Summary
在这里, 我们提出了一个协议的体外定性检测抗原特异性 cd8+ t 细胞。从器官或少量血液中进行单细胞悬浮液分析是可能的。广泛的研究需要分析细胞毒性 t 细胞的反应 (疫苗接种和癌症免疫治疗研究)。
Abstract
在病毒感染后, 抗原特异性 cd8 + 细胞毒性 t细胞(ctl) 出现, 有助于消除受感染的细胞, 以防止病原体的传播。因此, 抗原特异性 ctl 的频率表明 t 细胞对特定抗原的反应强度。这种分析在基础免疫学、疫苗开发、癌症免疫生物学和适应性免疫学中具有重要意义。在疫苗领域, 针对病毒载体成分的 ctl 反应共同决定了针对感兴趣的抗原 (即转基因) 生成抗原特异性细胞的有效性.抗原特异性 cytometry 可以通过刺激特定肽, 然后细胞内细胞因子染色, 或直接染色抗原特特细胞受体 (tcr) 和流式细胞仪分析。第一种方法相当耗时, 因为它需要牺牲动物来分离器官中的细胞。另外, 它还需要将血液与难以执行的小动物隔离开来。后一种方法相当快, 可以很容易地与少量的血液, 并不依赖于特定的效应功能, 如细胞溶解活性。mhc 四聚体是检测抗原特异性 tcr 的理想工具。
在这里, 我们描述了一个协议, 以同时检测抗原特异性 cytometry 的免疫肽的病毒载体 vsv-gp (lcmv-gp, vsv-np) 和转基因 (ova, hpv 16 e7, egfp) 的 mhc i 四聚体染色和流式细胞术。染色可以直接从血液或单细胞悬浮器官, 如脾脏。血液或单细胞悬浮液的器官是与四聚体孵育。用抗 cd3 和 cd8 抗体染色后, 用流式细胞仪对抗原特异性 cytometry 进行量化。(可选) 可包括针对 cd43、cd44、cd62l 或其他细胞的抗体, 以确定抗原特异性 cd8+ t 细胞的激活状态, 并区分天真细胞和效应细胞。
Introduction
该方法的目的是通过流式细胞仪分析评估小鼠细胞毒性 t 淋巴细胞 (cytometric) 对 (多种) 抗原的反应频率, 而无需耗时的肽刺激。该方法在一次染色中分析了 ctl 亚群的表型和抗原特异性。我们优化了主要组织相容性复合体 i (mhc i) 四聚体染色协议, 以分析新疫苗方法的有效性, 如 vsv-gp, 一个新的变种水泡性口炎病毒 (vsv), 其中的糖蛋白 g 已被取代淋巴细胞脉络膜炎病毒 (lcmv) 的糖蛋白 gp1,2。除了体液反应外, 对疫苗有效性的一个重要解读是对一种或几种抗原的 ctl 反应的诱导。由于细胞反应的一致性和耐久性在这方面很重要, 因此有利于监测同一动物 ctl 反应的动力学。这也将导致动物数量的减少, 这是 "3Rs"3原则的一个重要方面。因此, 从短短20μl 的血液分析是最佳的, 以达到此目的。
四体运动是在 90年代末发展起来的, 成为 t 细胞免疫学领域的重要工具。四聚体是由四种 mhc i/肽分子组成的荧光标记复合物, 与 tcr 结合, 特定于单个肽。如今, 它们可以在埃默里大学6号的 nih tetramer 核心设施免费购买现成的5台, 也可以在实验室7中生产.mhc i 和 ii 四聚体可供选择,即分别适用于 cd8+和 cd4+ t 细胞。四聚体染色的效力在于节省时间, 相当简单和容易标准化8协议, 和灵敏度9。此外, 如果与血液一起工作, 则不需要牺牲动物, 并且需要最少数量的样本。一种测量不限于单一抗原, 但在与不同荧光结合的四聚体组合时, 可以在一次染色中分析几种抗原。新发现的抗原, 例如来自肽屏幕的抗原, 可以很容易地纳入四聚体中, 并用于 t 细胞子集的定量。
四特拉特染色不会提供有关 ctl 功能 (即细胞因子生成、效应器功能) 的信息, 而只提供特异性信息。要获得有关 t 细胞功能的信息, 需要进行 8,10的细胞内细胞因子染色 (ics) 或酶联免疫点 (elispot) 检测。然而, 四特洛克染色和 ics\ elispot 并不是多余的, 而是相互补充的。体外刺激诱导 ics/elispot 产生细胞因子将改变原来的 t 细胞表型。相比之下, 四人组染色会使 t 细胞不被触及;保留原始表型并进行分析。此外, 四聚体的另一个一大优势是染色可以与磁性分选和抗原特异性细胞的富集结合11。这样就可以对稀有种群进行分析, 以及培养具有明确抗原特性的分类细胞--这是其他方法所不可能实现的。
使用这里描述的协议, 四聚体染色, 以及 ics/elispot 可以从一个器官进行, 因为只有很少的材料 (血液: 20μl; 脾脏: 1 x 106细胞) 是需要四聚体染色。然而, 根据感兴趣的抗原特异性细胞的频率、各自 tcr 的强度和实验背景, 可能需要扩大所需的细胞数量, 或可能需要应用磁富集。
四特医生被广泛使用, 例如评估 (抗肿瘤) 疫苗12,13,14,15或免疫治疗16, 17,表型分析和空间抗原特异性 t 细胞亚群18、19、20、21、22、23 的定位。本文介绍的方法适用于研究, 其目的是将小鼠抗原特异性 cd8+ t 细胞的定量和表型分析纳入其快速、简便的分析。
Protocol
所述的所有方法都是根据《奥地利国家动物实验法》 ("tierversuchsgesetz") 进行的, 奥地利国家当局批准了动物试验许可。
1. 缓冲器制备和样品收集
请注意:所使用的鼠标应变取决于所分析的表位。选择合适的四聚体, 结合在小鼠中表达的 mhc 类型, 例如, c57bl6 小鼠的 h-2kb。动物的性别和年龄将取决于科学问题。对于这里描述的大多数实验, 在实验开始时, 即第一次免疫时, 使用6-8周大的雌性老鼠.
- 制备 facs 缓冲液 (磷酸盐缓冲盐水 (pbs) + 1% 胎儿小牛血清 (fcs) + 0.1% 氮化钠 + 2 mm 乙二胺四乙酸 (edta) 和 facs 固定缓冲液 (1.5% (vw) 在 pbs 中)。
请注意:建议提前准备好这两个缓冲区。在4°c 下存储, 直至使用。 - 血液: 如前所述, 从小鼠的尾静脉中收集20μl 的血液。
请注意:血液也可以通过其他途径收集, 例如, 天麻或眼眶后窦.然而, 采血方法必须符合国家动物实验法和动物试验应用。从尾部静脉采集血液是需要反复少量血液的研究的理想选择。补偿控制和非染色控制需要额外的材料。 - 脾脏: 分离器官, 在注射器柱塞的帮助下, 通过70纳米和40μm 的细胞过滤器按压。执行红细胞裂解, 如步骤6中所述, 并计数。将 pbs 中的浓度调整为 1 x 107 cellsll。每个样品, 1 x 106 细胞是必需的。
请注意:总是包括一些模拟免疫或控制载体免疫动物作为阴性对照。对于卵白蛋白 (ova)-四聚体, 从 ot-1 小鼠的样本可以作为阳性对照。不要忘记在计算中的未染色和补偿控制。如有必要, 实验中不同动物的样本可能会为此汇集在一起。 - 采集样品后, 直接进行染色。
2. 染色设置
- 为每个样品准备一个流式细胞仪管。适当地标记试管, 并将100μl 的器官悬浮液 (1 x10 6 细胞) 或20μl 的血液转移到每个管中。
- 脾脏: 在4-8°c 的 600 x 克离心 5分钟 , 并丢弃上清液。旋涡重新悬浮细胞颗粒。
请注意:这将导致剩余体积在20μl 左右, 类似于血液样本的体积。 - 对于要使用的每个通道, 还准备一个流式细胞仪管进行补偿样品。准备一个额外的样品作为一个未染色的控制。
3. 四人运动染色
-
对于每个样品, 使用50μl 的四聚体稀释。有关建议的四聚体和优化稀释剂, 请参阅表1。
请注意:使用四聚体或抗体时, 请关闭安全柜的光线, 保护样品不受光线的影响。- 准备一个带有流式细胞仪缓冲液的管 (体积 = 50μlx 样品数量加上总体积的 10%, 以补偿移液错误)。
- 如表 1所示, 在最佳稀释时添加四聚体。漩涡的解决方案。
请注意:当使用整个抗体面板 (cd3, cd8, cd43, cd44, cd62l) 与列出的荧光, 两个四聚体 (在 pe 和 apc) 可以包括在内。这两种四聚体可以在一次染色中组合 , 即与两个四聚体一起对细胞进行染色。
| 泰特拉默 | 多肽序列 | 基因 | 荧光 | 稀释 |
| MHC I/OVA | siinfekl | h-2kb | Apc | 1:25 |
| MHC I/VSV-NP | rgyvyqgl | h-2kb | 体育 | 1:25 |
| MHC I/EGFP | hylstqsal | h-2kd | 体育 | 1:25 |
| MHC I/LCMV-GP | 卡维纳代 | h-2db | Apc | 1:25 |
| mhc i/hpv 16 e7 | rahynivtf | h-2db | Apc | 1:10 |
表 1: 建议的四聚体和最佳稀释.推荐的四聚体为一些免疫多肽的模型抗原 (Ovalbumin (ova) 和增强的绿色荧光蛋白 (egfp)) 或病原体成分 (室口炎病毒 (vsv) 核蛋白 (np), 淋巴细胞性脉络膜炎病毒 (lcmv) 糖蛋白 ( gp ) 和人状瘤病毒 ( hpv ) e7 oncoco 蛋白 ( e7 ) ) 。对于每一种, 肽序列和相应的等位基因, 以及推荐的荧光和优化稀释列出。
- 在每个样品和涡旋中加入50μl 的四聚体稀释剂。仅将流式细胞仪缓冲液 (不含四聚体) 添加到补偿控制和未染色样品中。
- 在37°c 下对样品进行20分钟的孵化, 防止光线照射。为了确保从四聚体到抗体染色的无缝过渡, 请在孵化期间按照第4步所述制备抗体混合物。
请注意:对于每个单独的四聚体, 需要调整最佳条件 (稀释、孵育时间和温度)。
4. 抗体的制备
-
对于每个样本, 准备50μl 抗体混合物。
- 准备一个带有流式细胞仪缓冲液的管 (体积 = 50μlx 样品数量加上总体积的 10%, 以补偿移液误差)。
- 在稀释中添加抗体, 如表 2所示。
请注意:根据科学问题的不同, 除了此处描述的标记组合之外, 还可以使用其他标记组合。确保在面板中始终包含抗 cd3 和 cd8 的抗体。 - 漩涡的解决方案。
| 抗体 | 荧光 | 稀释 | μg/样品 | 标记 |
| cd3 | pe-cy7 | 1: 200 | 0.05 | ctl (cd3+cd8+) |
| cd8 | 太平洋蓝 | 1:750 | 0.013 | |
| v450 | 1: 100 | 0。1 | ||
| cd43 | fitc | 1: 100 | 0.25 | 激活 (cd43+) |
| cd44 | pe-cy5 | 1: 250 | 0.04 | 天真 (cd44-cd62l+) 和效应器 (cd44+cd62l-) |
| cd62l | apc-cy7 | 1: 500 | 0.02 |
表 2: 本协议中使用的抗体和最佳稀释。第一列列出了推荐的表面标记 (cd3、cd8、cd43、cd44 和 cd62l)。对于每一个, 推荐的荧光体, 优化稀释和抗体样品的数量列出。在最后一列中, 指定了与每个标记标识的单元格类型。
-
准备用于补偿控制的抗体。对于每个补偿控制, 使用相应颜色的 cd8 抗体。
- 对于每个通道, 准备一个含有200μl 的流式细胞仪缓冲液的管, 并以相应的颜色添加1:200 稀释抗体的1:200。
- 圆的管。
- 立即进行染色。
5. 样品的染色
- 在4–8°c 的600xg 下, 在 600 x g 的情况下, 加入约 1 毫升的流式细胞仪缓冲液和离心机, 清洗样品一次。离心后, 丢弃上清液, 将剩余的液体排出成一叠纸巾。
请注意:处理血液时, 请注意排出剩余液体时。在红细胞裂解之前, 血液不会粘附在流式细胞仪管的底部。或者, 吸气上清液。 - 在每个细胞颗粒和涡旋中轻轻加入50μl 抗体混合物。
- 在相应补偿控制的细胞颗粒中加入50μl 的每个补偿混合物, 并轻轻旋涡。
- 在未染色控制和涡旋的细胞颗粒中加入50μl 的流式细胞化缓冲液。
- 在4°c 下将所有样品加氢 30分钟, 防止光线照射。
- 使用器官时: 跳过步骤6。在4–8°c 下, 在 600 x 克的情况下, 加入约1–2毫升的流式细胞仪缓冲液和离心机, 清洗5分钟。离心后, 丢弃上清液, 将剩余的液体排出成一叠纸巾。
- 当处理血液时: 进入步骤 6 (红细胞裂解)。
6. 红细胞裂解
- 在每个样品中加入 500μl ack (氯化铵-钾) 缓冲液 25 , 然后轻轻涡旋。
请注意:ack 缓冲液会导致渗透肿胀和裂解, 特别是红细胞。 - 在室温下在黑暗中孵化5分钟。
- 在4–8°c 的 600 x 克环境下加入1毫升的流式细胞仪缓冲液和离心机5分钟。离心后, 丢弃上清液, 将剩余的液体排出成一叠纸巾。
注意: 当颗粒是相当红色, 重复红细胞的裂解。 - 在4–8°c 下, 在 600 x 克的情况下, 加入 ~ 1–ml 流式细胞仪缓冲液和离心机, 清洗5分钟。离心后, 丢弃上清液, 将剩余的液体排出成一叠纸巾。
7. 流式细胞仪测量和分析
- 在每个管中加入150–300μl 的流式细胞仪固定缓冲液, 并通过涡流混合。对于20μl 的血液, 150μl 的缓冲液就足够了。
请注意:固定前, 一定要确保细胞重新悬浮, 以防止团块的形成。尽快进行流式细胞仪测量。 - 测量补偿控制并纠正任何光谱重叠。
-
设置顺序门, 如图 1所示, 用于选择 cd3+/cd8+单元格。
- 在淋巴细胞上的门使用向前和侧向散射 (面积) (非对数刻度)。
- 在淋巴细胞群中, 使用正向散射宽度与面积 (非对数尺度) 的单个细胞的门。
- 使用 cd3 和 cd8 通道绘制单细胞淋巴细胞 (对数尺度)。通过在 cd3+/cd8 + 细胞上浇注来识别 cd8+ t细胞。
- 在 cd8+ tetramer+细胞上绘制 cd8 + 与 tetramer+细胞和门, 如图 2所示。
- 如果可能, 为每个样本记录 cd3+/cd8+ 门中的 20, 000个细胞 (至少 5, 000个来自血液的细胞), 并保存为 fcs 文件。
请注意:可能需要根据感兴趣的抗原特异性细胞的频率来调整要记录的细胞数量。 - 使用适当的分析软件分析 fcs 文件。如上文 (7.3 节) 所述, 使用门控策略并量化 cd8+四特拉特 + 细胞。
Representative Results
图 1演示了如何正确地在该协议的目标单元 (即 cd3+/cd8+单元) 上启动。需要注意的是, 活化细胞往往下调 t 细胞受体 26, 27, 因此, cd3低细胞也应包括在门控。在对 cd3+/cd8+细胞进行门控后, 可以识别四聚体阳性细胞 (图 2)。代表印迹为阴性控制 (天真) 小鼠, 以及动物接种了 ova 分泌腺病毒 5 (腺-ova) 或接受 ova 表示 vsv-gp (vsv-gp-ova) 的动物。正如在较低的斑点中所看到的, 两个不同的四聚体可以在同一个管中结合起来进行染色。这样就可以同时量化两种不同的 ctl 特性: 病毒特异性 (vsv n) 和转基因特异性 (ova) ctl。我们证实, 单四聚体和双四体污渍对每只四聚体的阳性细胞的比例相似。使用该协议, 可以分析其他特定病毒 (如 lcmv gp、hpv 16 e7) 或转基因特异性 (如 gfp) t 细胞群 (补充图 1)。在补充表 1中, 显示了 vsv-gp-ova 免疫后5只动物的结果, 表明四聚体染色的鲁棒性。
图 1: 分析血液中 cd8+ t 细胞的代表性门控策略.用于流式细胞仪分析的门控策略的原理图表示。经过四聚体染色和流式细胞仪测量, 对数据进行了分析。淋巴细胞被鉴定为前向和侧向散射 (面积) (非对数尺度)。从这些, 单个细胞被识别通过应用正向散射宽度与面积 (非对数尺度)。cd8+ t 细胞是通过在 cd3+/cd8+ 细胞(对数尺度) 上门控鉴定的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 代表性门控策略, 以量化血液中的超限和 nag-nag-cd8+ t 细胞.用于四聚体+细胞流动细胞学定量的门控策略的示意图表示。cd3+/cd8+细胞用于四聚体分析。上、中面板: cd8 标记绘制在各自的四聚体 (对数刻度) 上。下面板: 两个四聚体互相绘制 (对数刻度)。左:控制 (天真的) 鼠标;中:小鼠接种了接受 ova 分泌腺病毒 5 (腺-ova) 的免疫;右:用卵白蛋白 (ova) 表达的 vsv-gp (vsv-gp-ova) 对小鼠进行免疫免疫。免疫后第7天从尾静脉采集血液。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1: 接种后 cd3+/cd8+四聚体+细胞的代表性结果。四聚体+细胞流式细胞仪定量的示意图。cd3+/cd8+细胞用于四分体分析, 并针对各自的四聚体 (对数刻度) 绘制 cd8 标记。左 :小鼠天真 ,右 :小鼠免疫 vsv - gp ( 上板 ) , 增强绿色荧光蛋白 ( egfp ) 表达 vsv - gp ( 中间面板 ) 或 vsv - gp 表示人类状瘤病毒 ( hpv ) e7 癌蛋白 ( e7 ) ( 下板 ) 。免疫后第7天从尾静脉采集血液, 并用四聚体染色 (lcmv-gp、egfp 和 hpv e7)。请点击这里查看此图的较大版本.
这里描述的协议的一个很大的优点是, 随着时间的推移, 同一鼠标的 t 细胞反应可以被跟踪, 因为每次测量只需要少量的血液。图 3显示了随着时间的推移 t 细胞响应的典型结果。除了抗原特异性 ctl 的数量外, 还可以使用此协议对其表型进行分析 (图 4)。
图 3: 接种疫苗后血液中 cd8+ t 细胞动力学的代表性结果。用于四聚体+细胞流动细胞学定量的门控策略的示意图表示。cd3+/cd8+细胞被用于四聚体分析, 两个四聚体相互绘制 (对数刻度)。上面板: 小鼠接种了 ova 分泌腺病毒 5 (腺-ova);下面板: 用卵白蛋白 (ova) 表达 vsv-gp (vsv-gp-ova) 对小鼠进行免疫免疫。免疫后第3、第7、第10和第14天从尾静脉采集血液。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: cd8+ t 细胞在接种疫苗后激活和分化为幼稚和效应细胞的代表性结果。用于流动细胞测量定量的门控策略的示意图表示 (cd44 +)、幼稚 (cd44-/cd62l +) 和效应器 (cd44+/cd62l-) cd3+/cd8+ (对数刻度)。左:控制 (天真的) 鼠标;中:小鼠接种了接受 ova 分泌腺病毒 5 (腺-ova) 的免疫;右:用卵白蛋白 (ova) 表达的 vsv-gp (vsv-gp-ova) 对小鼠进行免疫免疫。免疫后第7天从尾静脉采集血液。请点击这里查看此图的较大版本.
| 鼠标 # | % cd43+ | % vsv-n tetramer+ | % ova tetramer+ | |
| 模拟 | 1 | 1。7 | 0.45 | 0.41 |
| 2 | 0.77 | 0.69 | 0.15 | |
| 3个 | 1.34 | 0.35 | 0.31 | |
| 4个 | 1.68 | 0.83 | 0.26 | |
| 5 | 0.84 | 0.47 | 0.23 | |
| VSV-GP-OVA | 1 | 23 | 13。2 | 3.69 |
| 2 | 32。6 | 15。9 | 3.54 | |
| 3个 | 22。1 | 11。7 | 2.43 | |
| 4个 | 15。1 | 8.89 | 1.79 | |
| 5 | 29。1 | 14。7 | 5.64 |
补充表 1:疫苗接种后活化和抗原特异性 cd3+/cd8+细胞的百分比。小鼠要么天真, 要么接种卵白蛋白 (ova)-表达 vsv-gp (vsv-gp-ova) (n = 5)。免疫后第7天从尾静脉采集血液, 并用四聚体 (vsv-n 和 ova) 染色。用流式细胞仪对活化 (cd43 +) 和抗原特异性 (四聚体+) cd3 +/cd8+细胞进行了定量。
Discussion
四特胺染色是一个相当简单和简单的程序来分析表型和肽特异性的 t 淋巴细胞。如这里所述, 使用血液进行分析是微创的, 可以进行持续监测, 例如在疫苗接种研究中。在疫苗接种领域, 对特定于矢量和抗原的反应进行量化是令人感兴趣的, 因为特定于矢量的反应可能会阻碍对疫苗抗原 28的有效免疫反应。值得注意的是, 使用此处描述的协议, 两个群体都可以在一次四聚体染色中同时量化, 从而减少染色变异性和样本量。然而, 需要认真采取几个步骤, 以确保适当的测量和可靠的数据。如果使用尾静脉的血液进行分析, 应确保对动物进行预热, 以诱导血管扩张 24.因此, 可以在短时间内收集到足够的血液, 减少对动物的压力, 与血液收集缓慢相比, 分析要好得多。此外, 在采集样本 (血液或器官) 后, 建议直接染色, 以避免由于 tcr 下调而产生的假阴性结果。这同样适用于所有后续步骤: 该过程不应中断, 所有清洗步骤都应减少到最小数量 (如议定书所述)。为确保正确染色, 应注意在孵育前后将所有溶液和样品旋涡。这在修复样品之前尤其重要, 以避免细胞聚集。
在修改协议方面, 可以根据分析的目的使用其他表面标记和四聚体。然而, 所有的试剂, 然后需要滴定, 最好地结合整个染色面板。对于这里指定的一些四聚体, 优化显示我们可以增加制造商推荐的稀释量 (1:10 推荐, 优化 1x:25) (表 1)。为了补偿光谱重叠, 可以使用补偿珠而不是染色细胞。关于四聚氟铬的选择, 我们应该设想使用明亮的荧光铬, 因为这有利于检测--特别是当信号较低时。作为 dolton 和同事29, 我们更喜欢使用 peg 或 apc 耦合四聚体, 它可以在一次染色中完美组合, 并且可以很好地检测到具有单一抗原特异性的 cd8+ t 细胞(图 2)。关于温度和孵育时间, 存在多种四聚体染色条件。在优化过程中, 我们解决了这一问题, 并在不同条件下 (例如4°c、室温或 37°c) 进行了四聚体染色。从得到的结果, 我们建议染色20分钟在 37°c, 这是与文献30,31一致。应避免长时间孵育, 因为这可能导致四聚体30的内化和假的阴性结果。
选择正确的抗体检测 cd8+细胞是另一个重要问题, 必须仔细考虑 (并可能适应)。这是由于这样一个事实, 即某些抗 cd8 抗体克隆阻断了四聚体与 tcr 的结合, 在人类32以及小鼠33样本中。对于我们的四聚体染色协议, 我们选择了克隆53-6.7 来染色小鼠 cd8+细胞--一个不阻塞, 而是增强四聚体染色的克隆。
例如, 在分析 t 细胞反应高峰时的突出免疫反应时, 四特医生染色并不复杂。然而, 可能会有一些人口更 "有问题"。这些例子包括特异性细胞低亲和力抗原 (肿瘤, 自我), 最近激活的细胞, 后来下调其受体或罕见的细胞亚群 (例如天真的前体或记忆细胞群)。在这些情况下, 可能需要改进或与其他方法结合使用经典的四聚体染色协议。例如, 蛋白激酶抑制剂 (pki) 达沙替尼抑制 tcr 内化, 可能包括在四聚体染色之前。四聚体也可以通过包括抗氟铬非共轭原生 abs 后, 四聚体染色来稳定。此外, 荧光强度可以通过添加第二个抗 ab 荧光结合 ab29,34,35,36。我们有选择地优化了本协议中指定的四聚体的条件, 不包括 pki 或其他 abs。但是, 对于任何其他四聚体, 必须单独调整最佳条件。对于稀有人群, 四聚体染色可能需要与磁性富集结合11。
为便于验证四聚体染色的流式细胞仪分析, 应纳入阴性和阳性对照。作为一个负面的控制, 我们总是用我们感兴趣的四聚体来染色同样菌株的天真老鼠的细胞。或者, 样品可以用不相关的肽染色, 但与感兴趣的四聚体使用相同的氟铬。这种控制对于排除假阳性信号至关重要, 例如,来自垂死细胞的信号。除此之外, 建议包括一个活的死污渍, 如碘化物 (pi)。如果细胞在隔离后没有直接染色, 这一点就特别重要。另一种去除自荧光背景的策略可能是在一个通道中包含多个非 t 细胞标记。通过排除该通道中的阳性细胞, 可以排除非 t 细胞群。例如, 作为一个阳性控件, ot-1 鼠标中的样本可用于 ova 四聚体。对于其他四聚体, 这必须单独选择 (例如,从老鼠的样本, 这是免疫几次)。与其他同类 37一样, 我们还观察到 ctl 激活过程中 cd8 受体在效应 t 细胞反应第7天的下调。因此, 为了避免失去激活的四聚体+效应 t 细胞, 我们建议在分析中包括 cd8低单元(至少在效应器阶段测量时)。
从该协议中检索到的信息的质量和数量取决于对将要研究的抗原的了解、四聚体的可用性和特异性以及流式细胞仪机器的质量 (激光和可用探测器的数量)。如果与动物样本合作, 免疫反应的变化是自然和不可避免的。因此, 为了从四聚体染色中获得有意义的结果, 至少有3-5 只动物应进行分析。如果这样做, 这里描述的协议将提供可靠和可重现的结果 (一个实验的模范结果可以在补充表1 中找到)。如前所述, 该方法非常适合于量化 cd8+ t 细胞的表型和抗原特异性 (图 3, 4;补充图 1), 不仅在鼠标, 而且在人类。然而, 要分析 cd8+ t 细胞效应函数, 如粒细胞死亡, ics 和/或 elispot 需要进行。然而, 人们应该记住, 通过体外刺激测量的 t 细胞功能可能并不代表体内的实际情况。在体内, 抑制环境可能会阻止在体外测量的 t 细胞功能。
四聚体染色本身并不能提供所有信息, 但它已发展成为一种重要的方法, 以非常敏感的方式表征 t 细胞的反应和在体外量化 t 细胞亚群。四足细胞不仅可以用来量化某些子集, 还可以分离出这39个子集, 通过原位杂交19,20将它们定位, 并研究低亲和力抗原, 如肿瘤相关的 40, 41. 自发现四聚体技术4以来, 四聚体染色已成为 t 细胞分析和应用范围的重要工具。
Disclosures
doroetyvon laer 是 vsv-gp 的发明者, 并持有生物技术公司 ViraTherapeutics gmbh 的少数股权, 该公司拥有 vsv-gp 的知识产权。对其他作者来说, 不存在相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
该项目由 fwf 奥地利科学基金 (项目编号 p 25499-b13) 和欧洲联盟的 "地平线 2020" 研究和创新方案根据第6681032号赠款协议提供资金。以下试剂是通过 nih 四聚体核心设施获得的: i 类 mhc 四聚体, 用于泡状口炎病毒核蛋白 (rgyyqgl)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
| Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
| Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
| Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
| Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
| Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
| Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
| Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
| Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
| Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
| Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
| Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
| Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
| Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
| 12.5 mL Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
| Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
| Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
| FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
| PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
| Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
| Sodium azide | Roth | K305.1 | |
| PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
| Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
| FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
| PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
| APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
| OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
| VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
| EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
| LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
| HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |
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