Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el ex vivo cualitativamente específica de antígeno CD8+ T las células. Análisis es posible con suspensiones de la célula de órganos o de pequeñas cantidades de sangre. Una amplia gama de estudios requieren el análisis de las respuestas de la célula de T citotóxica (vacunación y estudios de inmunoterapia del cáncer).
Abstract
A infección viral, específica de antígeno CD8+ las células T citotóxicas (CTL) se presentan y contribuir a la eliminación de las células infectadas para prevenir la propagación de agentes patógenos. Por lo tanto, la frecuencia del antígeno específico CTLs es indicativa de la fuerza de la respuesta de células T contra un antígeno específico. Dicho análisis es importante en la inmunología básica, desarrollo de vacunas, Inmunobiología del cáncer y la inmunología adaptativa. En el campo de la vacuna, la respuesta CTL dirigida contra los componentes de un vector viral Co determina qué tan eficaz es la generación de células de antígeno-específico contra el antígeno de interés (es decir,, transgen). Antígeno específico CTLs pueden detectarse ya sea por estimulación con péptidos específicos seguidos por citoquinas intracelulares la coloración o tinción directa de los receptores específicos de antígeno de la célula de T (TCRs) y análisis por citometría de flujo. El primer método es bastante lento ya que requiere el sacrificio de animales para aislar células de órganos. Además, requiere aislamiento de sangre de animales pequeños que es difícil de realizar. Este último método es más rápido, puede hacerse fácilmente con pequeñas cantidades de sangre y no es dependiente en las funciones efectoras específicas, como la actividad citolítica. Tetrámeros de MHC son una herramienta ideal para la detección específica de antígeno TCR.
Aquí, describimos un protocolo para detectar simultáneamente antígeno específico CTLs para los péptidos inmunodominante del vector viral VSV-GP (GP de LCMV, VSV-NP) y los transgenes (OVA, VPH 16 E7, eGFP) por MHC I tetrámero coloración y flujo cytometry. La coloración es posible directamente de la sangre o de suspensiones celulares solo de órganos, como bazo. Sangre o suspensiones de la célula de órganos se incuban con tetrámeros. Después de la tinción con los anticuerpos CD3 y CD8, antígeno específico CTLs se cuantifican mediante citometría de flujo. Opcionalmente, se puede incluidos para determinar el estado de activación de CD8 específica de antígeno anticuerpos contra CD43, CD44, CD62L u otros+T las células y para discriminar entre ingenuo y efectoras de las células.
Introduction
El objetivo de este método es evaluar la frecuencia de respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a los antígenos (múltiples) en el ratón mediante el análisis cytometric del flujo sin necesidad de estimulación péptido desperdiciador de tiempo. Este método analiza la especificidad de antígeno y el fenotipo de subconjuntos CTL, en una única coloración. Hemos optimizado el complejo de histocompatibilidad mayor I (MHC I) tetrámero protocolo para analizar la eficacia de los nuevos enfoques de la vacuna, como VSV-GP, una nueva variante de virus de estomatitis vesicular (VSV), donde la glicoproteína G de VSV se ha sustituido por la coloración la glicoproteína GP del linfocítico choriomeningitis virus (LCMV)1,2. Además de la respuesta humoral, un importante indicador de la efectividad de una vacuna es la inducción de una respuesta CTL contra uno o varios antígenos. Como la consistencia y durabilidad de la respuesta celular están importantes en este contexto, es favorable para monitorizar la cinética de las respuestas CTL del mismo animal. Esto también conducirá a una reducción del número de animales, un aspecto importante con respecto a los principios de las "3Rs"3. Por lo tanto, análisis de tan poco como 20 μl de sangre es óptima para este propósito.
Tetrámeros fueron desarrollados a finales de los 904 y se convirtió en una herramienta importante en el campo de la inmunología de la célula de T. Tetrámeros son complejos marcada con fluorescencia de cuatro MHC I / moléculas péptido, que se unen a TCR, específico para un solo péptido. Hoy en día, se pueden ya comprar confeccionado5, pedido personalizado de forma gratuita en las instalaciones de base tetrámero de NIH en la Universidad de Emory6 o producidos en el laboratorio7. MHC y tetrámeros II están disponibles, , es decir, para CD8+ y CD4+ T de las células, respectivamente. La potencia de la tinción de tetrámero se encuentra en ahorro de tiempo, algo simple y fácil de estandarizar protocolos de8 y9de la sensibilidad. Además, si trabaja con sangre, animales no necesita ser sacrificado y se requieren cantidades mínimas de muestra. Una medición no se limita a un solo antígeno, pero pueden analizarse varios antígenos en una coloración cuando la combinación de tetrámeros conjugado con diferentes fluoróforos. Antígenos recién descubiertos, por ejemplo, de pantallas de péptido, fácilmente pueden incorporados en tetrámeros y utilizados para la cuantificación del subconjunto de células T.
La tinción de tetrámero no dará información sobre la funcionalidad CTL (es decir., producción de citoquinas, funciones efectoras), pero sólo de especificidad. Para obtener información sobre funcionalidad de la célula de T, citoquinas intracelulares (ICS) la coloración o necesidades análisis de enzima vinculada inmuno Spot (ELISpot) que realizó8,10. La tinción de tetrámero y ICS/biológico, sin embargo, no son redundantes pero más bien complementan. Estimulación in vitro para inducir la producción de citoquinas para ICS/extrapolación alterará el fenotipo de célula T original. Tetrámero de tinción, por el contrario, deja la célula T Virgen; el fenotipo original se conserva y puede ser analizado. También, otra gran ventaja de tetrámeros es que la coloración puede combinarse con clasificación magnética y enriquecimiento de las células antígeno específicas11. Esto permite el análisis de raras poblaciones, así como cultivo de células clasificadas con antígeno-especificidades definidas — una característica que no es posible con otros métodos.
Utilizando el protocolo descrito aquí, la tinción de tetrámero, así como ICS/extrapolación se puede realizar de un órgano, porque solamente muy poco material (sangre: 20 μl; bazo: 1 x 106 células) se requiere para la tinción de tetrámero. Sin embargo, dependiendo de la frecuencia de las células antígeno específicas de interés, la fuerza del TCR respectivo y en el contexto experimental, la cantidad de células necesarias deba ampliarse o enriquecimiento magnético que deba aplicarse.
Tetrámeros son ampliamente utilizados, por ejemplo, para evaluar la efectividad de las vacunas (antitumoral)12,13,14,15 o inmunoterapia16,17, análisis fenotípico y espacial localización de la célula de T antígeno-específica subconjuntos18,19,20,21,22,23. El método descrito aquí es ideal para estudios, que tienen como objetivo incluir la cuantificación y análisis fenotípico de murino específico antígeno CD8+ T las células en su análisis de manera rápida y conveniente.
Protocol
Todos los métodos descritos fueron realizados en cumplimiento de la nacional ley austríaca de experimentación de animales ("Tierversuchsgesetz"), y permiso prueba animal fue otorgado por las autoridades nacionales austríacos.
1. tampón preparación y recogida de la muestra
Nota: La cepa de ratón utilizada depende el epitopo analizado. Elegir un tetrámero apropiado que se une a un MHC tipo expresado en los ratones, por ejemplo,, H - 2Kb para los ratones C57BL/6. El género y la edad de los animales dependerá de la pregunta científica. Para la mayoría de los experimentos descritos aquí, utilice ratones hembra en 6 a 8 semanas de edad al inicio del experimento, es decir,, primera inmunización.
- Preparar el tampón FACS (solución salina tamponada con fosfato (PBS) + suero de ternera fetal 1% (FCS) + 0.1% de azida de sodio + ácido de 2 mM etilendiaminotetracético (EDTA) y FACS fijación buffer (1,5% (v/v) el formaldehído en PBS).
Nota: Se recomienda que ambos búferes están preparados de antemano. Almacenados a 4 ° C hasta su uso. - Sangre: Recoger 20 μl de sangre por el ratón de la vena de la cola del ratón en tubos recubiertos de EDTA, como se describe previamente24.
Nota: Sangre se puede recoger también por otras vías, por ejemplo, vena facialis o retro orbitario seno. Sin embargo, el método de colección de sangre tiene que ser conforme a la ley nacional experimentación animal y aplicaciones de prueba animal. Colección de sangre de la vena de la cola es ideal para estudios donde se necesitan varias veces pequeñas cantidades de sangre. Material adicional se requiere para controles de compensación y el control no manchados. - Bazo: Aislar el órgano y, con la ayuda del émbolo de una jeringa, presione a través de 70 nm y tamiz de 40 μm de la célula. Realizar la lisis de los eritrocitos, como se describe en el paso 6 y cuenta. Ajustar la concentración a 1 x 107 células/mL en PBS. Por ejemplo, 1 x 106 células son necesarias.
Nota: Siempre incluyen algunos vacunados simulado o control de vectores inmunizados animales como control negativo. Para ovoalbúmina (OVA)-tetrámero, una muestra de los ratones de OT-1 podría ser utilizado como control positivo. No te olvides sin manchas y los controles de compensación en el cálculo. Si es necesario, muestras de diferentes animales en el experimento pueden combinarse para esto. - Después de la recolección de la muestra, proceder directamente con la tinción.
2. preparación de tinción
- Preparar un tubo de FACS para cada muestra. Etiquetar los tubos adecuadamente y transferir 100 μL de suspensión de órganos (1 x 106 células) o 20 μL de sangre en cada tubo.
- Bazo: Centrifugar durante 5 min a 600 x g a 4 – 8 ° C y descarte el sobrenadante. Vortex para Resuspender el precipitado de células.
Nota: Esto resultará en un volumen restante de alrededor de 20 μl, similar como el volumen de las muestras de sangre. - Para que cada canal también preparar un tubo de FACS para una muestra de compensación. Preparar una muestra adicional como control sin manchas.
3. la tinción de tetrámero
-
Para cada muestra usar 50 μL de la dilución del tetrámero. Sugerido tetrámeros y diluciones optimizadas, consulte la tabla 1.
Nota: Cuando se trabaja con anticuerpos o tetrámeros, apagar la luz de la seguridad en el gabinete y proteger muestras de la luz.- Preparar un tubo con tampón FACS (volumen = 50 μL × número de muestras más 10% adicional del volumen total para compensar errores de pipeteo).
- Añadir tetramer(s) en una disolución óptima, como se indica en la tabla 1. Vórtice de la solución.
Nota: Cuando se utiliza el panel de anticuerpos todo (CD3, CD8, CD43, CD44, CD62L) con fluoróforos enumerados, se pueden incluidas dos tetrámeros (en PE y APC). Dos tetrámeros se pueden combinar en una única coloración, es decir,, coloración de células con dos tetrámeros puede realizarse de forma simultánea.
| Tetrámero | Secuencia de péptido | Alelo | Fluoróforo | Dilución |
| MHC I / OVA | SIINFEKL | H - 2Kb | APC | 1:25 |
| MHC I/VSV-NP | RGYVYQGL | H - 2Kb | PE | 1:25 |
| MHC I / EGFP | HYLSTQSAL | H-2Kd | PE | 1:25 |
| MHC I/LCMV-GP | KAVYNFATC | H-2Db | APC | 1:25 |
| MHC I / VPH 16 E7 | RAHYNIVTF | H-2Db | APC | 1:10 |
Tabla 1: sugirió tetrámeros y diluciones óptimas. Tetrámeros recomendados para algunos péptidos inmunodominante de modelo antígenos (ovoalbúmina (OVA) y mayor proteína verde fluorescente (eGFP)) o componentes del patógeno (Estomatitis Vesicular (VSV) virus de la nucleoproteína (NP), linfocítico del Choriomeningitis Virus (LCMV ) De la glicoproteína (GP) y de la oncoproteína E7 de papilomavirus humano (PVH) (E7)). Para cada uno, la secuencia del péptido y alelo correspondiente, así como recomendado fluoróforo y dilución optimizado cotiza.
- Añadir 50 μL de dilución de tetrámero a cada muestra y agitar suavemente. Añadir tampón FACS (sin tetrámero) a los controles de compensación y a la muestra sin manchas.
- Incubar las muestras durante 20 min a 37 ° C, protegido de la luz. Para asegurar una transición fluida de tetrámero a la coloración del anticuerpo, preparar la mezcla de anticuerpos como se describe en el paso 4 durante el tiempo de incubación.
Nota: Para cada tetrámero individual, las condiciones óptimas (dilución, temperatura y tiempo de incubación) deben ajustarse.
4. preparación de anticuerpos
-
Para cada muestra, preparar 50 μl de mezcla de anticuerpos.
- Preparar un tubo con tampón FACS (volumen = 50 μL × número de muestras más 10% adicional del volumen total para compensar errores de pipeteo).
- Añadir anticuerpos en las diluciones que se enumeran en la tabla 2.
Nota: Dependiendo de la pregunta científica, podrían utilizarse otras combinaciones de marcador aparte de la descrita aquí. Asegúrese de siempre incluir los anticuerpos CD3 y CD8 en el panel. - Vórtice de la solución.
| Anticuerpo | Fluoróforo | Dilución | μg/muestra | Marcador |
| CD3 | PE-Cy7 | 1: 200 | 0.05 | CTL (CD3+CD8+) |
| CD8 | Azul Pacífico | 1:750 | 0.013 | |
| V450 | 1: 100 | 0.1 | ||
| CD43 | FITC | 1: 100 | 0.25 | Activación (CD43+) |
| CD44 | PE-Cy5 | 1: 250 | 0.04 | Ingenua (CD44–CD62L+) y efectores (CD44+CD62L–) |
| CD62L | APC-Cy7 | 1: 500 | 0.02 |
Tabla 2: anticuerpos que se usan en este protocolo y las diluciones óptimas. Marcadores de superficie recomendados (CD3, CD8, CD43, CD44 y CD62L) aparecen en la primera columna. Para cada uno, figuran el fluoróforo recomendada, optimizado de la dilución y cantidad de anticuerpo/muestra. En la última columna, se especifica el tipo de la célula identificado con cada marcador.
-
Preparación de anticuerpos para los controles de compensación. Para cada control de compensación, utilizan un anticuerpo contra CD8 en el respectivo color.
- Para cada canal, preparar un tubo con 200 μL de tampón FACS y añadir 1 μL de un anticuerpo de dilución 1: 200 contra CD8 en el respectivo color.
- Vórtex los tubos.
- Inmediatamente proceder con la coloración.
5. tinción de muestras
- Lavar las muestras una vez agregando ~ 1 mL de tampón FACS y centrifugar durante 5 min a 600 x g a 4 – 8 ° C. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante y drena el líquido restante sobre una pila de toallas de papel.
Nota: Cuando se trabaja con sangre, sea precavido al drenaje de líquido restante. Antes de la lisis de eritrocitos, sangre no se adhieren a la parte inferior del tubo del FACS. Por otra parte, aspirar el sobrenadante. - Añadir 50 μL de la mezcla de anticuerpos a cada pellet celular y agitar suavemente.
- Añadir 50 μL de cada mezcla de compensación a la pelotilla de la célula del control correspondiente de compensación y vórtice suavemente.
- Añadir 50 μL de tampón FACS para la pelotilla de la célula del control sin manchas y de vortex suavemente.
- Incubar las muestras durante 30 min a 4 ° C, protegido de la luz.
- Cuando se trabaja con los órganos: omita el paso 6. Lave una vez agregando ~ 1 – 2 mL de tampón FACS y centrifugar durante 5 minutos a 600 x g a 4 – 8 ° C. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante y drena el líquido restante sobre una pila de toallas de papel.
- Cuando se trabaja con sangre: proceda al paso 6 (lisis de los eritrocitos).
6. lisis de los eritrocitos
- Añadir 500 μL de tampón ACK (amonio cloruro de potasio)25 a cada muestra y vortex.
Nota: Buffer ACK dará lugar a la hinchazón osmótica y la lisis de los eritrocitos. - Incubar por 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Añadir 1 mL de tampón FACS y centrifugar durante 5 min a 600 x g a 4 – 8 ° C. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante y drena el líquido restante sobre una pila de toallas de papel.
Nota: Cuando el sedimento está algo rojo, repita la lisis de los eritrocitos. - Lave una vez agregando ~ 1 – 2 mL FACS de tampón y centrifugar durante 5 min a 600 x g a 4 – 8 ° C. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante y drena el líquido restante sobre una pila de toallas de papel.
7. Análisis y medición de citometría de flujo
- Añadir 150 – 300 μL de tampón fijación de FACS a cada tubo y mezclar con un vórtex. De 20 μl de sangre, 150 μL de tampón es suficiente.
Nota: Antes de la fijación, asegúrese de que las células son bien resuspendidas para evitar formación de grumos. Proceder con la medición de la citometría de flujo lo antes posible. - Los controles de compensación de medir y corregir cualquier superposición espectral.
-
Configurar puertas secuenciales, como se muestra en la figura 1 seleccionar para CD3+/CD8+ las células.
- Puerta en linfocitos con dispersión hacia delante y hacia un lado (área) (escala no logarítmica).
- Dentro de la población de linfocitos, la puerta en las células usando scatter delantero ancho vs área (escala no logarítmica).
- Parcela los linfocitos de célula utilizando canales de CD3 y CD8 (escala logarítmica). Identificar CD8 células+ T por compuerta en CD3+/CD8+ las células.
- Parcela CD8+ vs tetrámero+ células y puerta en CD8 células+ tetrámero+ , como se muestra en la figura 2.
- Si es posible, registrar 20.000 células (por lo menos 5.000 de sangre) en el CD3+/CD8+ de compuerta para cada muestra y guardar como un archivo de FCS.
Nota: La cantidad de células para grabar deba ajustarse la frecuencia de las células antígeno específicas de interés. - Analizar archivos FCS con el software de análisis apropiado. Utiliza la estrategia bloquea, como se describe anteriormente (sección 7.3) y cuantificar CD8+ + tetrámero de células.
Representative Results
Figura 1 muestra cómo la puerta correctamente en las células diana del presente Protocolo, a saber, CD3+/CD8+ las células. Es de notar que activa las células a menudo downregulate la célula de T del receptor26,27 y, por lo tanto, las célulasbajo CD3 deben incluirse también en la compuerta. Después de bloquear el CD3+/CD8+ células, tetrámero positiva de células pueden ser identificadas (figura 2). Representante de blots para un ratón de control negativo (ingenuo), así como animales bien vacunados con cualquiera Adenovirus secretoras de OVA 5 (Adeno-OVA) o expresando OVA VSV-GP (VSV-GP-OVA) se muestran. Como se ve en las manchas blancas /negras bajas dos diferentes tetrámeros pueden combinarse en el mismo tubo para tinción. Esto permite la cuantificación simultánea de dos diferentes especificidades CTL: virus-específica (VSV N) y CTLs transgén específico (OVA). Confirmamos que los stainings tetrámero individuales y dobles dan porcentajes similares de células positivas para cada tetrámero. Mediante este protocolo, otros virus-específica (por ejemplo,., GP de LCMV, VPH 16 E7) o transgén específico (por ejemplo., GFP) células de T pueden ser poblaciones analizadas (suplementario Figura 1). En el suplementario tabla 1, se muestran los resultados de cinco animales después de la inmunización con VSV-GP-OVA — indicando la robustez de la tinción de tetrámero.
Figura 1: Representante gating estrategia analizar CD8+ T las células en la sangre. Representación esquemática de la estrategia bloquea utilizada para análisis cytometric del flujo. Después de tetrámero de tinción y flujo cytometric medición, los datos fueron analizados. Los linfocitos se identificaron con dispersión hacia delante y hacia un lado (área) (escala no logarítmica). De aquellos, las células fueron identificadas por aplicación de forward scatter anchura vs área (escala no logarítmica). CD8+ T las células fueron identificadas por compuerta en CD3+/CD8+ las células (escala logarítmica). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representante gating estrategia para cuantificar CD8 específicas de OVA y N+ T las células en la sangre. Representación esquemática de la estrategia bloquea utilizada para la cuantificación de citometría de flujo de células tetrámero+ . CD3+/CD8+ células se utilizaron para el análisis de tetrámero. Panel superior y medio: el marcador CD8 fue trazado contra respectivo tetrámero (escala logarítmica). Panel inferior: dos tetrámeros se trazaron uno contra el otro (escala logarítmica). Izquierda: ratón de control (ingenuo); medio: ratón inmunizaron con Adenovirus secretoras de OVA 5 (Adeno-OVA); adecuado: ratón inmunizaron con ovoalbúmina (OVA)-expresar VSV-GP (VSV-GP-OVA). Se extrajo sangre de la vena de la cola en el día 7 después de la inmunización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 1 complementaria: Resultado representativo de CD3+/CD8+ células tetrámero+ después de la vacunación. Representación esquemática de la cuantificación de citometría de flujo de células tetrámero+ . CD3+/CD8+ células se utilizaron para el análisis de tetrámero y el marcador CD8 fue trazado contra respectivo tetrámero (escala logarítmica). Izquierda: ratones eran ingenuas, adecuado: ratones fueron inmunizados con VSV-GP (panel superior), mayor proteína verde fluorescente (eGFP)-expresar VSV-GP (panel central) o VSV-GP expresa la oncoproteína E7 de papilomavirus humano (PVH) (E7) (panel inferior). Sangre se recogió de vena de la cola en el día 7 después de la inmunización y manchado con tetrámeros (GP de LCMV, eGFP y E7 de VPH). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Una gran ventaja del protocolo descrito aquí es que las respuestas de células T desde el mismo ratón pueden seguirse en el tiempo como sólo pequeñas cantidades de sangre son necesarios para cada medición. La figura 3 muestra resultados ejemplares para las respuestas de células T en el tiempo. Además de las cantidades de antígeno específico CTLs, su fenotipo puede también ser analizada mediante este protocolo (figura 4).
Figura 3: Resultado representativo de CD8+ T cell kinetic en sangre después de la vacunación. Representación esquemática de la estrategia bloquea utilizada para la cuantificación de citometría de flujo de células tetrámero+ . CD3+/CD8+ células se utilizaron para el análisis de tetrámero y dos tetrámeros se trazaron uno contra el otro (escala logarítmica). Paneles superiores: ratón inmunizaron con Adenovirus secretoras de OVA 5 (Adeno-OVA); bajar paneles: ratón inmunizaron con ovoalbúmina (OVA)-expresar VSV-GP (VSV-GP-OVA). Se extrajo sangre de la vena de la cola en el día 3, 7, 10 y 14 después de la inmunización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultado representativo de CD8+ T celular activación y diferenciación en células ingenuas y efectoras después de la vacunación. Representación esquemática de la estrategia bloquea utilizada para la cuantificación de citometría de flujo de activado (CD43+), ingenua (CD44–/CD62L+) y efectoras (CD44+/CD62L–) CD3+/CD8+ () de las células escala logarítmica). Izquierda: ratón de control (ingenuo); medio: ratón inmunizaron con Adenovirus secretoras de OVA 5 (Adeno-OVA); adecuado: ratón inmunizaron con ovoalbúmina (OVA)-expresar VSV-GP (VSV-GP-OVA). Se extrajo sangre de la vena de la cola en el día 7 después de la inmunización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| # Del ratón | CD43%+ | Tetrámero de VSV-N %+ | Tetrámero de la OVA de %+ | |
| Mock | 1 | 1.7 | 0.45 | 0,41 |
| 2 | 0.77 | 0.69 | 0.15 | |
| 3 | 1.34 | 0.35 | 0.31 | |
| 4 | 1.68 | 0,83 | 0.26 | |
| 5 | 0.84 | 0.47 | 0.23 | |
| VSV-GP-OVA | 1 | 23 | 13.2 | 3.69 |
| 2 | 32.6 | 15.9 | 3.54 | |
| 3 | 22.1 | 11.7 | 2.43 | |
| 4 | 15.1 | 8.89 | 1.79 | |
| 5 | 29.1 | 14.7 | 5.64 |
1 mesa adicional: Porcentajes de activa y específica de antígeno CD3+/CD8+ de las células después de la vacunación. Ratones fueron ya sea ingenuo o inmunizados con ovoalbúmina (OVA)-expresar VSV-GP (VSV-GP-OVA) (n = 5). Sangre se recogió de vena de la cola en el día 7 después de la inmunización y manchado con tetrámeros (VSV-N y los óvulos). Activado (CD43+) y CD3 del antígeno específico (tetrámero+)+/CD8+ se cuantificaron las células mediante citometría de flujo.
Discussion
La tinción de tetrámero es un protocolo bastante simple y sencillo para analizar el fenotipo y el péptido de especificidad de un linfocito T. El uso de sangre para análisis, como se describe aquí, es mínimamente invasivo y permite el control continuo, por ejemplo en estudios de vacunación. En el campo de la vacunación, la cuantificación de las respuestas de vector y antígeno específico es de interés, como respuestas específicas de vectores puedan interferir con una respuesta inmune efectiva contra el antígeno de vacuna28. Es de destacar que con el protocolo descrito aquí, ambas poblaciones pueden cuantificarse simultáneamente en una tinción de tetrámero simple, reduciendo la variabilidad de coloración y las cantidades de muestra. Sin embargo, a pocos pasos deben hacerse cuidadosamente para asegurar la adecuada medición y datos fiables. Si con sangre de la vena de la cola para el análisis, uno debe asegurarse precalentar los animales para inducir vasodilatación24. Por lo tanto, suficiente sangre se puede recoger en poco tiempo, se reduce el estrés en los animales y el análisis es mucho mejor, en comparación a si se recoge la sangre lentamente. También, después de la recolección de la muestra (ya sea de sangre o de órganos), la coloración directa se recomienda para evitar resultados falsos negativos debido al downregulation del TCR. Lo mismo se aplica para todos los pasos posteriores: el procedimiento no debe ser interrumpido y todos los pasos de lavado reducción el número mínimo (como se ha dicho en el protocolo). Para asegurar la coloración correcta, debe tener cuidado al vórtice todas las soluciones y muestras antes y después de la incubación. Esto es especialmente importante antes de fijar las muestras para evitar la aglutinación de las células.
En términos de modificar el protocolo, otros marcadores de superficie y tetrámeros pueden utilizarse, dependiendo de la finalidad del análisis. Sin embargo, todos los reactivos deben titularse, óptimo en combinación con todo el panel de la coloración. Para algunos de los tetrámeros especificados aquí, optimización reveló que podemos aumentar la dilución recomendada por el fabricante (1:10 recomendado, optimizado 1:25) (tabla 1). Para compensar el solapamiento espectral, cuentas de compensación se pueden utilizar en lugar de células. Sobre la elección del fluorocromo tetrámero junto, uno debe prever para usar fluorocromos brillantes, como esto facilita la detección - especialmente cuando la señal es baja. Como Dolton y colaboradores29, preferimos utilizar tetrámeros junto PE o APC, que se pueden combinar perfectamente en una coloración única y CD8+ T las células con una especificidad de antígeno único pueden ser bien detectada (figura 2). En cuanto a tiempos de incubación y temperatura, existe una gran variedad de condiciones de tinción tetrámero. En nuestro proceso de optimización, abordó este tema y realiza tetrámero tinción en diferentes condiciones (por ejemplo 4 º C, temperatura ambiente o 37 ° C). De los resultados obtenidos, recomendamos a la mancha por 20 min a 37 ° C, que está en concordancia con la literatura30,31. Incubación prolongada debe evitarse, como esto puede llevar a la internalización de los resultados negativos de la30 y falso del tetrámero.
La elección del anticuerpo adecuado para la detección de CD8+ células es otra cuestión importante, que tiene cuidadosamente considerado (y potencialmente adaptado). Esto surge del hecho de que ciertos anticuerpos anti-CD8 clona bloque Unión de tetrámeros a TCR, en humano32 así como ratón33 muestras. Seleccionamos para nuestro protocolo de tinción de tetrámero, clon 53 – 6.7 a mancha para CD8 murino+ las células, un clon que no bloquea, pero algo mejora la tinción de tetrámero.
La tinción de tetrámero es algo sencilla al analizar inmunorespuestas prominente en el pico de la respuesta de la célula de T, por ejemplo. Sin embargo, puede haber poblaciones que son un poco más 'problemáticas'. Tales ejemplos incluyen células específicas para antígenos de baja afinidad (tumor, uno mismo), recientemente activados las células que posteriormente regula sus receptores o subconjuntos raros de la célula (por ejemplo. ingenuo precursor o memoria celular poblaciones). En estos casos, el tetrámero clásico protocolo de tinción puede ser que necesite ser mejorado o combinado con otros métodos. Por ejemplo, el proteína quinasa inhibidor (PKI) dasatinib inhibe la internalización de TCR y podría incluirse antes de la tinción de tetrámero. Tetrámeros también pueden ser estabilizados por incluyendo el fluorocromo no conjugada Abs primaria después de la tinción de tetrámero. Además, la intensidad de fluorescencia puede incrementarse por la adición de un segundo anti-Ab conjugado con fluorocromo Ab29,34,35,36. Optimizado las condiciones selectivamente de los tetrámeros especificados en el presente Protocolo y no incluye PKI o Abs adicional. Sin embargo, para cualquier otro tetrámero, las condiciones óptimas deben ajustarse individualmente. Con respecto a las poblaciones de raras, la tinción de tetrámero que deba combinarse con enriquecimiento magnética11.
Para facilitar y validar el análisis FACS de la tinción de tetrámero, deben incluirse los controles positivos y negativos. Como control negativo, siempre se tiñen las células de un ratón de ingenua de la misma cepa con nuestro tetrámero de interés. Alternativamente, las muestras pueden teñirse con tetrámeros con péptidos irrelevantes, pero con el mismo fluorocromo como el tetrámero de interés. Dichos controles son esenciales para excluir falsas señales positivas, por ejemplo., origina de las células muertas. Además de esto, se recomienda incluir una mancha vivo o muertos, como el yoduro de propidio (PI). Esto es de especial importancia si las células no se tiñen directamente después del aislamiento. Otra estrategia para eliminar fondo de Autofluorescencia puede incluir varios marcadores de células no T en un canal. Excluyendo las células positivas en este canal, se pueden excluir las poblaciones T de la célula. Como control positivo, una muestra de un ratón de OT-1 puede utilizarse para el tetrámero de óvulos, por ejemplo. Para otros tetrámeros, esto tiene que ser elegido individualmente (por ejemplo., muestra de un ratón, que fue vacunado varias veces). Tanto otros37, también observamos una abajo-regulación del receptor CD8 durante la activación de CTL en el dia 7 del efector respuesta T celular. Por lo tanto, para evitar la pérdida de células efectoras T de tetrámero activado+ , recomendamos incluir las célulasbajo CD8 en el análisis (al menos si se mide en la fase efectora).
La calidad y cantidad de información que uno puede recuperar de este protocolo depende de los conocimientos acerca de los antígenos a estudiar, la disponibilidad y especificidad de tetrámero y la calidad de la máquina de FACS (número de láseres y detectores disponibles). Si se trabaja con muestras de animales, variación en la respuesta inmune es natural e inevitable. Por lo tanto, para obtener resultados significativos de la tinción de tetrámero, deben analizarse por lo menos 3 a 5 animales. Si lo ha hecho, el protocolo que se describe aquí dará resultados confiables y reproducibles (ejemplar resultado de un experimento puede encontrarse en la Tabla adicional 1). Como se mencionó anteriormente, este método se adapta perfectamente a cuantificar el fenotipo y la especificidad del antígeno de CD8+ T las células (figura 3, 4; Figura 1complementaria), no sólo en el ratón sino también en los seres humanos. Sin embargo, para analizar CD8+ células T efectoras las funciones, tales como la muerte celular inducida por la granzima, ICS o ápex deba realizarse. Sin embargo, se debe tener en cuenta que las funciones de la célula de T, medida por estimulación in vitro podrían no representar la situación real en vivo. In vivo, un ambiente represivo podría impedir las funciones de la célula de T que se miden en vitro.
En su el propios, tetrámero tinción no proporciona toda la información, sino evolucionó para convertirse en un método esencial para caracterizar las respuestas de células T y cuantificar subconjuntos de células T in vitro en una manera muy sensible38. Tetrámeros no pueden utilizarse para cuantificar determinados subconjuntos, sino también para aislar a los39, localizar por hibridación in situ19,20 y estudio de antígenos de baja afinidad, tales como tumor-associated40, 41. desde el descubrimiento del tetrámero tecnología4, la tinción de tetrámero se ha convertido en una herramienta esencial en el análisis de células T y la gama de aplicaciones.
Disclosures
Dorothee von Laer es un inventor de VSV-GP y minoría comparte en la empresa de biotecnología ViraTherapeutics GmbH, que posee los derechos de propiedad intelectual para VSV-GP. Para otros autores, no hay intereses financieros competidores existen.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por el fondo de la ciencia austríaca FWF (proyecto número P 25499-B13) y de la Unión Europea horizonte 2020 programa de investigación e innovación en conceden acuerdo no. 681032. El siguiente reactivo se obtuvo a través de la instalación de base de tetrámero de NIH: clase I MHC Tetramer de la nucleoproteína del virus de la estomatitis vesicular (RGYVYQGL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
| Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
| Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
| Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
| Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
| Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
| Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
| Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
| Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
| Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
| Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
| Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
| Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
| Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
| 12.5 mL Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
| Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
| Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
| FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
| PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
| Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
| Sodium azide | Roth | K305.1 | |
| PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
| Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
| FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
| PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
| APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
| OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
| VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
| EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
| LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
| HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |
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