप से, महाप्राण supernatant ।
  2. एंटीबॉडी मिश्रण के ५० μL प्रत्येक सेल गोली और भंवर को धीरे से जोड़ें ।
  3. प्रत्येक मुआवजा मिश्रण के ५० μL इसी क्षतिपूर्ति नियंत्रण और भंवर के सेल गोली धीरे जोड़ें ।
  4. जोड़ें ५० FACS बफर के सेल गोली दाग नियंत्रण और भंवर के लिए धीरे से μL ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सभी नमूनों की मशीन, प्रकाश से सुरक्षित ।
  6. अंगों के साथ काम करते समय: चरण 6 छोड़ें । जोड़ने के द्वारा एक बार धो ~ 1-FACS बफर के 2 मिलीलीटर और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर ६०० x g पर 4-8 ° c । केंद्रापसारक के बाद, supernatant त्यागें और कागज तौलिए के ढेर पर तरल शेष बंद नाली ।
  7. जब रक्त के साथ काम: कदम 6 (lysis of एरिथ्रोसाइट्स) के लिए आगे बढ़ें ।

6. Lysis of एरिथ्रोसाइट्स

  1. ५०० μL ले (अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम) बफर25 प्रत्येक नमूने के लिए और धीरे भंवर जोड़ें ।
    नोट: ले बफर आसमाटिक सूजन और lysis, विशेष रूप से एरिथ्रोसाइट्स के लिए नेतृत्व करेंगे ।
  2. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
  3. FACS बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 4-8 डिग्री सेल्सियस पर ६०० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । केंद्रापसारक के बाद, supernatant त्यागें और कागज तौलिए के ढेर पर शेष तरल बंद नाली ।
    नोट: जब गोली बल्कि लाल है, एरिथ्रोसाइट्स के lysis दोहराने ।
  4. जोड़ने के द्वारा एक बार धो ~ 1-2 मिलीलीटर FACS बफर और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर ६०० x जी में 4-8 ° c । केंद्रापसारक के बाद, supernatant त्यागें और कागज तौलिए के ढेर पर तरल शेष बंद नाली ।

7. प्रवाह Cytometric माप और विश्लेषण

  1. एक ट्यूब और भंवर द्वारा मिश्रण करने के लिए FACS फिक्सिंग बफर के 150-300 μL जोड़ें । रक्त के 20 µ l के लिए, बफर के १५० µ l के लिए पर्याप्त है ।
    नोट: निर्धारण से पहले, सुनिश्चित करें कि कक्षों को अच्छी तरह से पुन: निलंबित कर दिया गया है ताकि झुरमुट के गठन को रोका जा सके । जितनी जल्दी हो सके फ्लो cytometric माप के साथ आगे बढ़ें ।
  2. मुआवजा नियंत्रण को मापने और किसी भी वर्णक्रमीय ओवरलैप सही.
  3. CD3+/CD8+ कक्षों के लिए चयन करने के लिए चित्र 1 में दर्शाए अनुसार क्रमिक द्वार सेट करें ।
    1. आगे और sideward तितर बितर (क्षेत्र) (गैर लघुगणक पैमाने) का उपयोग कर लिम्फोसाइटों पर गेट ।
    2. लिम्फोसाइट जनसंख्या के भीतर, एकल कोशिकाओं पर गेट आगे तितर बितर चौड़ाई बनाम क्षेत्र का उपयोग (गैर लघुगणक पैमाने) ।
    3. CD3 और सीडी 8 चैनल (लघुगणक स्केल) का उपयोग करके एकल कक्ष लिम्फोसाइटों को प्लॉट करें । CD3 +/CD8+ कोशिकाओं पर गेटिंग द्वारा सीडी 8+ टी कोशिकाओं की पहचान करें ।
    4. प्लॉट सीडी 8 + vs Tetramer+ कोशिकाओं और गेट सीडी 8+ Tetramer+ कोशिकाओं पर, जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है ।
  4. यदि संभव हो तो रिकॉर्ड २०,००० कोशिकाओं (रक्त से कम से ५,००० कोशिकाओं) प्रत्येक नमूने के लिए CD3+/CD8+ गेट में और एक FCS फ़ाइल के रूप में सहेजें ।
    नोट: रिकॉर्ड करने के लिए कक्षों की मात्रा के लिए ब्याज की antigen-विशिष्ट कक्षों की आवृत्ति के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  5. विश्लेषण FCS उपयुक्त विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ फ़ाइलें । गेटिंग कार्यनीति का उपयोग करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है (धारा ७.३) और सीडी 8+ Tetramer+ कोशिकाओं को बढ़ाता है.

Representative Results

चित्रा 1 इस प्रोटोकॉल, अर्थात् CD3+/CD8+ कोशिकाओं के लक्ष्य कोशिकाओं पर सही ढंग से गेट करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है. यह नोट करने के लिए है कि सक्रिय कोशिकाओं अक्सर टी सेल रिसेप्टर26,27 और downregulate, इसलिए, CD3कम कोशिकाओं को भी गेटिंग में शामिल किया जाना चाहिए. CD3+/CD8+ कोशिकाओं को गेटिंग के बाद tetramer पॉजिटिव कोशिकाओं को पहचाना जा सकता है (चित्रा 2). एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रतिनिधि दाग (भोली) माउस, साथ ही जानवरों या तो के साथ टीका लगाया या तो ओवा-स्रावित एडीनोवायरस ५ (Adeno-ओवा) या ओवा-व्यक्ती VSV-जीपी (VSV-gp-ओवा) प्रदर्शित होते. के रूप में कम दाग में देखा दो अलग tetramers धुंधला के लिए एक ही ट्यूब में जोड़ा जा सकता है । यह दो अलग CTL विशिष्टताओं के एक साथ ठहराव की अनुमति देता है: वायरस-विशिष्ट (VSV N) और transgene-विशिष्ट (ओवा) CTLs. हम पुष्टि की है कि एक और डबल tetramer दाग प्रत्येक tetramer के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के समान प्रतिशत देते हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, अंय वायरस-विशिष्ट(जैसे, LCMV जीपी, एचपीवी 16 E7) या transgene-विशिष्ट (जैसे, GFP) टी सेल आबादी (पूरक चित्रा 1) का विश्लेषण किया जा सकता है । पूरक तालिका 1में, VSV के साथ प्रतिरक्षण के बाद पांच जानवरों के लिए परिणाम-जीपी-ओवा दिखाया गया है-tetramer धुंधला की मजबूती का संकेत.

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति रक्त में सीडी 8+ टी कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए । गेटिंग रणनीति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया । tetramer धुंधला और प्रवाह cytometric माप के बाद, डेटा का विश्लेषण किया गया था । लिम्फोसाइटों आगे और sideward तितर बितर (क्षेत्र) (गैर लघुगणक पैमाने) के साथ की पहचान की गई । उन लोगों से, एकल कक्ष आगे तितर-बितर चौड़ाई बनाम क्षेत्र (गैर-लघुगणक स्केल) लागू करके पहचाने गए । सीडी 8 + टी कोशिकाओं CD3+/CD8+ कोशिकाओं (लघुगणक स्केल) पर गेटिंग द्वारा पहचाना गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति रक्त में ओवा और एन विशिष्ट सीडी 8+ टी कोशिकाओं को बढ़ाता है । गेटिंग रणनीति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व tetramer+ कोशिकाओं के प्रवाह cytometric ठहराव के लिए इस्तेमाल किया । CD3+/CD8+ कोशिकाओं tetramer विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया । ऊपरी और मध्य पैनल: सीडी 8 मार्कर संबंधित tetramer (लघुगणक स्केल) के खिलाफ साजिश रची गई थी । लोअर पैनल: दोनों tetramers एक दूसरे (लघुगणक पैमाने) के खिलाफ साजिश रची गई । वाम: नियंत्रण (भोली) माउस; मध्य: माउस के साथ प्रतिरक्षित था ओवा-स्रावी एडीनोवायरस ५ (Adeno-ओवा); सही: माउस ovalbumin (ओवा)-व्यक्त VSV-जीपी (VSV-gp-ओवा) के साथ प्रतिरक्षित था. 7 दिन प्रतिरक्षण के बाद पूंछ नस से रक्त एकत्र किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
पूरक चित्रा 1: CD3 के प्रतिनिधि परिणाम+/CD8+ tetramer+ कोशिकाओं टीकाकरण के बाद. tetramer+ कोशिकाओं के प्रवाह cytometric ठहराव का योजनाबद्ध निरूपण. CD3+/CD8+ कोशिकाओं tetramer विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया और सीडी 8 मार्कर संबंधित tetramer (लघुगणक स्केल) के खिलाफ साजिश रची गई थी । वाम: चूहे भोले थे, सही: चूहों VSV के साथ प्रतिरक्षित थे जीपी (ऊपरी पैनल), बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) व्यक्त VSV-जीपी (मध्य पैनल) या VSV-जीपी एक्सप्रेस मानव papillomavirus (एचपीवी) E7 oncoprotein (E7) (कम पैनल) । रक्त में पूंछ नस से एकत्र किया गया था 7 दिन प्रतिरक्षण के बाद और tetramers के साथ सना हुआ (LCMV-जीपी, eGFP और एचपीवी E7). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रोटोकॉल का एक बड़ा लाभ यहां वर्णित है कि एक ही माउस से टी सेल प्रतिक्रियाओं समय पर पीछा किया जा सकता है के रूप में केवल रक्त की छोटी मात्रा में प्रत्येक माप के लिए आवश्यक हैं । चित्रा 3 समय के साथ टी सेल प्रतिक्रियाओं के लिए अनुकरणीय परिणाम दिखाता है । प्रतिजन-विशिष्ट CTLs की मात्रा के अलावा, उनके phenotype भी इस प्रोटोकॉल (चित्रा 4) का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है ।

Figure 3
चित्रा 3: सीडी 8 के प्रतिनिधि परिणाम+ टीकाकरण के बाद रक्त में टी सेल काइनेटिक । गेटिंग रणनीति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व tetramer+ कोशिकाओं के प्रवाह cytometric ठहराव के लिए इस्तेमाल किया । CD3+/CD8+ कोशिकाओं tetramer विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था और दोनों tetramers एक दूसरे (लघुगणक पैमाने) के खिलाफ साजिश रची गई । ऊपरी पैनलों: माउस के साथ प्रतिरक्षित था ओवा-स्रावी एडीनोवायरस 5 (Adeno-ओवा); लोअर पैनलों: माउस ovalbumin (ओवा)-व्यक्त VSV-जीपी (VSV-gp-ओवा) के साथ प्रतिरक्षित था । 3, 7, 10 और 14 को प्रतिरक्षण के बाद दिन में पूंछ नस से रक्त एकत्र किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सीडी 8 के प्रतिनिधि परिणाम+ टी सेल सक्रियण और टीकाकरण के बाद भोली और प्रभाव कोशिकाओं में भेदभाव । गेटिंग रणनीति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (CD43+) के प्रवाह cytometric ठहराव के लिए इस्तेमाल किया, भोली (CD44-/CD62L+) और प्रभाव (CD44+/CD62L-) CD3+/CD8+ कोशिकाओं ( लघुगणक स्केल) । वाम: नियंत्रण (भोली) माउस; मध्य: माउस के साथ प्रतिरक्षित था ओवा-स्रावी एडीनोवायरस ५ (Adeno-ओवा); सही: माउस ovalbumin (ओवा)-व्यक्त VSV-जीपी (VSV-gp-ओवा) के साथ प्रतिरक्षित था. 7 दिन प्रतिरक्षण के बाद पूंछ नस से रक्त एकत्र किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

माउस % CD43+ % VSV-N Tetramer+ % ओवा Tetramer+
नकली 1 १.७ ०.४५ ०.४१
2 ०.७७ ०.६९ ०.१५
3 १.३४ ०.३५ ०.३१
4 १.६८ ०.८३ ०.२६
5 ०.८४ ०.४७ ०.२३
VSV-जीपी-ओवा 1 23 १३.२ ३.६९
2 ३२.६ १५.९ ३.५४
3 २२.१ ११.७ २.४३
4 १५.१ ८.८९ १.७९
5 २९.१ १४.७ ५.६४

पूरक तालिका 1: टीकाकरण के बाद सक्रिय और प्रतिजन-विशिष्ट CD3+/CD8+ कोशिकाओं के प्रतिशत । चूहे या तो भोले थे या प्रतिरक्षित ovalbumin (ओवा)-व्यक्ती VSV-जीपी (VSV-gp-ओवा) (n = 5). रक्त की पूंछ नस से 7 दिन पर प्रतिरक्षण के बाद एकत्र किया गया था और tetramers (VSV-N और ओवा) के साथ दाग । आपन (CD43+) और प्रतिजन-विशिष्ट (tetramer+) CD3+/CD8+ कोशिकाओं को प्रवाह quantified द्वारा cytometry गया.

Discussion

Tetramer धुंधला एक बल्कि सीधा और सीधी प्रोटोकॉल एक टी लिम्फोसाइट के phenotype और पेप्टाइड विशिष्टता का विश्लेषण करने के लिए है । विश्लेषण के लिए रक्त का उपयोग, जैसा कि यहां वर्णित है, ंयूनतम इनवेसिव है और निरंतर निगरानी की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए टीकाकरण अध्ययन में । टीकाकरण के क्षेत्र में, वेक्टर के ठहराव-और प्रतिजन-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं ब्याज की है, के रूप में वेक्टर-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं वैक्सीन प्रतिजन28के खिलाफ एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में बाधा हो सकती है । नोट की है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, दोनों आबादी एक साथ एक ही tetramer धुंधला में quantified जा सकता है, जिससे धुंधला परिवर्तनशीलता और नमूना मात्रा को कम करने । हालांकि, उचित माप और विश्वसनीय डेटा सुनिश्चित करने के लिए कुछ कदम सावधानीपूर्वक किए जाने की आवश्यकता है । यदि विश्लेषण के लिए पूंछ नस से रक्त का उपयोग कर, एक के लिए पूर्व सुनिश्चित करना चाहिए जानवरों vasodilation24प्रेरित करने के लिए गर्म । इस प्रकार, पर्याप्त रक्त एक कम समय में एकत्र किया जा सकता है, जानवरों पर तनाव कम हो जाता है और विश्लेषण ज्यादा बेहतर है, के रूप में अगर खून धीरे से एकत्र की तुलना में है । इसके अलावा, नमूना संग्रह के बाद (या तो रक्त या अंगों), प्रत्यक्ष धुंधला TCR downregulation के कारण झूठी नकारात्मक परिणाम से बचने के लिए सिफारिश की है. एक ही सभी क्रमिक चरणों के लिए लागू होता है: प्रक्रिया और बाधित नहीं किया जाना चाहिए सभी धुलाई कदम कम संख्या में (के रूप में प्रोटोकॉल में कहा गया है) । उचित धुंधलाना सुनिश्चित करने के लिए, देखभाल के भंवर के लिए लिया जाना चाहिए सभी समाधान और नमूनों से पहले और मशीन के बाद । इस नमूने फिक्सिंग कोशिकाओं के झुरमुट से बचने के लिए पहले विशेष रूप से महत्वपूर्ण है ।

प्रोटोकॉल को संशोधित करने के संदर्भ में, विश्लेषण के उद्देश्य के आधार पर अन्य सतह मार्करों और tetramers का उपयोग किया जा सकता है । हालांकि, सभी reagent तो titrated, पूरी धुंधला पैनल के साथ संयोजन में बेहतर होने की जरूरत है । यहां निर्दिष्ट tetramers में से कुछ के लिए, अनुकूलन से पता चला कि हम निर्माता द्वारा अनुशंसित कमजोर पड़ने को बढ़ा सकते है (1:10 अनुशंसित, 1:25 अनुकूलित) (तालिका 1) । वर्णक्रमीय ओवरलैप क्षतिपूर्ति करने के लिए, मुआवजा मोतियों की जगह सना हुआ कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है । tetramer-युग्मित fluorochrome के चुनाव के संबंध में, उज्ज्वल fluorochromes का उपयोग करने के लिए एक परिकल्पना की जानी चाहिए, क्योंकि यह पता लगाने की सुविधा देता है-खासकर जब सिग्नल कम हो । Dolton और29सहयोगियों के रूप में, हम पीई या APC-युग्मित tetramers, जो पूरी तरह से एक भी धुंधला और सीडी 8+ टी कोशिकाओं में एक एकल प्रतिजन विशिष्टता के साथ संयुक्त किया जा सकता है अच्छी तरह से पता लगाया जा सकता है (चित्रा 2) का उपयोग करना पसंद करते हैं । तापमान और गर्मी के समय के बारे में, tetramer धुंधला स्थितियों की एक किस्म मौजूद हैं । हमारे अनुकूलन की प्रक्रिया में, हम इस मुद्दे को संबोधित किया और विभिंन स्थितियों (जैसे 4 डिग्री सेल्सियस, कमरे के तापमान या ३७ डिग्री सेल्सियस) पर धुंधला tetramer प्रदर्शन । प्राप्त परिणामों से, हम ३७ डिग्री सेल्सियस, जो30,31साहित्य के साथ सामंजस्य में है पर 20 मिनट के लिए दाग की सिफारिश । लंबे समय तक गर्मी से बचना चाहिए, के रूप में इस tetramer30 और झूठी नकारात्मक परिणामों के internalization के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

सीडी 8+ कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सही एंटीबॉडी का चुनाव एक और महत्वपूर्ण मुद्दा है, जो ध्यान से विचार (और संभावित अनुकूलित) है । यह तथ्य यह है कि कुछ विरोधी सीडी 8 एंटीबॉडी क्लोन TCR को tetramers के बंधन ब्लॉक मानव३२ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से माउस३३ नमूनों से उठता है । हमारे tetramer धुंधला प्रोटोकॉल के लिए, हम क्लोन 53-6.7 murine सीडी 8 के लिए दाग+ कोशिकाओं-एक क्लोन है जो ब्लॉक नहीं है, लेकिन बल्कि tetramer धुंधला बढ़ाता है का चयन किया ।

Tetramer धुंधला बजाय जटिल है जब टी सेल प्रतिक्रिया के शिखर पर प्रमुख प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण, उदाहरण के लिए । हालांकि, वहां आबादी है जो थोड़ा और अधिक ' समस्याग्रस्त ' हो सकता है । इस तरह के उदाहरणों में कम संबध एंटीजन (ट्यूमर, स्व) के लिए विशिष्ट कोशिकाओं को शामिल, हाल ही में सक्रिय कोशिकाओं को जो बाद में नीचे अपने रिसेप्टर्स या दुर्लभ सेल सबसेट (जैसे भोली अग्रदूत या स्मृति कोशिका आबादी) विनियमित. इन मामलों में, शास्त्रीय tetramer धुंधला प्रोटोकॉल में सुधार करने के लिए या अंय विधियों के साथ संयोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । उदाहरण के लिए, प्रोटीन कळेनासे अवरोधक (PKI) dasatinib TCR internalization को रोकता है और tetramer धुंधला करने से पहले शामिल किया जा सकता है । Tetramers भी tetramer धुंधला होने के बाद विरोधी fluorochrome unconjugated प्राथमिक Abs सहित द्वारा स्थिर किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति तीव्रता एक दूसरे विरोधी अटल बिहारी fluorochrome-संयुग्मित एबी29,३४,३५,३६के अलावा द्वारा बढ़ाया जा सकता है । हम इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट tetramers के लिए चुनिंदा शर्तों अनुकूलित और PKI या अतिरिक्त Abs शामिल नहीं था । हालांकि, किसी भी अंय tetramer के लिए, इष्टतम शर्तों को व्यक्तिगत रूप से समायोजित किया जाना है । दुर्लभ आबादी के संबंध में, tetramer धुंधला करने के लिए चुंबकीय संवर्धन11के साथ संयुक्त की आवश्यकता हो सकती है ।

को सुविधाजनक बनाने और tetramer धुंधला के FACS विश्लेषण मांय, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम हमेशा ब्याज की हमारी tetramer के साथ एक ही तनाव के एक भोले माउस की कोशिकाओं दाग । वैकल्पिक रूप से, नमूने अप्रासंगिक पेप्टाइड्स के साथ tetramers के साथ दाग किया जा सकता है, लेकिन ब्याज की tetramer के रूप में एक ही fluorochrome के साथ । इस तरह के नियंत्रण झूठी सकारात्मक संकेतों को बाहर करने के लिए आवश्यक हैं, उदाहरणके लिए, मरने कोशिकाओं से उद्भव. इस के अलावा, यह एक जीवित/मृत दाग, जैसे propidium आयोडाइड (PI) को शामिल करने के लिए अनुशंसित है । यह विशेष महत्व का है अगर कोशिकाओं अलगाव के बाद सीधे दाग नहीं हैं । autofluorescence पृष्ठभूमि को हटाने के लिए एक अंय रणनीति में एक चैनल में कई गैर टी सेल मार्कर शामिल हो सकता है । इस चैनल में पॉजिटिव सेल को छोड़कर, नॉन टी सेल की आबादी को बाहर रखा जा सकता है । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक ओटी से एक नमूना-1 माउस ओवा tetramer के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, उदाहरण के लिए. अन्य tetramers के लिए, यह व्यक्तिगत रूप से चुना जाना है (उदाहरणके लिए, एक माउस से नमूना है, जो कई बार प्रतिरक्षित था). एक जैसे दूसरों३७, हम भी प्रभाव टी सेल प्रतिक्रिया के 7 दिन में CTL सक्रियण के दौरान सीडी 8 रिसेप्टर के नीचे एक विनियमन का पालन । इसलिए, सक्रिय tetramer+ प्रभावक टी कोशिकाओं के नुकसान से बचने के लिए, हम विश्लेषण में सीडी 8कम कोशिकाओं को शामिल करने के लिए सलाह देते हैं (कम से कम अगर प्रभाव चरण में मापने).

गुणवत्ता और जानकारी की राशि एक इस प्रोटोकॉल से प्राप्त कर सकते है प्रतिजन के बारे में ज्ञान पर निर्भर है अध्ययन किया जा करने के लिए, उपलब्धता और tetramer की विशिष्टता और FACS मशीन की गुणवत्ता (पराबैंगनीकिरण और उपलब्ध डिटेक्टरों की संख्या) । यदि पशु के नमूनों के साथ काम करना, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में परिवर्तन प्राकृतिक और अपरिहार्य है । इसलिए, tetramer धुंधला से सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए, कम से कम 3-5 जानवरों का विश्लेषण किया जाना चाहिए । यदि ऐसा किया, प्रोटोकॉल यहां वर्णित विश्वसनीय और reproducible परिणाम दे देंगे (एक प्रयोग से अनुकरणीय परिणाम पूरक तालिका 1 में पाया जा सकता है) । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, इस विधि पूरी तरह से सीडी 8+ टी कोशिकाओं की phenotype और प्रतिजन-विशिष्टता यों तो उपयुक्त है (चित्रा 3, 4; पूरक चित्रा 1), न केवल माउस में बल्कि मनुष्यों में भी. हालांकि, इस तरह के granzyme-प्रेरित कोशिका मृत्यु, आईसीएस और/या ELISpot के रूप में सीडी 8+ टी सेल प्रभाव कार्य, विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए । हालांकि, एक ध्यान में रखना चाहिए कि टी सेल कार्य, के रूप में इन विट्रो उत्तेजना vivo में वास्तविक स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है द्वारा मापा । vivo में, एक दमन वातावरण इन विट्रो में मापा जाता है जो टी सेल कार्यों को रोकने हो सकता है ।

अपने दम पर, tetramer धुंधला सभी जानकारी प्रदान नहीं करता है, लेकिन यह टी सेल प्रतिक्रियाओं की विशेषता के लिए एक आवश्यक विधि बन गया है और एक बहुत ही संवेदनशील तरीके से३८में इन विट्रो में टी सेल सबसेट को बढ़ाता है । Tetramers केवल कुछ सबसेट यों तो, लेकिन भी उन३९को अलग करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, उंहें स्थानीय में द्वारा सीटू संकरण19,20 और अध्ययन कम-संबध एंटीजन, जैसे ट्यूमर से जुड़े४०, ४१. tetramer प्रौद्योगिकी4की खोज के बाद से, tetramer धुंधला टी-सेल विश्लेषण और आवेदनों की सीमा में एक अनिवार्य उपकरण बन गया है ।

Disclosures

Dorothee वॉन Laer VSV-जीपी के एक आविष्कारक है और जैव प्रौद्योगिकी कंपनी ViraTherapeutics GmbH, जो VSV के लिए बौद्धिक संपदा अधिकार-जीपी धारण में अल्पसंख्यक शेयरों रखती है । अंय लेखकों के लिए, कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों मौजूद हैं ।

Acknowledgments

इस परियोजना के FWF ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (परियोजना संख्या पी २५४९९-B13) और यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम के तहत अनुदान समझौते No. ६८१०३२ द्वारा वित्त पोषित किया गया । निम् नलिखित रिएजेंट को NIH Tetramer कोर सुविधा के माध् यम से प्राप् त किया गया था: क्लास आइ MHC Tetramer फॉर vesicular stomatitis वायरस nucleoprotein (RGYVYQGL) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Safety cabinet class 2 VWR LBCP302411030
Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) BD 338962
Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) Fisher Scientific Co. L.L.C. NC0887833
Binocular microscopes, VisiScope 100 VWR 630-1553
Vortex mixer Phoenix Instrument RS-VA 10
Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) Hettich 5660
Sterile Scalpel Blades Nr. 10 Braun BB510
Cell strainer 40 µm Sigma CLS431750
Cell strainer 70 µm Sigma CLS431751
Neubauer counting chamber VWR 630-1506
Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) Eppendorf 4924000037, 4924000061, 4924000088
Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL) Biozym 770050, 770200, 770400
Pipet Boy Integra 155 000
Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) Sarstedt 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Multistep Pipette, HandyStep S BRAND 705110
12.5 mL Combitips for Multistep Pipette BrandTech Scientific 702378
Microvette CB 300 K2E Sarstedt 16.444
Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) Sarstedt 72.692.005, 62.547.254
FACS tubes (non-sterile) Szabo Scandic BDL352008
PBS Lonza LONBE17-516F
Heat-inactivated FCS ThermoFisher Scientific 10500064
Formaldehyde Roth 4979.1
Sodium azide Roth K305.1
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex BD 560591 Clone 17A2; Lot # 7235504
Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a BD 558106 Clone 53-6.7; Lot # 5058904
V450 Rat anti-Mouse CD8a BD 560469 Clone 53-6.7; Lot # 5205945
FITC anti-mouse CD43 BioLegend 121206 Clone 1B11; Lot # B233778
PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 BD 553135 Clone IM7; Lot # 85660
APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L BD 560514 Clone MEL-14; Lot # 7215801
OVA-tetramer/APC MBL TB-5001-2 SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008
VSV NP-tetramer/PE MBL TS-M529-1 RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007
EGFP-tetramer/PE MBL TS-M525-1 HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004
LCMV-GP-tetramer/APC MBL TB-5002-2 KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006
HPV 16 E7-tetramer/APC MBL TB-5008-2 RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tober, R., et al. VSV-GP: a potent viral vaccine vector that boosts the immune response upon repeated applications. Journal of virology. 88 (9), 4897-4907 (2014).
  2. Muik, A., et al. Re-engineering vesicular stomatitis virus to abrogate neurotoxicity, circumvent humoral immunity, and enhance oncolytic potency. Cancer Reseaerch. 74 (13), 3567-3578 (2014).
  3. Eales, L. J., Farrant, J., Helbert, M., Pinching, A. J. Peripheral blood dendritic cells in persons with AIDS and AIDS related complex: loss of high intensity class II antigen expression and function. Clinical and Experimental Immunology. 71, 423-427 (1988).
  4. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  5. Tetramers and Monomers. , Available from: https://www.mblintl.com/products/research/monomer-tetramers/filter/product_type/monomer,peptide,tetramer (2016).
  6. NIH Tetramer Core Facility. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/ (2010).
  7. Class I MHC Tetramer Preparation: Overview. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/support/protocols (2010).
  8. Wolfl, M., et al. Quantitation of MHC tetramer-positive cells from whole blood: evaluation of a single-platform, six-parameter flow cytometric method. Cytometry A. 57 (2), 120-130 (2004).
  9. Burrows, S. R., et al. Peptide-MHC class I tetrameric complexes display exquisite ligand specificity. The Journal of Immunology. 165 (11), 6229-6234 (2000).
  10. Sims, S., Willberg, C., Klenerman, P. MHC-peptide tetramers for the analysis of antigen-specific T cells. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 765-774 (2010).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. The Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  12. Xie, Y., et al. A novel T cell-based vaccine capable of stimulating long-term functional CTL memory against B16 melanoma via CD40L signaling. Cellular & Molecular Immunology. 10 (1), 72-77 (2013).
  13. Nanjundappa, R. H., Wang, R., Xie, Y., Umeshappa, C. S., Xiang, J. Novel CD8+ T cell-based vaccine stimulates Gp120-specific CTL responses leading to therapeutic and long-term immunity in transgenic HLA-A2 mice. Vaccine. 30 (24), 3519-3525 (2012).
  14. Bowers, E. V., Horvath, J. J., Bond, J. E., Cianciolo, G. J., Pizzo, S. V. Antigen delivery by alpha(2)-macroglobulin enhances the cytotoxic T lymphocyte response. Journal of Leukocyte Biology. 86 (2), 1259-1268 (2009).
  15. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. The Journal of Immunology. 88 (20), 12006-12016 (2014).
  16. Sakai, K., et al. Dendritic cell-based immunotherapy targeting Wilms' tumor 1 in patients with recurrent malignant glioma. Journal of Neurosurgery. 123 (4), 989-997 (2015).
  17. Rosaely, C. G., et al. Immune responses to WT1 in patients with AML or MDS after chemotherapy and allogeneic stem cell transplantation. International Journal of Cancer. 138 (7), 1792-1801 (2016).
  18. Shane, H. L., Reagin, K. L., Klonowski, K. D. The Respiratory Environment Diverts the Development of Antiviral Memory CD8 T Cells. The Journal of Immunology. , (2018).
  19. Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. The Journal of Visualized Experiments. (127), e56130 (2017).
  20. De Vries, I. J. M., et al. In situ detection of antigen-specific T cells in cryo-sections using MHC class I tetramers after dendritic cell vaccination of melanoma patients. Cancer Immunology Immunotherapy. 56 (10), 1667-1676 (2007).
  21. Tan, H. X., et al. Induction of vaginal-resident HIV-specific CD8 T cells with mucosal prime-boost immunization. Mucosal Immunology. , (2017).
  22. Huang, H., et al. CD8(+) T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), (2017).
  23. Hensel, M. T., et al. Selective Expression of CCR10 and CXCR3 by Circulating Human Herpes Simplex Virus-Specific CD8 T Cells. Journal of Virology. 91 (19), (2017).
  24. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
  25. ACK Lysis Buffer. , Available from: http://www.cshprotocols.cshlp.org/content/2014/11/pdb.rec083295.short (2014).
  26. San Jose, E., Borroto, A., Niedergang, F., Alcover, A., Alarcon, B. Triggering the TCR complex causes the downregulation of nonengaged receptors by a signal transduction-dependent mechanism. Immunity. 12 (2), 161-170 (2000).
  27. Dietrich, J., Hou, X., Wegener, A. M., Geisler, C. CD3 gamma contains a phosphoserine-dependent di-leucine motif involved in down-regulation of the T cell receptor. EMBO Journal. 13 (9), 2156-2166 (1994).
  28. Schone, D., et al. Immunodominance of Adenovirus-Derived CD8(+) T Cell Epitopes Interferes with the Induction of Transgene-Specific Immunity in Adenovirus-Based Immunization. Journal of Virology. 91 (20), (2017).
  29. Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide–MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
  30. Whelan, J. A., et al. Specificity of CTL Interactions with Peptide-MHC Class I Tetrameric Complexes Is Temperature Dependent. The Journal of Immunology. 163 (8), 4342-4348 (1999).
  31. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide–MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
  32. Denkberg, G., Cohen, C. J., Reiter, Y. Critical role for CD8 in binding of MHC tetramers to TCR: CD8 antibodies block specific binding of human tumor-specific MHC-peptide tetramers to TCR. The Journal of Immunology. 167 (1), 270-276 (2001).
  33. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. The Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 335-346 (2000).
  34. Tungatt, K., et al. Antibody stabilization of peptide-MHC multimers reveals functional T cells bearing extremely low-affinity TCRs. The Journal of Immunology. 194 (1), 463-474 (2015).
  35. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. Journal of Immunological Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  36. Rius, C., et al. Peptide-MHC Class I Tetramers Can Fail To Detect Relevant Functional T Cell Clonotypes and Underestimate Antigen-Reactive T Cell Populations. The Journal of Immunology. 200 (7), 2263-2279 (2018).
  37. Xiao, Z., Mescher, M. F., Jameson, S. C. Detuning CD8 T cells: down-regulation of CD8 expression, tetramer binding, and response during CTL activation. The Journal of Experimental Medicine. 204 (11), 2667-2677 (2007).
  38. McMichael, A. J., O'Callaghan, C. A. A New Look at T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 187 (9), 1367-1371 (1998).
  39. Hunsucker, S. A., et al. Peptide/MHC tetramer-based sorting of CD8(+) T cells to a leukemia antigen yields clonotypes drawn nonspecifically from an underlying restricted repertoire. Cancer Immunology Research. 3 (3), 228-235 (2015).
  40. Pittet, M. J., et al. Ex vivo analysis of tumor antigen specific CD8+ T cell responses using MHC/peptide tetramers in cancer patients. International Immunopharmacology. 1 (7), 1235-1247 (2001).
  41. Cohen, C. J., et al. Isolation of neoantigen-specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3981-3991 (2015).

Tags

इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू १४१ माउस ब्लड प्रतिजन-विशिष्ट CTLs MHC आई FACS tetramer phenotyping ठहराव प्रतिरक्षण
विरोधी के एक साथ ठहराव वेक्टर और विरोधी transgene-विशिष्ट सीडी 8<sup>+</sup> टी कोशिकाओं के माध्यम से MHC मैं एक वायरल वेक्टर के साथ टीकाकरण के बाद दाग Tetramer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilmschen, S., Banki, Z., von Laer,… More

Wilmschen, S., Banki, Z., von Laer, D., Kimpel, J. Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector. J. Vis. Exp. (141), e58680, doi:10.3791/58680 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter