Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ex Vivo qualitativen Nachweis von Antigen-spezifischen CD8+ T Zellen. Analyse ist möglich mit einzelnen Zellsuspensionen von Organen oder geringe Mengen von Blut. Ein breites Spektrum an Studiengängen erfordert die Analyse der zytotoxischen T-Zell-Antworten (Impfung und Krebs-Immuntherapie-Studien).
Abstract
Nach Virusinfektion, Antigen-spezifische CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTLs) entstehen und tragen zur Beseitigung der infizierten Zellen, die Verbreitung von Krankheitserregern zu verhindern. Daher ist die Häufigkeit der Antigen-spezifischen CTLs bezeichnend für die Stärke der T-Zell-Reaktion gegen ein spezifisches Antigen. Eine solche Analyse ist wichtig in grundlegenden Immunologie, Entwicklung von Impfstoffen, Krebs Immunbiologie und adaptive Immunologie. Im Feld Impfstoff bestimmt die CTL-Antwort gegen Komponenten des viralen Vektoren wie effektiv ist die Generation der Antigen-spezifische Zellen gegen das Antigen des Interesses (z.B., Transgen). Antigen-spezifischen CTLs können entweder durch Stimulation mit bestimmten Peptiden, gefolgt von intrazellulären Zytokin Färbung oder durch die direkte Färbung des Antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren (TCR) und Analyse von Durchflusszytometrie erkannt werden. Die erste Methode ist sehr zeitaufwendig, da es erfordert, Opfern von Tieren, Zellen von Organen zu isolieren. Es erfordert auch, Isolierung des Blutes von kleinen Tieren, die schwierig durchzuführen ist. Die letztere Methode ist recht schnell, kann bequem mit kleinen Mengen von Blut und ist nicht abhängig von bestimmten Effektor-Funktionen, wie z.B. zytolytischen Aktivität. MHC-Tetramers sind ein ideales Werkzeug um Antigen-spezifischen TCRs zu erkennen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll gleichzeitig Antigen-spezifischen CTLs für die immundominante Peptide des viralen Vektors VSV-GP (LCM-GP, VSV-NP) transgene (OVA, HPV 16 E7 eGFP) durch MHC zu erkennen, und ich Tetramer Färbung und Flow Cytometry. Färbung ist möglich direkt aus Blut oder aus einzelnen Zellsuspensionen Organe, wie Milz. Blut oder einzelne Zellsuspensionen von Organen sind mit Tetramers inkubiert. Nach der Färbung mit Antikörper gegen CD3 und CD8 sind Antigen-spezifischen CTLs durch Durchflusszytometrie quantifiziert. Optional können Antikörper gegen CD43, CD44, CD62L oder andere enthalten, um den Aktivierungsstatus der Antigen-spezifische CD8 bestimmen werden+T Zellen und zwischen naiv und Effektor Zellen unterscheiden.
Introduction
Das Ziel dieser Methode ist, zu beurteilen, die Häufigkeit der zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Antworten, (mehrfach-) Antigene in der Maus durchflusszytometrischen Analyse ohne zeitraubende Peptid-Stimulation. Diese Methode analysiert die Phänotyp und Antigen Spezifität der CTL Teilmengen, in eine einheitliche Färbung. Wir optimieren die Major Histocompatibility Complex ich (MHC ich) Tetramer Färbeprotokoll zur Wirksamkeit des neuen Impfstoffs Ansätze wie VSV-GP, eine neue Variante des vesikuläre Stomatitis Virus (VSV), zu analysieren, wo das Glykoprotein G des VSV durch ersetzt wurde die Glykoprotein GP der Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus (LCM)1,2. Neben der humoralen Antwort ist eine wichtige Auslesen von der Wirksamkeit eines Impfstoffs die Induktion einer CTL-Antwort gegen eine oder mehrere Antigene. Da die Konsistenz und Haltbarkeit der zellulären Antwort in diesem Zusammenhang wichtig sind, ist es günstig, Kinetik der CTL-Antworten vom gleichen Tier zu überwachen. Dies führt auch zu einer Reduzierung der Tierzahlen, ein wichtiger Aspekt zu den Grundsätzen der "3R"3. Daher ist die Analyse von weniger als 20 µL Blut für diesen Zweck optimal.
Tetramers entstanden in den späten 90er Jahren4 und wurde ein wichtiges Instrument im Bereich der T-Zell-Immunologie. Tetramers sind Eindringmittel beschriftet komplexe von vier MHC ich / Peptid Moleküle, die an TCR, für ein einzelnes Peptid spezifisch binden. Heutzutage können sie entweder fertige5, individuell bestellten gekauft werden kostenlos an die NIH Tetramer Core Facility Emory University6 oder in der Lab-7produziert. MHC I und II Tetramers sind vorhanden, , d. h. für CD8+ und CD4 bzw.+ T-Zellen. Die Potenz der Tetramer Färbung liegt in Zeitersparnis, eher einfach und leicht zu8 Protokolle und Empfindlichkeit9zu standardisieren. Auch wenn mit Blut arbeiten, Tiere brauchen nicht geopfert werden und minimalen Probenmengen sind erforderlich. Eine Messung beschränkt sich nicht auf ein einziges Antigen, aber mehrere Antigene in einer Färbung bei der Kombination von Tetramers mit verschiedenen Fluorophore konjugiert analysiert werden können. Neu entdeckte Antigene, z.B. von Peptid-Bildschirme, können leicht Tetramers gegründet und zur Quantifizierung der T-Zell-Teilmenge verwendet werden.
Tetramer Färbung geben Auskunft über CTL-Funktionalität (dh., Produktion von Zytokinen, Effektor-Funktionen), nicht aber nur Spezifität. Informationen über T-Zell-Funktionalität, intrazelluläre Zytokin Färbung (ICS) oder Enzyme Linked Immuno Spot (ELISpot) Assay muss gewinnen durchgeführt,8,10. Tetramer Färbung und ICS/ELISpot, aber sind nicht überflüssig, aber einander ergänzen. In-vitro-Stimulation zur Produktion von Zytokinen für ICS/ELISpot induzieren ändert den ursprünglichen T-Zell-Phänotyp. Tetramer Färbung, lässt die T-Zelle dagegen unberührt; das ursprüngliche Erscheinungsbild erhalten bleibt und analysiert werden kann. Außerdem ist ein weiterer großer Vorteil des Tetramers Färbung mit magnetischen Sortier- und Anreicherung von Antigen-spezifischen Zellen11kombiniert werden kann. Dies ermöglicht die Analyse der seltenen Populationen sowie die Kultivierung der sortierten Zellen mit definierten Antigen-Besonderheiten – ein Feature, das nicht mit anderen Methoden möglich sein.
Mit der hier beschriebenen Protokoll, Tetramer Färbung, sowie ICS/ELISpot kann von einem Organ durchgeführt werden, da nur sehr wenig Material (Blut: 20 µL; Milz: 1 x 106 Zellen) ist erforderlich für das Tetramer zu beflecken. Jedoch abhängig von der Häufigkeit der Antigen-spezifische Zellen von Interesse, die Stärke der jeweiligen TCR und experimentellen Kontext, die Höhe der Zellen erforderlich müssen möglicherweise hochskaliert werden oder magnetische Anreicherung könnte angewendet werden müssen.
Tetramers sind weit verbreitet, zum Beispiel zur Bewertung der Effektivität von Impfstoffen (Antitumor-)12,13,14,15 oder Immuntherapie16,17, phänotypische Analyse und räumliche Lokalisierung von antigenspezifischen T Zelle Teilmengen18,19,20,21,22,23. Die hier beschriebene Methode eignet sich für Studien, die darauf abzielen, die Quantifizierung und phänotypische Analyse der murinen Antigen-spezifische CD8 sind+ T-Zellen in ihrer Analyse auf eine schnelle und bequeme Weise.
Protocol
Alle beschriebene Methoden wurden in Übereinstimmung mit dem österreichischen Tier Experimente Landesrecht ("Tierversuchsgesetz") und Tier Studie Erlaubnis wurde erteilt durch die österreichischen Behörden.
1. Puffer Vorbereitung und probieren Sie Sammlung
Hinweis: Die verwendete Maus-Stamm hängt das Epitop analysiert. Wählen Sie eine geeignete Tetramer, das an ein MHC-Typ ausgedrückt in den Mäusen, z. B., H - 2 Kb für C57BL/6 Mäusen bindet. Das Geschlecht und das Alter der Tiere hängt von der Fragestellung. Für die meisten der beschriebenen Experimente hier verwenden Sie weibliche Mäuse im Alter von 6 – 8 Wochen zu Beginn des Experiments, d.h., ersten Immunisierung.
- Bereiten Sie FACS-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 1 % fetalen Kälberserum (FCS) + 0,1 % Natriumazid + 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und FACS Befestigung Puffer (1,5 % (V/V) Formaldehyd in PBS).
Hinweis: Es wird empfohlen, beide Puffer im Voraus zubereitet werden. Bis zur Verwendung bei 4 ° C gelagert. - Blut: Sammle 20 µL Blut pro Maus von der Rute Ader der Maus in EDTA-beschichtete Rohre, wie zuvor beschrieben24.
Hinweis: Blut kann auch von anderen Routen, z. B., Vena Facialis oder Retro-Orbital Sinus gesammelt werden. Die Methode der Blutentnahme muss jedoch in Übereinstimmung mit dem nationalen Tierversuche Gesetz und Tier Demo-Applikationen sein. Ansammlung von Blut aus der Vene Rute ist ideal für Studien, wo immer wieder kleine Mengen Blut benötigt. Zusätzliches Material ist erforderlich für Entschädigung Steuerelemente und das Steuerelement nicht befleckt. - Milz: Die Orgel zu isolieren und mit Hilfe von den Kolben der Spritze durch eine 70 nm und 40 µm Zelle Sieb drücken. Führen Sie lyse der Erythrozyten, aus, wie in Schritt 6 und Graf beschrieben. Passen Sie die Konzentration auf 1 x 107 Zellen/mL in PBS. Pro Probe sind 1 x 106 Zellen erforderlich.
Hinweis: Immer gehören Sie einige mock immunisiert oder kontrollieren Sie Vektor immunisierten Tiere als Negativkontrolle zu. Für Ovalbumin (OVA)-Tetramer, eine Probe von OT-1 Mäusen könnte als Positivkontrolle verwendet werden. Vergessen Sie nicht ungefärbten und Entschädigung Kontrollen bei der Berechnung. Bei Bedarf können Proben von verschiedenen Tieren im Experiment für dies gebündelt. - Fahren Sie nach der Probenentnahme direkt mit dem beflecken.
2. Färbung Set-up
- Bereiten Sie eine FACS-Röhre für jede Probe. Röhren richtig beschriften und 100 μL der Orgel Suspension (1 x 10-6 -Zellen) oder 20 μL Blut in jedes Rohr übertragen.
- Milz: Zentrifugieren für 5 min bei 600 X g bei 4 – 8 ° C und den Überstand verwerfen. Wirbel um die Zelle Pellet aufzuwirbeln.
Hinweis: Dadurch wird ein Restvolumen von ca. 20 µL, ähnlich wie die Lautstärke für den Blutproben. - Bereiten Sie für jeden Kanal, auch verwendet werden eine FACS-Röhre für eine Kompensierungsbeispiel. Eine zusätzliche Probe als ungefärbten Kontrolle vorbereiten.
3. Tetramer Färbung
-
Verwenden Sie für jede Probe 50 μL der Tetramer Verdünnung. Empfohlene Tetramers und optimierte Verdünnungen finden Sie in Tabelle 1.
Hinweis: Beim Arbeiten mit Tetramers oder Antikörper, schalten Sie das Licht der Sicherheit Kabinett und schützen Sie Proben vor Licht.- Bereiten Sie einen Schlauch mit FACS-Puffer (Volumen = 50 μL × Anzahl der Proben plus zusätzliche 10 % des Gesamtvolumens zu pipettieren Fehler kompensieren).
- Fügen Sie Tetramer(s) bei optimalen Verdünnung, wie in Tabelle 1aufgeführt. Wirbel die Lösung.
Hinweis: Wenn das ganze Antikörper-Panel (CD3, CD8, CD43, CD44, CD62L) mit aufgeführten Fluorophore, können zwei Tetramers (in PE und APC) einbezogen werden. Beide Tetramers können kombiniert werden, in eine einheitliche Färbung, d. h., Färbung der Zellen mit beiden Tetramers kann gleichzeitig ausgeführt werden.
| Tetramer | Peptidsequenz | Allel | Fluorophor | Verdünnung |
| MHC ICH / OVA | SIINFEKL | H - 2Kb | APC | 01:25 |
| MHC ICH/VSV-NP | RGYVYQGL | H - 2Kb | PE | 01:25 |
| MHC ICH / EGFP | HYLSTQSAL | H-2Kd | PE | 01:25 |
| MHC ICH/LCM-GP | KAVYNFATC | H-2Db | APC | 01:25 |
| MHC ICH / HPV 16 E7 | RAHYNIVTF | H-2Db | APC | 01:10 |
Tabelle 1: schlug Tetramers und optimale Verdünnungen. Empfohlene Tetramers für einige immundominante Peptide Modell Antigene (Ovalbumin (OVA) und verbesserte grün fluoreszierendes Protein (eGFP)) oder Erreger Komponenten (vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) Nucleoprotein (NP), Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus (LCM () Glykoprotein (GP) und humanes Papillomavirus (HPV) E7 Oncoprotein (E7)). Für jeden, der Peptidsequenz und entsprechende Allel sowie empfohlene Fluorophor und optimierte Verdünnung aufgeführt.
- Hinzu kommen 50 μL der Tetramer Verdünnung jede Probe und Wirbel sanft. FACS-Puffer (ohne Tetramer) auf Entschädigung Steuerelemente und der ungefärbten Probe hinzufügen.
- Inkubieren Sie Proben für 20 min bei 37 ° C, vor Licht geschützt werden. Um einen nahtlosen Übergang von Tetramer an Antikörper Färbung zu gewährleisten, bereiten Sie die Antikörper-Mischung wie in Schritt 4 beschrieben, während der Inkubationszeit.
Hinweis: Für jeden einzelnen Tetramer müssen optimale Bedingungen (Verdünnung, Inkubationszeit und Temperatur) eingestellt werden.
4. Herstellung von Antikörpern
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Bereiten Sie für jede Probe 50 µL Antikörper-Mix.
- Bereiten Sie einen Schlauch mit FACS-Puffer (Volumen = 50 μL × Anzahl der Proben plus zusätzliche 10 % des Gesamtvolumens, Pipettieren Fehler zu kompensieren).
- Fügen Sie Antikörper in den Verdünnungen hinzu, wie in Tabelle 2aufgeführt.
Hinweis: Je nach Fragestellung vielleicht andere Markerkombinationen neben der hier beschriebenen verwendet werden. Achten Sie darauf, immer Antikörper gegen CD3 und CD8 in der Systemsteuerung enthalten. - Wirbel die Lösung.
| Antikörper | Fluorophor | Verdünnung | µg/Probe | Marker |
| CD3 | PE-Cy7 | 1: 200 | 0.05 | CTLs (CD3+CD8+) |
| CD8 | Pacific Blue | 1:750 | 0,013 | |
| V450 | 1: 100 | 0.1 | ||
| CD43 | FITC | 1: 100 | 0,25 | Aktivierung (CD43+) |
| CD44 | PE-Cy5 | 1: 250 | 0,04 | Naive (CD44–CD62L+) & Effektor (CD44+CD62L–) |
| CD62L | APC-Cy7 | 1: 500 | 0.02 |
Tabelle 2: Antikörper, die in diesem Protokoll und optimale Verdünnungen verwendet. Empfohlene Oberflächenmarker (CD3, CD8, CD43, CD44 und CD62L) sind in der ersten Spalte aufgeführt. Für jeden der empfohlenen Fluorophor, optimierte Verdünnung und Antikörper/Probenmenge aufgeführt. In der letzten Spalte ist die Zelle mit einzelnen Marker identifiziert angegeben.
-
Bereiten Sie Antikörper für Entschädigung Steuerelemente. Verwenden Sie für jedes Steuerelement Entschädigung einen Antikörper gegen CD8 in der jeweiligen Farbe.
- Für jeden Kanal zubereiten einer Röhre mit 200 μL der FACS-Puffer und 1 μl einer 1: 200 verdünnen Antikörper gegen CD8 in der jeweiligen Farbe.
- Wirbel der Rohre.
- Fahren Sie sofort mit Färbung.
5. Färbung der Proben
- Waschen Sie Proben einmal, durch Zugabe von ~ 1 mL FACS-Puffer und Zentrifuge für 5 min bei 600 X g bei 4 – 8 ° C. Nach Zentrifugieren überstand verwerfen und restliche Flüssigkeit auf einen Stapel von Küchenpapier abtropfen.
Hinweis: Beim Arbeiten mit Blut, seien Sie vorsichtig beim verbleibenden Flüssigkeit ablassen. Vor der Lyse der Erythrozyten haften Blut auf den Boden der FACS-Röhre nicht. Alternativ aspirieren Sie überstand. - Hinzu kommen 50 μL des Antikörper-Mix jede Zelle Pellet und Wirbel sanft.
- Die Zelle Pellet der entsprechenden Entschädigung Kontroll- und Wirbel sanft 50 μL jeder Entschädigung Mischung hinzufügen.
- Die Zelle Pellet des ungefärbten Kontroll- und Wirbel sanft 50 μL der FACS Puffer hinzufügen.
- Inkubieren Sie alle Proben für 30 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden.
- Beim Arbeiten mit Organen: Schritt 6 überspringen. Waschen einmal durch Zugabe von ~ 1 – 2 mL FACS-Puffer und Zentrifuge für 5 min bei 600 X g bei 4 – 8 ° C. Nach Zentrifugieren überstand verwerfen und restliche Flüssigkeit auf einen Stapel von Küchenpapier abtropfen.
- Beim Arbeiten mit Blut: fahren Sie mit Schritt 6 (Lyse der Erythrozyten).
6. die lyse von Erythrozyten
- Jede Probe und sanft Wirbel 500 μL der ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Puffer25 hinzufügen.
Hinweis: ACK-Puffer wird zu osmotischen Schwellung und lyse, speziell der Erythrozyten führen. - 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Fügen Sie 1 mL der FACS-Puffer und Zentrifuge für 5 min bei 600 X g bei 4 – 8 ° C. Nach Zentrifugieren überstand verwerfen und die restliche Flüssigkeit auf einen Stapel von Küchenpapier abtropfen.
Hinweis: Wenn das Pellet eher rot ist, wiederholen Sie die lyse der Erythrozyten. - Waschen einmal durch Zugabe von ~ 1 – 2 mL FACS-Puffer und Zentrifuge für 5 min bei 600 X g bei 4 – 8 ° C. Nach Zentrifugieren überstand verwerfen und restliche Flüssigkeit auf einen Stapel von Küchenpapier abtropfen.
(7) fließen Sie durchflusszytometrischen Messung und Analyse
- Jedes Rohr 150 – 300 μL des FACS Befestigung Puffers hinzu und mischen Sie durch aufschütteln. Für 20 µL Blut reicht 150 µL Puffer.
Hinweis: Stellen Sie vor Fixierung sicher, dass Zellen auch wieder angehalten um Bildung von Klumpen zu vermeiden. Fahren Sie so schnell wie möglich mit durchflusszytometrischen Durchflussmessung. - Messen Sie die Entschädigung Steuerelemente und korrigieren Sie spektrale Überlappungen zu.
-
Einrichten von sequentiellen Gates, wie dargestellt in Abbildung 1 für CD3 auswählen+/CD8+ Zellen.
- Tor auf Lymphozyten mit vorwärts- und seitliche Streuung (Area) (nicht-logarithmischen Skala).
- Innerhalb der Lymphozytenpopulation Tor auf Einzelzellen mit forward Scatter breite Vs Bereich (nicht-logarithmischen Skala).
- Plot-Einzelzelle Lymphozyten CD3 und CD8 Kanäle (logarithmische Skala). CD8 identifizieren+ T-Zellen durch Anspritzung auf CD3+/CD8+ Zellen.
- Plot-CD8+ Vs Tetramer+ Zellen und Tor auf CD8+ + Tetramer Zellen, wie in Abbildung 2dargestellt.
- Wenn möglich, notieren Sie 20.000 Zellen (mindestens 5.000 aus Blut) in der CD3+/CD8+ Tor für jede Probe und als ein FCS-Datei speichern.
Hinweis: Die Höhe der Zellen aufnehmen könnte nach der Häufigkeit der Antigen-spezifische Zellen des Interesses angepasst werden müssen. - FCS-Dateien mit entsprechenden Analyse-Software analysieren. Die gating-Strategie zu verwenden, wie oben (Abschnitt 7.3) beschrieben und quantifiziert CD8+ + Tetramer Zellen.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt, wie Sie richtig auf den Zielzellen dieses Protokolls, nämlich CD3 Tor+/CD8+ Zellen. Es ist zu beachten, dass aktiviert Zellen oft Downregulate die T-Zell-Rezeptor26,27 und CD3niedrigen Zellen sollte daher auch in die Anspritzung aufgenommen werden. Nach der CD3 gating+/CD8+ Zellen, Tetramer positive Zellen können werden ermittelt (Abbildung 2). Vertreter blots für eine Negativkontrolle (naive) Maus, sowie Tiere, die entweder mit beiden OVA-sezernierenden Adenovirus 5 (Adeno-OVA) geimpft oder OVA exprimierenden VSV-GP (VSV-GP-OVA) werden angezeigt. Wie in der unteren Flecken zwei verschiedene kombinierbar Tetramers im gleichen Rohr für das Beflecken. Dies ermöglicht die gleichzeitige Quantifizierung von zwei verschiedenen CTL Besonderheiten: Virus-spezifischen (VSV N) und Transgen-spezifische (OVA) CTLs. Wir bestätigen, dass Einzel- und Doppelzimmer Tetramer Färbungen ähnliche Prozentsätze der positiven Zellen für jedes Tetramer geben. Mithilfe dieses Protokolls andere Virus-spezifische (z.B.., LCMV GP, HPV 16 E7) oder Transgen-spezifischen (z. B.., GFP) T-Zell-Populationen können analysiert (ergänzende Abbildung1). Im ergänzenden Tabelle1Ergebnisse für fünf Tiere nach der Immunisierung mit VSV-GP-OVA erscheinen — Angabe Robustheit der Tetramer Färbung.
Abbildung 1: Vertreter Anspritzung Strategie CD8 analysieren+ T Zellen im Blut. Schematische Darstellung der gating-Strategie für durchflusszytometrischen Analyse verwendet. Nach Tetramer Färbung und Flow durchflusszytometrischen Messung wurde Daten analysiert. Lymphozyten wurden mit vorwärts- und seitliche Streuung (Area) (nicht-logarithmischen Skala) identifiziert. Von denen wurden einzelne Zellen mittels forward Scatter breite Vs Bereich (nicht-logarithmischen Skala). CD8+ T Zellen wurden durch Anspritzung auf CD3 identifiziert+/CD8+ Zellen (logarithmische Skala). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Vertreter Anspritzung Strategie zu quantifizieren, OVA und N-spezifische CD8+ T Zellen im Blut. Schematische Darstellung der gating-Strategie für Durchfluss durchflusszytometrischen Quantifizierung der Tetramer+ Zellen verwendet. CD3+/CD8+ Zellen wurden für Tetramer Analyse verwendet. Oberen und mittleren Panel: die CD8-Markierung wurde gegen die jeweiligen Tetramer (logarithmische Skala) aufgetragen. Untere Leiste: beide Tetramers (logarithmische Skala) gegeneinander aufgetragen wurden. Links: Kontrolle (naive) Maus; Mitte: Maus war geimpft mit OVA-sezernierenden Adenovirus 5 (Adeno-OVA); richtig: Maus war mit Ovalbumin (OVA) immunisiert-VSV-GP (VSV-GP-OVA) zum Ausdruck zu bringen. Blut wurde aus Rute Vene am 7. Tag nach der Immunisierung gesammelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Zusätzliche Abbildung 1: Repräsentatives Ergebnis der CD3+/CD8+ + Tetramer Zellen nach der Impfung. Schematische Darstellung der Strömung durchflusszytometrischen Quantifizierung der Tetramer+ Zellen. CD3+/CD8+ Zellen für Tetramer Analyse verwendet wurden und die CD8-Markierung wurde gegen die jeweiligen Tetramer (logarithmische Skala) aufgetragen. Links: Mäusen waren naiv, richtig: Mäuse mit VSV-GP (obere Abdeckung) geimpft wurden, erweiterte Green Fluorescent Protein (eGFP)-VSV-GP (Mitte Platte) oder VSV-GP mit dem humanen Papillomavirus (HPV) E7 Oncoprotein (E7) Ausdruck zum Ausdruck bringen (untere Leiste). Blut wurde aus Rute Vene am 7. Tag nach der Immunisierung und befleckt mit Tetramers (LCM-GP, eGFP und HPV E7). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ein großer Vorteil des hier beschriebenen Protokolls ist, dass T-Zell-Antworten von der gleichen Maus im Laufe der Zeit verfolgt werden können, da nur geringe Mengen von Blut bei jeder Messung benötigt werden. Abbildung 3 zeigt beispielhaft Ergebnisse für T-Zell-Antworten im Laufe der Zeit. Neben der Mengen von Antigen-spezifischen CTLs kann deren Phänotyp auch unter Verwendung dieses Protokolls (Abbildung 4) analysiert werden.
Abbildung 3: Repräsentatives Ergebnis der CD8+ T-Zellen im Blut nach der Impfung kinetische. Schematische Darstellung der gating-Strategie für Durchfluss durchflusszytometrischen Quantifizierung der Tetramer+ Zellen verwendet. CD3+/CD8+ Zellen für Tetramer Analyse verwendet wurden und beide Tetramers (logarithmische Skala) gegeneinander aufgetragen wurden. Oberen Platten: Maus wurde geimpft mit OVA-sezernierenden Adenovirus 5 (Adeno-OVA); Platten zu senken: Maus mit Ovalbumin (OVA) geimpft wurde-mit dem Ausdruck VSV-GP (VSV-GP-OVA). Blut wurde aus Rute Vene am Tag 3, 7, 10 und 14 nach der Immunisierung gesammelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Repräsentatives Ergebnis der CD8+ T Zelle Aktivierung und Differenzierung in naive und Effektor Zellen nach der Impfung. Schematische Darstellung der gating-Strategie zur Strömung durchflusszytometrischen Quantifizierung der aktiviert (CD43+), naiv (CD44–/CD62L+) und Effektor (CD44+/CD62L–) CD3+/CD8+ Zellen () logarithmische Skala). Links: Kontrolle (naive) Maus; Mitte: Maus war geimpft mit OVA-sezernierenden Adenovirus 5 (Adeno-OVA); richtig: Maus war mit Ovalbumin (OVA) immunisiert-VSV-GP (VSV-GP-OVA) zum Ausdruck zu bringen. Blut wurde aus Rute Vene am 7. Tag nach der Immunisierung gesammelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| # Maus | % CD43+ | % VSV-N Tetramer+ | % OVA Tetramer+ | |
| Mock | 1 | 1.7 | 0,45 | 0,41 |
| 2 | 0,77 | 0.69 | 0,15 | |
| 3 | 1.34 | 0,35 | 0,31 | |
| 4 | 1,68 | 0,83 | 0.26 | |
| 5 | 0,84 | 0,47 | 0,23 | |
| VSV-GP-OVA | 1 | 23 | 13.2 | 3.69 |
| 2 | 32,6 | 15.9 | 3,54 | |
| 3 | 22.1 | 11.7 | 2,43 | |
| 4 | 15.1 | 8,89 | 1.79 | |
| 5 | 29.1 | 14.7 | 5.64 |
Zusätzliche Tabelle 1: Prozentsätze der aktivierten und Antigen-spezifischen CD3+/CD8+ Zellen nach der Impfung. Mäuse wurden entweder naiv oder geimpft mit Ovalbumin (OVA)-mit dem Ausdruck VSV-GP (VSV-GP-OVA) (n = 5). Blut wurde aus Rute Vene am 7. Tag nach der Immunisierung und befleckt mit Tetramers (VSV-N und OVA). Aktiviert (CD43+) und Antigen-spezifische (Tetramer+) CD3+/CD8+ Zellen wurden durch Durchflusszytometrie quantifiziert.
Discussion
Tetramer Färbung ist eine eher einfache und unkomplizierte Protokoll, Phänotyp und Peptid Besonderheit der T-Lymphozyten zu analysieren. Die Verwendung von Blut für die Analyse, wie hier beschrieben ist minimal invasiv und ermöglicht die kontinuierliche Überwachung, zum Beispiel in Studien der Impfung. Auf dem Gebiet der Impfung ist die Quantifizierung der Vektor und Antigen-spezifische Antworten von Interesse, als Vektor-spezifische Reaktionen eine effektive Immunantwort gegen den Impfstoff Antigen28behindern könnten. Bemerkenswert ist, dass mit dem hier beschriebenen Protokoll beider Völker gleichzeitig in einem einzigen Tetramer Färbung, quantifiziert werden können wodurch Färbung Variabilität und Probe Beträge. Ein paar Schritte müssen jedoch sorgfältig durchgeführt werden, um korrekte Messung und zuverlässige Daten zu gewährleisten. Wenn Blut aus der Vene Rute für die Analyse verwenden, sollte man die Tiere um Vasodilatation24induzieren Vorwärmen sicherstellen. Dabei ausreichend Blut in kurzer Zeit eingesammelt werden kann, reduziert Stress auf die Tiere und die Analyse ist viel besser, im Vergleich zu wenn das Blut langsam gesammelt werden. Auch nach der Probenentnahme (Blut oder Organe), direkte Färbung empfiehlt sich falsch negative Ergebnisse wegen TCR Downregulation zu vermeiden. Dies gilt auch für alle weiteren Schritte: das Verfahren sollte nicht unterbrochen werden und alle Waschschritte reduziert auf die Mindestzahl (wie erwähnt im Protokoll). Um die richtige Färbung zu gewährleisten, sollte darauf alle Lösungen und Proben vor und nach der Inkubation Vortex geachtet werden. Dies ist besonders wichtig vor der Befestigung der Proben zur Verklumpung der Zellen zu vermeiden.
In Bezug auf das Protokoll zu ändern, können andere Oberflächenmarker und Tetramers werden, je nach dem Ziel der Analyse verwendet. Alle Reagenzien müssen jedoch dann optimal in Kombination mit der ganzen Färbung Panel titriert werden. Für einige von den hier angegebenen Tetramers, Optimierung ergab, dass wir die vom Hersteller empfohlene Verdünnung erhöhen können (01:10 empfohlen, optimiert, 01:25) (Tabelle 1). Um spektrale Überlappung zu kompensieren, können die Entschädigung Perlen statt gefärbten Zellen verwendet werden. In Bezug auf die Wahl der Tetramer-gekoppelten Fluorochrom sollte man vorsehen um helle Fluorochromes verwenden da diese Erkennung - erleichtert, vor allem, wenn das Signal zu schwach ist. Als Dolton und Kollegen29, wir bevorzugen PE - oder APC-gekoppelten Tetramers, die perfekt in eine einheitliche Färbung und CD8 kombinierbar sind+ T Zellen mit einer einzigen Antigen-Spezifität können schön werden erkannt (Abbildung 2). Hinsichtlich Temperatur und Inkubation Zeiten gibt es eine Vielzahl von Tetramer Färbung Bedingungen. In unserem Optimierungsprozess wir dieses Thema angesprochen und Tetramer Färbung bei unterschiedlichen Bedingungen (z.B. 4 ° C, Raumtemperatur oder 37 ° C) durchgeführt. Aus den Ergebnissen wird empfohlen, um für 20 min bei 37 ° C zu beflecken, die in Übereinstimmung mit der Literatur30,31. Längere Inkubation sollte vermieden werden, da dies zu Internalisierung von Tetramer30 und falsch negativen Ergebnissen führen kann.
Die Wahl der richtigen Antikörper für die Erkennung von CD8+ Zellen ist ein weiteres wichtiges Thema, die durchdachte (und potenziell angepasst) hat. Dies ergibt sich aus der Tatsache, dass bestimmte Antikörper Anti-CD8-Block Bindung des Tetramers, TCR in menschlichen32 sowie Maus33 Proben Klone. Für unsere Tetramer Färbeprotokoll, ausgewählt wir Klon 53 – 6,7 für murine CD8 Fleck+ Zellen – ein Klon die nicht blockiert, sondern vielmehr verstärkt Tetramer Färbung.
Tetramer Färbung ist eher unkompliziert, wenn prominente Immunantworten auf dem Höhepunkt der T-Zell-Antwort, zum Beispiel zu analysieren. Jedoch möglicherweise Bevölkerungen, die ein bisschen mehr "problematisch" sind. Solche Beispiele sind Zellen spezifisch für geringe Affinität Antigene (Tumor, selbst), zuletzt aktivierten Zellen nachträglich nach unten reguliert ihre Rezeptoren oder seltenen Zelle Teilmengen (z.B.. -naive Vorstufe oder Speicher Zellpopulationen). In diesen Fällen müssen die klassischen Tetramer Färbeprotokoll verbessert oder mit anderen Methoden kombiniert werden. Zum Beispiel Protein Kinase-Inhibitor (PKI) Dasatinib hemmt TCR Internalisierung und vor Tetramer Färbung enthalten sein könnte. Tetramers können auch durch Anti-Fluorochrom unconjugated primäre Abs nach Tetramer Färbung einschließlich stabilisiert werden. Darüber hinaus kann die Fluoreszenzintensität durch Zugabe von einem zweiten Anti-Ab Fluorochrom konjugiert Ab29,34,35,36erhöht werden. Wir die Bedingungen selektiv für die Tetramers angegeben in diesem Protokoll optimiert und PKI oder zusätzliche Abs nicht enthalten. Die optimalen Bedingungen müssen jedoch für jeden anderen Tetramer individuell angepasst werden. Im Hinblick auf seltene Populationen Tetramer Färbung möglicherweise mit magnetischen Anreicherung11kombiniert werden.
Zur Erleichterung und FACS Analyse der Tetramer Färbung zu validieren, sollten negativ-und Positivkontrollen einbezogen werden. Als Negativkontrolle färben wir immer Zellen einer naiven Maus des gleichen Stammes mit unseren Tetramer von Interesse. Alternativ können Proben mit Tetramers mit irrelevanten Peptide, aber mit der gleichen Fluorochrom als Tetramer von Interesse befleckt werden. Diese Kontrollen sind unerlässlich, um falsche positive Signale ausschließen z.B.., von sterbenden Zellen stammen. Darüber hinaus empfiehlt es sich, einen lebenden/Toten Fleck, wie Propidium Jodid (PI) enthalten. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn Zellen nicht direkt nach Isolierung gefärbt sind. Eine weitere Strategie zur Autofluoreszenz Hintergrund entfernen möglicherweise mehrere T-Zell-Marker in einem Kanal aufnehmen. Durch den Ausschluss Zellen positiv in diesem Kanal, können T-Zell-Populationen ausgeschlossen werden. Als Positivkontrolle kann eine Probe von einem OT-1 Maus für OVA Tetramer, zum Beispiel verwendet werden. Dies muss für andere Tetramers individuell gewählt werden (z. B.., Probe von einer Maus, die mehrmals geimpft wurde). Gleich anderen37, beobachten wir auch eine Down-Regulierung der CD8-Rezeptor bei CTL Aktivierung am 7. Tag der Effektor T-Zell-Antwort. Daher, um aktivierte Tetramer+ -Effektor T-Zellen zu vermeiden, empfehlen wir, dieniedrige CD8-Zellen in die Analyse einbeziehen (zumindest wenn die Effektor-Phase messen).
Die Qualität und die Menge an Informationen, die man aus diesem Protokoll abrufen kann ist das Wissen über das Antigen untersucht werden, die Verfügbarkeit und die Besonderheit des Tetramer und die Qualität der FACS-Maschine (Anzahl der Laser und Detektoren erhältlich) abhängig. Arbeiten mit Tieren Proben ist Variation der Immunantwort natürlich und unvermeidlich. Um aussagekräftige Ergebnisse von Tetramer Färbung zu erhalten, sollten daher mindestens 3 – 5 Tiere analysiert werden. Wenn getan, wird das hier beschriebene Protokoll zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse geben (beispielhafte ergeben sich aus einem Experiment finden Sie in der Zusätzlichen Tabelle 1). Wie bereits erwähnt, diese Methode ist perfekt geeignet, um den Phänotyp und Antigen-Spezifität der CD8 quantifizieren+ T-Zellen (Abbildung 3, 4; Zusätzliche Abbildung 1), nicht nur in der Maus sondern auch beim Menschen. Jedoch Funktionen zum analysieren CD8+ T-Zell-Effektor, wie Granzym-induzierte Zelltod, ICS und/oder ELISpot durchgeführt werden müssen. Allerdings sollte man im Hinterkopf behalten, dass T-Zell-Funktionen, gemessen durch in-vitro-Stimulation nicht die tatsächliche Situation in-vivo darstellen könnte. In vivo eine suppressive Umgebung T Zellfunktionen verhindern möglicherweise die in-vitro-gemessen werden.
Auf seine eigene, Tetramer Färbung bietet nicht alle Informationen, sondern es entwickelt, um eine wesentliche Methode zur T-Zell-Antworten zu charakterisieren und zu quantifizieren T Zelle Teilmengen in-vitro-in einer sehr sensibel38geworden. Tetramers kann nicht nur verwendet werden, bestimmte Teilmengen zu quantifizieren, sondern auch zu isolieren die39, durch in-situ Hybridisierung19,20 zu lokalisieren und zu studieren Low-Affinität Antigene, wie z.B. Tumor-assoziierten40, 41. seit der Entdeckung des Tetramer Technologie4Tetramer Färbung ist ein wesentliches Instrument in der T-Zell-Analyse und das Anwendungsspektrum geworden.
Disclosures
Dorothee von Laer ist Erfinder des VSV-GP und hält Minderheit in der Biotechnologiefirma ViraTherapeutics GmbH, teilt die Rechte am geistigen Eigentum für VSV-GP hält. Für die anderen Autoren gibt es keinen finanziellen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde gefördert vom Österreichischen Wissenschaftsfonds FWF (Projektnummer P 25499-B13) und der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm unter Vereinbarung Nr. 681032 gewähren. Die folgende Reagenz erhielt durch das NIH Tetramer Core Facility: Klasse I MHC-Tetramer für vesikuläre Stomatitis Virus Nucleoprotein (RGYVYQGL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
| Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
| Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
| Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
| Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
| Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
| Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
| Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
| Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
| Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
| Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
| Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
| Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
| Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
| 12.5 mL Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
| Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
| Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
| FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
| PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
| Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
| Sodium azide | Roth | K305.1 | |
| PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
| Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
| FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
| PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
| APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
| OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
| VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
| EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
| LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
| HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |
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