Здесь мы представляем протокол для формирования липидных бислоев с помощью метода бислой контакт пузырь. Воду пузырь выдувается в среде органического растворителя, whereby монослоя образуется в интерфейсе вода масло. Два пипетки манипулируют для закрепления пузыри, чтобы сформировать бислоя.
Липидных бислоев обеспечивают уникальный экспериментальной платформы для функциональных исследований ионных каналов, позволяя изучение взаимодействия канала мембраны под различные мембраны липидной композиции. Среди них капелька интерфейс бислой приобрел популярность; Однако размер большой мембрана препятствует запись низкой электрической фоновый шум. Мы создали контактную пузырь бислой (НБР) метод, который сочетает в себе преимущества планарных липидного бислоя и патч зажим методы, такие как способность варьировать состав липидов и манипулировать бислой механика, соответственно. С помощью установки для обычных патч зажим экспериментов, CBB-основе может быть легко эксперименты. Вкратце раствор электролита в стеклянной пипетки выдувается в органических растворителей фазу (гексадекан), и пипетки давление поддерживается для получения размер стабильным пузырька. Пузыря выстлана спонтанно липидов монослоя (чистый липидов или смешанной липидов), которая предоставляется от липосомы в пузырьки. Далее двух картонных монослоя пузыри (~ 50 мкм в диаметре) на кончике стеклянной пипетки прикрепляются для формирования бислоя. Введение восстановленный канал липосомы в пузырь приводит к включению каналов в бислой, позволяя для текущей записи Одноканальный с соотношением сигнал шум сравнима с патч зажим записей. Легко образуются общеиспользуемые с асимметричной липидный состав. CBB неоднократно обновляется путем выдува предыдущих пузыри и формирования новых. Различные химические и физические возмущения (например, мембраны перфузии и бислой напряженности) может быть наложен на общеиспользуемые. здесь, мы представляем основные процедуры для формирования CBB.
Для ионных каналов клеточной мембраны является не просто вспомогательные материалы, но партнером для создания потока ионов. Функционально мембрана является электрических изоляторов, в которых ион внедряются каналы, и установленные с отдыха мембранного потенциала всех клеточных мембран. Условно произвольные мембранного потенциала был введен с внешней цепи, в которой была измерена электрического тока через каналы. Эта количественная оценка ионного потока на различных мембранных потенциалов выявлены молекулярные свойства этих каналов, таких как их ионоселективного проникновение и шлюзовые функций1,2. Мембрана платформа для функциональных исследований ионных каналов является клеточной мембраны или липидного бислоя мембраны. Исторически одноканальный электрические текущей записи были впервые исполнена в липидных бислоев3,4, и соответствующие методы были разработаны для клеточных мембран, например метод патч зажим (рис. 1A )5,6. С тех пор эти две технологии развивались отдельно для разных целей (рис. 1)7,8.
Бислоя мембран и мембранных липидов в настоящее время находятся в центре внимания исследований для их роли в поддержке структуры и функции белков канала. Таким образом доступность методов варьировать состав липидов в бислоев пользуется большим спросом. Липидного бислоя формирования методы, такие как Вселенский липидного бислоя (ПРБ)8,9,10,11, капельки воды в нефти бислой12и капелька интерфейс бислой (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , общий выбор, обеспечивая возможность для изучения каналов при различных липидной композиции20 19 методов (рис. 1). Хотя технически гораздо легче, чем обычные PLB DIB, большой размер DIB создала дестимулирующее воздействие на патч фиксаторы применить его для изучения текущей записи Одноканальный с обычного размера проводимости (< 100 Л.с.).
Чтобы обойти фоновый шум, области бислой должны быть минимизированы. Этот вопрос напоминает повторения истории в разработке электрофизиологических методов липидных бислоев (рис. 1). В первые дни малогабаритные бислой (1-30 мкм в диаметре) был сформирован в наконечник пипетки (Подсказка цинкования метод; Рисунок 1 C) 21 , 22 , 23, а не с помощью свободностоящая бислой (~ 100 мкм в диаметре) на гидрофобной перегородки в камере (рис. 1Б). Подсказка цинкования метод для электрических измерений с гораздо ниже фонового шума24. Наш опыт с25,26ПРБ, подсказка цинкования22,,2327и патч зажим28,29,30, 31 методы привели нас к роман идея формирования липидных бислоев, используя принципы бислой воды в нефти. Мы говорили это как контакт пузырь бислой (НБР) метод20,32. В этом методе, а не висит капли воды в масляной фазы (рис. 1D), воду пузырь выдувается из стеклянной пипетки (с наконечник диаметром около 30 мкм) в масляной фазы (Рисунок 1E и 2), где пузырь поддерживается постоянное давление. Однослойная формы самостоятельно в интерфейсе вода масло на поверхности пузыря. Затем два пузыри закреплены посредством манипулирования две стеклянные пипетки и бислой образуется два монослои приближаемся друг друга, давая площадью бислой равновесия. Размер пузыря контролируется интра пузырь давления (холдинг давления), а также размер бислоя. Часто используется средний диаметр 50 мкм. Хотя объем пузырь мал (< 100 pL), он подключен к больший объем пипетки решения, которое находится в диапазоне микролитр, составляющие основная фаза электролита.
Есть много преимуществ для использования метода CBB (Таблица 1). Как метод формирования бислой липидов мембраны различных липидной композиции могут быть изготовлены, и асимметричной мембраны являются более легко сформированные32 , чем обычные складные метод33. Бислоя могут управляться механически, в отличие от обычных ПРБ, который только может быть изогнут с гидростатического давления разница34,35. Изменяя давление Холдинг, пузырьки расширить или сжать, приводит к увеличению или уменьшению мембраны напряженности32. Бислой механически съемный в монослои, похож на замораживание перелом техника36,37 мембран в морфологических исследований, но с CBB, маневр позволяет для многократного отсоединения и присоединения циклов32 . Небольшой объем раствора электролита внутри пузыря позволяет эффективное слияние в бислой восстановленный канал липосом, и вероятность получения канала записи намного выше, чем с обычными PLB техникой. Объем маленький пузырь также позволяет быстрое перфузии (в ~ 20 мс) раз еще инъекцию пипеткой вставляется в любой из пузырьков. В отличие от метода патча зажим после сломанной, CBB мембрана вновь формируется сразу и неоднократно, и пипетки может использоваться несколько раз в день. Объединяя преимущества патч зажим и ПРБ методов, CBB обеспечивает универсальная платформа для физико-химических условий мембраны, учитывая беспрецедентный исследования взаимодействий канала мембраны.
Прежде чем представить подробный протокол процесса формирования CBB, физико-химический фон бислой формирования представлена первая, которая будет полезна для патч фиксаторы для разрешения экспериментальной трудности, связанные с формирования мембраны которые встречаются.
CBB эксперименты распространять уроки химии поверхности науки38. CBB похож на мыльный пузырь ветром из соломы в воздух, где аналогичным образом, воду пузырь выдувается в органическом растворителе. Один будет заметить, что воду пузырь надувается вряд ли когда липиды мембран не включаются в пузырь воде или органических растворителях. В отсутствие амфифильными липиды поверхностное натяжение в водно нефтяных интерфейс высок, и давление внутри пузырь для дуть пузырь будет высоким. Это реализация уравнения Лапласа (ΔP = 2 γ/R, где ΔP давление внутри пузырь, γ-это поверхностное натяжение, и R-радиус пузырь). При высокой концентрации липидов в органические фазы или раствор электролита плотность липидов в монослое увеличивается, как продиктовано изотермы адсорбции Гиббс (-dγ = Γя dµя, где это Γ,я поверхности избыток соединения и µ,я это химический потенциал компонента i)39, ведущего к нижней поверхностное натяжение и легкость формирования пузыря. CBB бислоя могут наблюдаться от тангенциальный угол (рис. 2), в угол контакта между монослоя и бислой поддается измерению. Этот угол представляет равновесие между surface tensions монослоя и бислой (молодые уравнение: γbi = γ cos(θ)МО , где γБи бислой напряженность, γМО -это однослойная напряженность, и θ угол контакта). Изменения в угол контакта указывают изменения в бислой напряженности, учитывая, что напряженность монослоя оценивается от изменений в угол контакта как функция мембранного потенциала (молодые-Lippmann уравнение: γmo = Cm V2 /4 (cos (0θ) – cos (θv)), где Cm является емкость мембраны, V мембранного потенциала, и θ0 и θv — контактные углы на 0 и В МВ, соответственно)40,41 ,42. Когда два пузырьки являются достаточно близко, они подходят друг другу спонтанно. Это объясняется ван дер Ваальса силы, и мы можем визуально наблюдать этот динамичный процесс в формировании CBB.
CBB система состоит из отдельных этапов: а именно, массовых масляной фазы, вода пузыри, покрытые монослоя и контактирующих бислой (рис. 3). Они напоминают несколько фаз, наблюдаемые в Ипр, например вокруг этапа бислоя и тонких органических фазы, зажатая двумя монослои43,44Тора, содержащих растворители. В CBB фазы монослоя непрерывный с бислой листовку, и липидные молекулы легко распространять между монослоя и листовки. Фазы монослоя охватывает большую часть поверхности пузыря, составляющих важный этап, который служит водохранилище липидов. Потому что гидрофобные хвост липидов в монослое распространяется наружу масляной фазы массового, бислой интерьер или гидрофобные core открывает масляной фазы массового. Таким образом гидрофобное вещество вводят в масляной фазы рядом бислой возможность легко получить доступ к бислой интерьер. Это техника перфузии мембраны, мы разработали недавно45, в которой состав липидов в бислой меняется быстро (в секунду) в один канал текущей записи. Мы обнаружили, что содержание холестерина в бислой может контролироваться обратимо путем переключения холестерина перфузии и выключать45. В том случае, если концентрации соответствующего вещества в монослое и бислой отличается, градиент концентрации соответствующего вещества немедленно расторгается путем диффузии, который известен как эффект Марангони46, 47. с другой стороны, Вьетнамки через монослои являются медленными48,,4950.
С помощью метода CBB, бислой формируется под универсальный физико-химических условий, таких как электролит рН, как низко как 1 51, концентрация соли (+K, Na+, и т.д.) до 3 М, мембранный потенциал как высокий как ±400 МВ и системы температуре до 60 ° C.
Есть несколько вариантов для формирования CBB и включения канала молекул нем. Для формирования монослоя на интерфейсе вода масло липиды добавляются либо в среде органического растворителя (липидов out метода; Рисунок 4 A, 4 C) или в пузырь как липосомы (липидов в метод; Рисунок 4 B, 4 D). В частности липидов в метод позволяет для формирования асимметричной мембраны15,32. Канал молекул растворим в растворе (например, канал формирование пептиды) напрямую добавляются в пузырь (рис. 4A, B)52,53, тогда как источник белков воссоздана в липосомы, которые затем добавляются в пузырь (рис. 4C, D). Здесь формирование общеиспользуемые методом липидов в для любой канал пептида (polytheonamide B (ПТБ); Рисунок 4 A) или показано белок (КГГА калия канал, рис. 4C).
CBB метод формирования липидного бислоя основан на принципе капельку воды в нефти, облицованная монослоя20. Технически процедуры для формирования общеиспользуемые легко, особенно для фиксации исследователей, которые владеют в манипулировании стекла micropipettes. Электрофизиол?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Марико Yamatake и Масако Такасима для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана в части, KAKENHI Грант насчитывает 16H, 00759 и 17 H 04017 (так).
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) | Sigma-Aldrich | P3644 | |
A/D Converter | Molecular Divices | Digidata1550A | |
Ag/AgCl electrode | Warner Instruments | 64-1317 | |
Bath Sonicator | Branson | M1800H-J | |
Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
Glass Capillary | Harvard Apparatus | 30-0062 | |
Hepes | Dojindo | 342-01375 | |
Hole Slideglass | Matsunami Glass | S339929 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX73 | |
Isolation Table | Herz | TDI-86LA(Y)2 | |
Micro Injenctor | Narishige | IM-11-2 | |
Micro Manipulator | Narishige | EMM | |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Micropipette holder | |||
n-Hexadecane | Nacalai | 07819-32 | |
Patch-Clamp Amplifier | HEKA | EPC800 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-87 | |
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine ) |
Avanti Polar Lipids | 850757 | |
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) | Avanti Polar Lipids | 840457 | |
Potassium Chloride | Nacalai | 28514-75 | |
Rotary Evapolator | Iwaki | REN-1000 | |
Succinic Acid | Nacalai | 32402-05 | |
Vacuum Pump | Buchi | V-100 |