Summary
Här presenterar vi ett protokoll för ex vivo kvalitativ detektion av antigen-specifika CD8+ T celler. Analys är möjlig med enda cellsuspensioner från organ eller små mängder blod. Ett brett spektrum av studier kräver analysen av cytotoxiska T-cell svar (vaccination och cancer immunoterapi studier).
Abstract
Vid virusinfektion, antigen-specifika CD8+ cytotoxiska T-celler (CTL) uppstår och bidra till avskaffandet av infekterade celler för att förhindra spridning av patogener. Frekvensen av antigen-specifika CTL är därför vägledande av styrkan av den T-cellssvar mot ett specifikt antigen. Sådan analys är viktigt i grundläggande immunologi, utvecklingen av vaccin, cancer immunobiology och den adaptiva immunology. I fältet vaccin avgör CTL svaret riktas mot komponenter av en viral vektor tillsammans hur effektiv generering av antigen-specifika celler mot antigenet av intresse (dvs., transgenens) är. Antigen-specifika CTL kan antingen upptäckas genom stimulering med särskilda peptider följt av intracellulära cytokin färgning eller den direkt färgning av antigen-specifika T-cellreceptorer (TCRs) och analys av flödescytometri. Den första metoden är ganska tidskrävande eftersom det kräver att offra djur att isolera cellerna från organ. Det kräver också, isolering av blod från små djur som är svår att utföra. Den senare metoden är ganska snabb, kan enkelt göras med små mängder blod och är inte beroende av specifika effektor funktioner, såsom cytolytisk aktivitet. MHC tetramers är ett idealiskt verktyg för att upptäcka antigen-specifika TCRs.
Här beskriver vi ett protokoll för att samtidigt upptäcka antigen-specifika CTL för de immundominant peptiderna av den virala vektorn VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) och transgener (ägg, HPV 16 E7, andra) av MHC jag tetramer färgning och flöde flödescytometri. Färgningen är möjligt direkt från blod eller enstaka cellsuspensioner av organ, såsom mjälte. Blod eller enstaka cellsuspensioner av organ inkuberas med tetramers. Efter färgning med antikroppar mot CD3 och CD8, kvantifieras antigen-specifika CTL av flödescytometri. Du kan också antikroppar mot CD43, CD44, CD62L eller andra kan ingå att bestämma aktiveringsstatus för antigen-specifika CD8+T celler och att diskriminera mellan naiva och effektor celler.
Introduction
Syftet med denna metod är att bedöma frekvensen av cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) Svaren till (flera) antigener i musen genom flödet flödescytometrisk analys utan behov av tidskrävande peptid stimulering. Denna metod analyserar CTL delmängder, i en enda färgning fenotyp och antigen specificitet. Vi har optimerat de Major Histocompatibility Complex jag (MHC jag) tetramer färgning protokoll för att analysera effekten av nya vaccin tillvägagångssätt, såsom VSV-GP, en ny variant av vesikulär stomatit viruset (VSV), där glykoprotein G av VSV har ersatts av den glykoprotein GP av lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV)1,2. Förutom den humorala svaren är en viktig avläsning av effektivitet, ett vaccin induktion av en CTL reaktion mot en eller flera antigener. Som konsekvens och hållbarhet av cellulära svar är viktiga i detta sammanhang, är det gynnsamt att övervaka kinetik av CTL svar från samma djur. Detta leder också till en minskning av antalet djur, en viktig aspekt angående principerna av ”3R”3. Analys från så lite som 20 µL av blod är därför optimala för detta ändamål.
Tetramers utvecklades i slutet av 904 och blev ett viktigt verktyg i T cells immunologi. Tetramers är fluorescently-märkt komplex av fyra MHC jag / peptid molekyler, som binder till TCRs, specifika för en enda peptid. Nuförtiden, de kan antingen köpas färdiga5, anpassad beställas kostnadsfritt vid NIH Tetramer Core anläggningen vid Emory University6 eller produceras i lab7. MHC I och II tetramers är tillgängliga, dvs för CD8+ och CD4+ T celler, respektive. Styrkan av tetramer färgning ligger i tidsbesparing, ganska enkel och lätt att standardisera8 protokoll och känslighet9. Också, om arbetar med blod, djur behöver inte offras och minimala mängder prov krävs. En mätning är inte begränsad till en enda antigen, men flera antigener kan analyseras i en färgning när kombinera tetramers konjugerat med olika fluorophores. Nyupptäckta antigener, e.g. från peptid skärmar, kan enkelt integreras i tetramers och används för kvantifiering av T-cell delmängd.
Tetramer färgning kommer inte att ge information om CTL funktionalitet (i.e., cytokin produktion, effektor funktioner), men endast specificitet. Att få information om T-cell funktionalitet, intracellulära cytokin färgning (ICS) eller enzym länkade Immuno Spot (ELISpot) test måste utföras8,10. Tetramer färgning och ICS/ELISpot, dock är inte överflödig utan snarare kompletterar varandra. In vitro-stimulering att inducera cytokin produktion för ICS/ELISpot kommer att ändra den ursprungliga T-cell fenotypen. Tetramer färgning, däremot lämnar cellen T orörd; den ursprungliga fenotypen är bevarad och kan analyseras. Också, en annan stor fördel med tetramers är att färgning kan kombineras med magnetiska sortering och anrikning av antigen-specifika celler11. Detta möjliggör analys av sällsynta populationer, samt odling av sorterade celler med definierade antigen-särdrag – en funktion som är inte är möjligt med andra metoder.
Med hjälp av protokollet som beskrivs här, tetramer färgning samt ICS/ELISpot kan utföras från en orgel, eftersom endast mycket lite material (blod: 20 µL; mjälte: 1 x 106 celler) krävs för tetramer färgning. Dock beroende på frekvensen av antigen-specifika celler av intresse, styrkan i respektive TCR och experimentella sammanhang, mängden celler krävs behöva skalas upp eller magnetisk anrikning kan behöva tillämpas.
Tetramers ofta används, till exempel för att bedöma effektivitet (antitumöreffekt) vacciner12,13,14,15 eller immunterapi16,17, fenotypiska analys och rumsliga lokalisering av antigen-specifika T-cell delmängder18,19,20,21,22,23. Den metod som beskrivs här är lämpad för studier, som syftar till att omfatta kvantifiering och fenotypiska analys av murina antigen-specifika CD8+ T celler i sin analys på ett snabbt och bekvämt sätt.
Protocol
Alla metoder beskrivs utfördes i enlighet med den österrikiska nationella djur experiment lagen (”Tierversuchsgesetz”), och djur rättegång tillstånd beviljades av österrikiska myndigheter.
1. buffert förberedelse och prova samling
Obs: Mus stammen används beror på den epitop analyseras. Välja en lämplig tetramer som binder till en MHC typ uttryckt i möss, e.g., H - 2Kb för C57BL/6 möss. Kön och ålder på djur beror på de vetenskapliga ifrågasätter. För de flesta av de experiment som beskrivs här, använda honmöss vid 6 – 8 veckors ålder i början av experimentet, dvs, första immunisering.
- Förbereda FACS buffert (fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 1% fetalt kalvserum (FCS) + 0,1% natriumazid + 2 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och FACS fastställande buffert (1,5% (v/v) formaldehyd i PBS).
Obs: Det rekommenderas att båda buffertar är beredda i förväg. Lagras vid 4 ° C fram till användning. - Blod: Samla 20 µL blod per mus från svans venen av musen i EDTA-belagda rör, som tidigare beskrivits24.
Obs: Blod kan också samlas in av andra vägar, t ex, vena facialis eller retro-orbital sinus. Metoden för blodinsamling har dock vara i enlighet med de nationella djurförsök lag och djur rättegång program. Insamling av blod från svans venen är idealisk för studier där upprepade gånger små mängder blod behövs. Ytterligare material krävs för ersättning kontroller och icke-färgade kontroll. - Mjälte: Isolera orgeln och, med hjälp av kolven i en spruta, tryck genom en 70 nm och 40 µm cell SIL. Utför lys av erytrocyter, som beskrivs i steg 6 och antal. Justera koncentration till 1 x 107 celler/mL i PBS. Per prov krävs 1 x 106 celler.
Obs: Alltid innehåller några håna immuniserats eller styra vector immuniserats djur som negativ kontroll. För äggalbumin (ägg)-tetramer, ett prov från OT-1 möss kan användas som positiv kontroll. Glöm inte ofärgade och ersättning kontroller i beräkningen. Vid behov kan prover från olika djur i experimentet poolas för detta. - Efter provtagning, direkt fortsätta med färgningen.
2. färgning Set-up
- Förbereda en FACS tub för varje prov. Märk rören ordentligt och överföra 100 μL orgel suspension (1 x 106 celler) eller 20 μL av blod i varje rör.
- Mjälte: Centrifugera under 5 minuter på 600 x g vid 4 – 8 ° C och kasta bort supernatanten. Vortex att resuspendera cellpelleten.
Obs: Resulterar i en återstående volym om cirka 20 µL, liknande som volymen för blodprov. - För varje kanal som ska användas också förbereda en FACS tub för en ersättning prov. Förbereda ett ytterligare prov som ofärgade kontroll.
3. tetramer färgning
-
För varje prov, Använd 50 μL av tetramer utspädning. För föreslagna tetramers och optimerad utspädningar, se tabell 1.
Obs: När du arbetar med tetramers eller antikroppar, stänga av ljuset säkerhet skåp och ljuskänsligt prover.- Förbereda en tub med FACS buffert (volym = 50 μL × antal prover plus ytterligare 10% av den totala volymen att kompensera för pipettering fel).
- Lägg till tetramer(s) på optimal utspädning, som anges i tabell 1. Vortex lösningen.
Obs: När du använder panelen hela antikropp (CD3, CD8, CD43, CD44, CD62L) med börsnoterade fluorophores, kan två tetramers (i PE och APC) ingå. Båda tetramers kan kombineras i en enda färgning, dvs, färgning av celler med båda tetramers kan utföras samtidigt.
| Tetramer | Peptid sekvens | Allel | Fluorophore | Utspädning |
| MHC JAG / ÄGG | SIINFEKL | H - 2Kb | APC | 1:25 |
| MHC JAG/VSV-NP | RGYVYQGL | H - 2Kb | PE | 1:25 |
| MHC JAG / ANDRA | HYLSTQSAL | H-2Kd | PE | 1:25 |
| MHC JAG/LCMV-GP | KAVYNFATC | H-2Db | APC | 1:25 |
| MHC JAG / HPV 16 E7 | RAHYNIVTF | H-2Db | APC | 1:10 |
Tabell 1: föreslog tetramers och optimal utspädningar. Rekommenderade tetramers för vissa immundominant peptider modell antigener (äggalbumin (OVA) och förbättrad grönt fluorescerande protein (andra)) eller patogen komponenter (vesikulär stomatit virus (VSV) nucleoprotein (NP), lymfocytisk Choriomeningitis Virus (LCMV ) Glykoprotein (GP) och humant papillomvirus (HPV) E7 onkoprotein (E7)). För varje peptid sekvens och motsvarande allel listas samt som rekommenderade fluorophore och optimerad utspädning.
- Tillsätt 50 μL av tetramer utspädning till varje prov och vortexa försiktigt. Lägga till FACS buffert endast (utan tetramer) ersättning kontroller samt ofärgade provet.
- Inkubera prover under 20 minuter vid 37 ° C, skyddas från ljus. För att säkerställa en smidig övergång från tetramer till antikropp färgning, förbereda den antikropp blandningen enligt beskrivningen i steg 4 under inkubationstiden.
Obs: För varje enskild tetramer behöver optimala förutsättningar (utspädning, inkubationstiden och temperatur) justeras.
4. beredning av antikroppar
-
För varje prov, förbereda 50 µL av antikropp mix.
- Förbereda en tub med FACS buffert (volym = 50 μL × antal prover plus ytterligare 10% av den totala volymen att kompensera pipettering fel).
- Lägg till antikroppar i utspädningarna som förtecknas i tabell 2.
Obs: Beroende på den vetenskapliga frågan, kan andra markör kombinationer utöver den som beskrivs här användas. Se till att alltid inkludera antikroppar mot CD3 och CD8 på panelen. - Vortex lösningen.
| Antikropp | Fluorophore | Utspädning | µg/sample | Markör |
| CD3 | PE-Cy7 | 1: 200 | 0,05 | CTL (CD3+CD8+) |
| CD8 | Pacific Blue | 1: 750 | 0,013 | |
| V450 | 1: 100 | 0,1 | ||
| CD43 | FITC | 1: 100 | 0,25 | Aktivering (CD43+) |
| CD44 | PE-Cy5 | 1: 250 | 0,04 | Naive (CD44–CD62L+) & effektor (CD44+CD62L–) |
| CD62L | APC-Cy7 | 1: 500 | 0,02 |
Tabell 2: antikroppar används i detta protokoll och optimal utspädningar. Rekommenderad yta markörer (CD3, CD8, CD43, CD44 och CD62L) listas i första kolumnen. För varje anges de rekommenderade fluorophore, optimerad utspädning och mängden antikroppar/prov. I den sista kolumnen anges den celltyp som identifieras med varje markör.
-
Förbereda antikroppar för ersättning kontroller. För varje kontroll som kompensation, använda en antikropp mot CD8 i respektive färg.
- För varje kanal, Förbered en tub med 200 μL av FACS buffert och tillsätt 1 μL spädning 1: 200 antikroppar mot CD8 i respektive färg.
- Vortex rören.
- Omedelbart fortsätta med färgning.
5. färgning av prover
- Tvätta prover en gång genom att lägga till ~ 1 mL FACS buffert och Centrifugera under 5 minuter på 600 x g vid 4 – 8 ° C. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och rinna av kvarvarande vätska på en bunt hushållspapper.
Obs: När du arbetar med blod, var försiktig när dränering av kvarvarande vätska. Före lys av erytrocyter fastnar blod inte i botten av röret FACS. Alternativt Aspirera supernatanten. - Tillsätt 50 μL av antikropp mixen till varje cellpelleten och vortexa försiktigt.
- Tillsätt 50 μL av varje ersättning mix till cellpelleten motsvarande ersättning kontroll-och vortex försiktigt.
- Tillsätt 50 μL av FACS buffert till cellpelleten ofärgade kontroll-och vortex försiktigt.
- Inkubera alla prover under 30 minuter vid 4 ° C, skyddas från ljus.
- När du arbetar med organ: hoppa över steg 6. Tvätta en gång genom att lägga till ~ 1 – 2 mL FACS buffert och Centrifugera under 5 minuter vid 600 x g vid 4 – 8 ° C. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och rinna av kvarvarande vätska på en bunt hushållspapper.
- När du arbetar med blod: gå vidare till steg 6 (Lys av erytrocyter).
6. lys av erytrocyter
- Tillsätt 500 μL av ACK (Ammonium-klorid-kalium) buffert25 till varje prov och försiktigt vortex.
Obs: ACK bufferten kommer att leda till osmotisk svullnad och Lys, särskilt av erytrocyter. - Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur i mörkret.
- Tillsätt 1 mL FACS buffert och Centrifugera under 5 minuter på 600 x g vid 4 – 8 ° C. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och rinna av återstående vätskan på en bunt hushållspapper.
Obs: När pelleten är snarare röd, upprepa lys av erytrocyter. - Tvätta en gång genom att lägga till ~ 1 – 2 mL FACS buffert och Centrifugera under 5 minuter vid 600 x g vid 4 – 8 ° C. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och rinna av kvarvarande vätska på en bunt hushållspapper.
7. flöde flödescytometrisk mätning och analys
- Tillsätt 150 – 300 μL av FACS fastställande buffert i varje rör och blanda genom vortexa. För 20 µL av blod räcker 150 µL buffert.
Obs: Innan fixering, se till att cellerna är väl åter avstängda för att förhindra bildandet av klumpar. Fortsätt med flödescytometrisk flödesmätning så snabbt som möjligt. - Mäta ersättning kontroller och korrigera eventuella spektrala överlappningar.
-
Ställa in sekventiella portar, som avbildas i figur 1 att välja för CD3+/CD8+ celler.
- Grind på lymfocyter med framåt och sidled scatter (område) (icke-logaritmisk skala).
- Inom lymfocyter befolkningen, gate på enstaka celler använder framåt scatter bredd vs område (icke-logaritmisk skala).
- Rita enda cellslymfocyter med CD3 och CD8 kanaler (logaritmisk skala). Identifiera CD8+ T celler av gating på CD3+/CD8+ celler.
- Rita CD8+ vs Tetramer+ celler och gate på CD8+ Tetramer+ celler, som avbildas i figur 2.
- Om möjligt, spela in 20.000 celler (minst 5.000 celler från blodet) i CD3+/CD8+ utfärda utegångsförbud för varje prov och Spara som en FCS fil.
Obs: Mängden celler att registrera behöva justeras enligt frekvensen av antigen-specifika celler av intresse. - Analysera FCS filer med lämplig analysprogramvara. Använd den portande strategin, enligt beskrivningen ovan (avsnitt 7.3) och kvantifiera CD8+ Tetramer+ celler.
Representative Results
Figur 1 visar hur gate korrekt på målceller av detta protokoll, nämligen CD3+/CD8+ celler. Det är att notera att aktiveras celler ofta T-cell receptor26,27 downregulate och CD3låg celler bör därför också ingå i den gating. Efter gating CD3+/CD8+ celler, tetramer positiva celler kan vara identifierade (figur 2). Representant blotting för en negativ kontroll (naiva) mus, som väl som djur antingen vaccinerats med antingen OVA-utsöndrar Adenovirus 5 (Adeno-ägg) eller ägg-uttryckande VSV-GP (VSV-GP-ägg) visas. Som sett i de lägre blotting två olika kan tetramers kombineras i en och samma tub för färgning. Detta tillåter samtidiga kvantifiering av två olika CTL särdrag: virus-specifika (VSV N) och transgenens-specifika (OVA) CTL. Vi bekräftat att enkel- och Dubbelrum tetramer infärgning ger liknande andelen positiva celler för varje tetramer. Användning av detta protokoll, andra virus-specifika (t.ex.., LCMV GP, HPV 16 E7) eller transgenens-specifika (e.g., GFP) T-cell populationer kan analyseras (kompletterande Figur1). I kompletterande Tabell1, visas resultatet för fem djur efter immunisering med VSV-GP-OVA — som anger robusthet av tetramer färgning.
Figur 1: Representant gating strategi att analysera CD8+ T celler i blod. Schematisk bild av den portande strategi som används för flöde flödescytometrisk analys. Efter tetramer färgning och flöde flödescytometrisk mätning analyserades data. Lymfocyter identifierades med framåt och sidled scatter (område) (icke-logaritmisk skala). Från de identifierades enstaka celler genom att tillämpa framåt scatter bredd vs område (icke-logaritmisk skala). CD8+ T celler identifierades av gating på CD3+/CD8+ celler (logaritmisk skala). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant gating strategi att kvantifiera OVA - och N-specifika CD8+ T celler i blod. Schematisk bild av den portande strategi som används för flöde flödescytometrisk kvantifiering av tetramer+ celler. CD3+/CD8+ celler användes för tetramer analys. Övre och mellersta panelen: CD8 markören var plottas mot respektive tetramer (logaritmisk skala). Nedre panelen: båda tetramers var plottas mot varandra (logaritmisk skala). Vänster: kontroll (naiva) mus; mellersta: mus var immuniserats med ägg-utsöndrar Adenovirus 5 (Adeno-ägg). rätt: mus var immuniserats med äggalbumin (ägg)-uttrycker VSV-GP (VSV-GP-ägg). Blod samlades från svans ven dag 7 efter immunisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande bild 1: Representativa resultat av CD3+/CD8+ tetramer+ celler efter vaccination. Schematisk framställning av flöde flödescytometrisk kvantifiering av tetramer+ celler. CD3+/CD8+ celler användes för tetramer analys och CD8 markören var plottas mot respektive tetramer (logaritmisk skala). Vänster: möss var naiva, rätt: mössen vaccinerades med VSV-GP (övre panel), enhanced grönt fluorescerande Protein (andra)-uttrycker VSV-GP (mellersta panelen) eller VSV-GP uttrycker humant papillomvirus (HPV) E7 onkoprotein (E7) (nedre panelen). Blod samlades från svans ven dag 7 efter immunisering och målat med tetramers (LCMV-GP, andra och HPV E7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En stor fördel av det protokoll som beskrivs här är att T-cell svar från samma mus kan följas över tid eftersom endast små mängder blod behövs för varje mätning. Figur 3 visar exemplariskt resultat för T-cell svar över tiden. Förutom mängder antigen-specifika CTL, kan deras fenotyp också analyseras med detta protokoll (figur 4).
Figur 3: Representativa resultat av CD8+ T cell kinetic i blodet efter vaccination. Schematisk representation av den portande strategi som används för flöde flödescytometrisk kvantifiering av tetramer+ celler. CD3+/CD8+ celler användes för tetramer analys och båda tetramers var plottas mot varandra (logaritmisk skala). Övre paneler: mus var immuniserats med ägg-utsöndrar Adenovirus 5 (Adeno-ägg). lägre paneler: mus var immuniserats med äggalbumin (ägg)-uttrycker VSV-GP (VSV-GP-ägg). Blod samlades från svans ven på dag 3, 7, 10 och 14 efter immunisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa resultat av CD8+ T cell aktivering och differentiering i naiva och effektor celler efter vaccination. Schematisk representation av den portande strategi som används för flöde flödescytometrisk kvantifiering av aktiverat (CD43+), naiva (CD44–/CD62L+) och effektor (CD44+/CD62L–) CD3+/CD8+ celler () logaritmisk skala). Vänster: kontroll (naiva) mus; mellersta: mus var immuniserats med ägg-utsöndrar Adenovirus 5 (Adeno-ägg). rätt: mus var immuniserats med äggalbumin (ägg)-uttrycker VSV-GP (VSV-GP-ägg). Blod samlades från svans ven dag 7 efter immunisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mus # | % CD43+ | % VSV-N Tetramer+ | % ÄGG Tetramer+ | |
| mock | 1 | 1.7 | 0,45 | 0,41 |
| 2 | 0,77 | 0,69 | 0,15 | |
| 3 | 1,34 | 0,35 | 0,31 | |
| 4 | 1,68 | 0,83 | 0,26 | |
| 5 | 0.84 | 0,47 | 0,23 | |
| VSV-GP-ÄGG | 1 | 23 | 13.2 | 3,69 |
| 2 | 32,6 | 15,9 | 3.54 | |
| 3 | 22,1 | 11,7 | 2.43 | |
| 4 | 15,1 | 8.89 | 1,79 | |
| 5 | 29,1 | 14,7 | 5,64 |
Kompletterande tabell 1: Procentandelar av aktiverad och antigen-specifika CD3+/CD8+ celler efter vaccination. Möss antingen naiva eller immuniserats med äggalbumin (ägg)-uttrycker VSV-GP (VSV-GP-ägg) (n = 5). Blod samlades från svans ven dag 7 efter immunisering och målat med tetramers (VSV-N och ägg). Aktiverad (CD43+) och antigen-specifika (tetramer+) CD3+/CD8+ celler kvantifierades genom flödescytometri.
Discussion
Tetramer färgning är en ganska enkel och okomplicerad protokoll att analysera fenotyp och peptid specificitet av en T-lymfocyter. Användningen av blod för analys, som beskrivs här, är minimalt invasiva och tillåter kontinuerlig övervakning, till exempel i vaccination studier. I fältet för vaccination är kvantifiering av vektor - och antigen-specifika svar av intresse, som vektor-specifika Svaren kan hindra ett effektivt immunsvar mot vaccinet antigen28. Att notera är att med protokollet som beskrivs här, båda populationerna kan kvantifieras samtidigt i en enda tetramer färgning, därigenom minska färgning variabilitet och prov belopp. Men måste några steg göras noggrant för att säkerställa korrekt mätning och tillförlitliga uppgifter. Om du använder blod från svans venen för analys, bör en se till att före varm att framkalla vasodilatation24djur. Därmed, tillräckliga blod kan samlas i en kort tid, stress på djuren reduceras och analysen är mycket bättre, jämfört om blodet samlas långsamt. Också, efter provtagning (blod eller organ), direkt färgning rekommenderas att undvika falska negativa resultat på grund av TCR nedreglering. Detsamma gäller för alla efterföljande steg: förfarandet bör inte avbrytas och alla tvätt steg reduceras till det minimala antalet (som anges i protokollet). För att säkerställa korrekt färgning, bör vara försiktig att vortex alla lösningar och prover före och efter inkubation. Detta är särskilt viktigt före fastställande av proverna för att undvika klumpar av celler.
När det gäller ändra protokollet, andra yta markörer och tetramers kan användas, beroende på syftet med analysen. Dock är alla reagens måste titreras, optimalt i kombination med hela färgning panel. För några av de tetramers som anges här, optimering avslöjade att vi kan öka den utspädning som rekommenderas av tillverkaren (1:10 rekommenderas, optimerad 1:25) (tabell 1). För att kompensera spektrala överlappning, kan ersättning pärlor användas istället för färgade celler. När det gäller valet av den tetramer-kopplade fluorokrom, man bör tänka sig för att använda ljusa fluorokromer, som detta underlättar upptäckt - särskilt när signalen är låg. Som Dolton och kollegor29, vi föredrar att använda PE - eller APC-kombination tetramers, som kan perfekt kombineras i en enda färgning och CD8+ T celler med en enda antigen specificitet kan vara fint upptäckt (figur 2). Om temperatur och inkubation tider finns en mängd tetramer färgning villkor. I vår optimering process, vi tog upp denna fråga och utfört tetramer färgning på olika villkor (t.ex. 4 ° C, rumstemperatur eller 37 ° C). Från de resultat som uppnåtts, rekommenderar vi för att färga under 20 minuter vid 37 ° C, vilket är i överensstämmelse med litteraturen30,31. Långvarig inkubation bör undvikas, eftersom detta kan leda till internalisering av de tetramer30 och falskt negativa resultat.
Valet av rätt antikroppen för detektion av CD8+ celler är en annan viktig fråga som har att genomtänkt (och potentiellt anpassade). Detta beror på att vissa anti-CD8 antikropp kloner block bindning av tetramers till TCR, i mänskliga32 samt mus33 prover. För våra tetramer färgning protokoll, vi valt klon 53 – 6,7 att färga för murina CD8+ celler — en klon som blockerar inte, utan snarare förstärker tetramer färgning.
Tetramer färgning är ganska okomplicerat när man analyserar framstående immunsvar på toppen av T-cellssvar, till exempel. Det kan dock finnas befolkningar som är lite mer 'problematiska'. Sådana exempel är celler som är specifika för låg affinitet antigener (tumör, själv), nyligen aktiverade celler som därefter ned-reglerade deras receptorer eller ovanlig cell undergrupper (t.ex.. naiv föregångare eller minne cellpopulationer). I dessa fall behöva den klassiskt tetramer färgning protokoll förbättras eller kombineras med andra metoder. Till exempel den protein kinase inhibitor (PKI) dasatinib hämmar TCR internalisering och kan ingå före tetramer färgning. Tetramers kan också stabiliseras av inklusive anti fluorokrom okonjugerat primära Abs efter tetramer färgning. Fluorescensintensiteten kan dessutom ökas genom tillägg av en andra anti Ab fluorokrom-konjugerad Ab29,34,35,36. Vi optimerad villkoren selektivt för de tetramers som anges i detta protokoll och innehöll inte PKI eller ytterligare Abs. Optimala förutsättningar har dock för några andra tetramer, justeras individuellt. När det gäller sällsynta populationer, kan tetramer färgning behöva kombineras med magnetisk anrikning11.
För att underlätta och validera FACS analys av tetramer färgning, bör negativa och positiva kontroller inkluderas. Som en negativ kontroll fläcken vi alltid celler av en naiv mus av samma stam med våra tetramer sevärdheter. Alternativt kan prover färgas med tetramers med irrelevanta peptider, men med den samma fluorokrom som tetramer sevärdheter. Sådana kontroller är nödvändiga för att utesluta falska positiva signaler, e.g., med ursprung från döende celler. Utöver detta rekommenderas att inkludera en live/dead fläck, såsom propidium jodid (PI). Detta är särskilt viktigt om cellerna inte färgas direkt efter isolering. En annan strategi för att ta bort autofluorescens bakgrund kan vara att inkludera flera icke-T-cells markörer i en kanal. Genom att utesluta celler positiva i denna kanal, kan icke-T-cell populationer uteslutas. Som positiv kontroll, kan ett prov från en OT-1 mus användas för OVA tetramer, t.ex. För andra tetramers, detta måste väljas individuellt (e.g., prov från en mus, vilken var immuniserats flera gånger). Både andra37, vi också iaktta en down-förordning av CD8 receptorn under CTL aktivering på dag 7 av effektor T-cellssvar. För att undvika förlust av aktiverade tetramer+ effektor T-celler, vi rekommenderar därför för att inkludera delåg CD8-cellerna i analysen (åtminstone om mätning i effektor fas).
Kvaliteten och mängden information som man kan hämta från detta protokoll är beroende av kunskap om antigenen som studeras, tillgänglighet och specificitet tetramer och kvaliteten på FACS maskinen (antal lasrar och tillgängliga detektorer). Om arbetar med djur prover, är variation i immunsvaret naturliga och oundvikliga. Därför, för att få meningsfulla resultat från tetramer färgning, minst 3 – 5 djur bör analyseras. Om har gjort det ger i protokollet som beskrivs här tillförlitliga och reproducerbara resultat (föredömliga resultatet från ett experiment kan hittas i Kompletterande tabell 1). Som tidigare nämnts, denna metod passar perfekt att kvantifiera fenotyp och antigen-specificitet CD8+ T cells (figur 3, 4; Kompletterande bild 1), inte bara i musen men också hos människor. Dock för att analysera CD8 functions+ T cell effector, såsom granzym-inducerad celldöd, ICS eller ELISpot behöver utföras. Man ska dock hålla i åtanke att T-cells funktion, mätt som in vitro-stimulering inte kan representera den faktiska situationen i vivo. In vivo en suppressiv miljö kan hindra T cellfunktioner som mäts in vitro.
På egen hand, tetramer färgning ger inte alla information, men det utvecklats till att bli en viktig metod att karakterisera T-cell svar och kvantifiera T cell delmängder in vitro i en mycket känslig sätt38. Tetramers kan inte bara användas för att kvantifiera vissa grupper, men också för att isolera dessa39, lokalisera dem genom in situ hybridisering19,20 och studera låg affinitet antigener, såsom tumör-associerad40, 41. sedan upptäckten av tetramer teknik4, tetramer färgning har blivit ett viktigt verktyg i T-cell analys och utbudet av applikationer.
Disclosures
Dorothee von Laer är en uppfinnare av VSV-GP och innehar minoritetens aktier i bioteknikföretaget ViraTherapeutics GmbH, som innehar de immateriella rättigheterna för VSV-GP. För andra författarna finns inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Projektet finansierades av FWF österrikiska Science Fund (projektnummer P 25499-B13) och EU: s Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogrammet under bevilja avtal nr 681032. Följande reagens erhölls genom NIH Tetramer Core Facility: klass I MHC Tetramer för vesikulär stomatit virus nucleoprotein (RGYVYQGL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
| Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
| Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
| Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
| Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
| Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
| Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
| Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
| Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
| Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
| Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
| Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
| Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
| Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
| 12.5 mL Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
| Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
| Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
| FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
| PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
| Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
| Sodium azide | Roth | K305.1 | |
| PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
| Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
| FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
| PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
| APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
| OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
| VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
| EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
| LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
| HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |
References
- Tober, R., et al. VSV-GP: a potent viral vaccine vector that boosts the immune response upon repeated applications. Journal of virology. 88 (9), 4897-4907 (2014).
- Muik, A., et al. Re-engineering vesicular stomatitis virus to abrogate neurotoxicity, circumvent humoral immunity, and enhance oncolytic potency. Cancer Reseaerch. 74 (13), 3567-3578 (2014).
- Eales, L. J., Farrant, J., Helbert, M., Pinching, A. J. Peripheral blood dendritic cells in persons with AIDS and AIDS related complex: loss of high intensity class II antigen expression and function. Clinical and Experimental Immunology. 71, 423-427 (1988).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Tetramers and Monomers. , Available from: https://www.mblintl.com/products/research/monomer-tetramers/filter/product_type/monomer,peptide,tetramer (2016).
- NIH Tetramer Core Facility. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/ (2010).
- Class I MHC Tetramer Preparation: Overview. , Available from: http://tetramer.yerkes.emory.edu/support/protocols (2010).
- Wolfl, M., et al. Quantitation of MHC tetramer-positive cells from whole blood: evaluation of a single-platform, six-parameter flow cytometric method. Cytometry A. 57 (2), 120-130 (2004).
- Burrows, S. R., et al. Peptide-MHC class I tetrameric complexes display exquisite ligand specificity. The Journal of Immunology. 165 (11), 6229-6234 (2000).
- Sims, S., Willberg, C., Klenerman, P. MHC-peptide tetramers for the analysis of antigen-specific T cells. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 765-774 (2010).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. The Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Xie, Y., et al. A novel T cell-based vaccine capable of stimulating long-term functional CTL memory against B16 melanoma via CD40L signaling. Cellular & Molecular Immunology. 10 (1), 72-77 (2013).
- Nanjundappa, R. H., Wang, R., Xie, Y., Umeshappa, C. S., Xiang, J. Novel CD8+ T cell-based vaccine stimulates Gp120-specific CTL responses leading to therapeutic and long-term immunity in transgenic HLA-A2 mice. Vaccine. 30 (24), 3519-3525 (2012).
- Bowers, E. V., Horvath, J. J., Bond, J. E., Cianciolo, G. J., Pizzo, S. V. Antigen delivery by alpha(2)-macroglobulin enhances the cytotoxic T lymphocyte response. Journal of Leukocyte Biology. 86 (2), 1259-1268 (2009).
- Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. The Journal of Immunology. 88 (20), 12006-12016 (2014).
- Sakai, K., et al. Dendritic cell-based immunotherapy targeting Wilms' tumor 1 in patients with recurrent malignant glioma. Journal of Neurosurgery. 123 (4), 989-997 (2015).
- Rosaely, C. G., et al. Immune responses to WT1 in patients with AML or MDS after chemotherapy and allogeneic stem cell transplantation. International Journal of Cancer. 138 (7), 1792-1801 (2016).
- Shane, H. L., Reagin, K. L., Klonowski, K. D. The Respiratory Environment Diverts the Development of Antiviral Memory CD8 T Cells. The Journal of Immunology. , (2018).
- Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. The Journal of Visualized Experiments. (127), e56130 (2017).
- De Vries, I. J. M., et al. In situ detection of antigen-specific T cells in cryo-sections using MHC class I tetramers after dendritic cell vaccination of melanoma patients. Cancer Immunology Immunotherapy. 56 (10), 1667-1676 (2007).
- Tan, H. X., et al. Induction of vaginal-resident HIV-specific CD8 T cells with mucosal prime-boost immunization. Mucosal Immunology. , (2017).
- Huang, H., et al. CD8(+) T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), (2017).
- Hensel, M. T., et al. Selective Expression of CCR10 and CXCR3 by Circulating Human Herpes Simplex Virus-Specific CD8 T Cells. Journal of Virology. 91 (19), (2017).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- ACK Lysis Buffer. , Available from: http://www.cshprotocols.cshlp.org/content/2014/11/pdb.rec083295.short (2014).
- San Jose, E., Borroto, A., Niedergang, F., Alcover, A., Alarcon, B. Triggering the TCR complex causes the downregulation of nonengaged receptors by a signal transduction-dependent mechanism. Immunity. 12 (2), 161-170 (2000).
- Dietrich, J., Hou, X., Wegener, A. M., Geisler, C. CD3 gamma contains a phosphoserine-dependent di-leucine motif involved in down-regulation of the T cell receptor. EMBO Journal. 13 (9), 2156-2166 (1994).
- Schone, D., et al. Immunodominance of Adenovirus-Derived CD8(+) T Cell Epitopes Interferes with the Induction of Transgene-Specific Immunity in Adenovirus-Based Immunization. Journal of Virology. 91 (20), (2017).
- Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide–MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
- Whelan, J. A., et al. Specificity of CTL Interactions with Peptide-MHC Class I Tetrameric Complexes Is Temperature Dependent. The Journal of Immunology. 163 (8), 4342-4348 (1999).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide–MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
- Denkberg, G., Cohen, C. J., Reiter, Y. Critical role for CD8 in binding of MHC tetramers to TCR: CD8 antibodies block specific binding of human tumor-specific MHC-peptide tetramers to TCR. The Journal of Immunology. 167 (1), 270-276 (2001).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. The Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 335-346 (2000).
- Tungatt, K., et al. Antibody stabilization of peptide-MHC multimers reveals functional T cells bearing extremely low-affinity TCRs. The Journal of Immunology. 194 (1), 463-474 (2015).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. Journal of Immunological Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Rius, C., et al. Peptide-MHC Class I Tetramers Can Fail To Detect Relevant Functional T Cell Clonotypes and Underestimate Antigen-Reactive T Cell Populations. The Journal of Immunology. 200 (7), 2263-2279 (2018).
- Xiao, Z., Mescher, M. F., Jameson, S. C. Detuning CD8 T cells: down-regulation of CD8 expression, tetramer binding, and response during CTL activation. The Journal of Experimental Medicine. 204 (11), 2667-2677 (2007).
- McMichael, A. J., O'Callaghan, C. A. A New Look at T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 187 (9), 1367-1371 (1998).
- Hunsucker, S. A., et al. Peptide/MHC tetramer-based sorting of CD8(+) T cells to a leukemia antigen yields clonotypes drawn nonspecifically from an underlying restricted repertoire. Cancer Immunology Research. 3 (3), 228-235 (2015).
- Pittet, M. J., et al. Ex vivo analysis of tumor antigen specific CD8+ T cell responses using MHC/peptide tetramers in cancer patients. International Immunopharmacology. 1 (7), 1235-1247 (2001).
- Cohen, C. J., et al. Isolation of neoantigen-specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3981-3991 (2015).
