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Biochemistry

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/58952
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Cellular Protein Chemistry, Utrecht University, 2Program in Cellular and Molecular Medicine, Boston Children's Hospital

Summary

यहाँ हम एक सामान्य पल्स-चेस विधि है कि तह, परिवहन के काइनेटिक विश्लेषण की अनुमति देता है के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, और प्रोटीन की गिरावट जीवित कोशिकाओं में पालन किया जाना है ।

Abstract

रेडियोधर्मी पल्स-चेस लेबलिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जो अपने कार्यात्मक सेलुलर स्थान के लिए परिवहन, और जीवित कोशिकाओं में लक्ष्य प्रोटीन की गिरावट का अध्ययन करने के लिए । लघु (पल्स) radiolabeling बार (< 30 मिनट) और कसकर नियंत्रित चेस बार का उपयोग करके, यह कुल प्रोटीन पूल का केवल एक छोटा सा अंश लेबल और इसके तह का पालन करने के लिए संभव है । जब एसडीएस-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) और immunoprecipitation के साथ (अनुरूपण-विशिष्ट) एंटीबॉडी को कम करने के साथ संयुक्त, तह प्रक्रियाओं महान विस्तार में जांच की जा सकती है । इस प्रणाली में घुलनशील प्रोटीन, एकल और बहु-पास transmembrane प्रोटीन, भारी एन और ओ-ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन, और प्रोटीन के साथ और व्यापक डाइसल्फ़ाइड के बिना गुणों में एक विशाल भिन्नता के साथ प्रोटीन की तह का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है संबंध. पल्स-चेस तरीकों अतिरिक्त सुविधाओं की एक सीमा में काइनेटिक अध्ययन के आधार हैं, सह और posttranslational संशोधनों, oligomerization, और बहुलकीकरण सहित, अनिवार्य रूप से जंम से मृत्यु तक एक प्रोटीन के विश्लेषण की अनुमति । नाड़ी-चेस प्रोटीन तह पर अध्ययन वृद्धि हुई लौकिक संकल्प और शारीरिक जानकारी प्रदान करके इन विट्रो में प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अंय जैव रासायनिक और भौतिक तरीकों के साथ पूरक हैं । इस समाचार पत्र के भीतर वर्णित तरीकों को आसानी से अनुकूलित कर रहे है लगभग किसी भी प्रोटीन है कि स्तनधारी या कीट-कोशिका प्रणालियों में व्यक्त किया जा सकता है की तह का अध्ययन ।

Introduction

यहां तक कि अपेक्षाकृत सरल प्रोटीन की तह कई अलग तह एंजाइमों, आणविक chaperones, और आबंध संशोधनों1शामिल है । इन विट्रो में प्रक्रियाओं का एक पूरा पुनर्गठन व्यावहारिक रूप से असंभव है, शामिल विभिंन घटकों की विशाल संख्या दी । यह अत्यधिक वांछनीय है, इसलिए, vivo मेंप्रोटीन तह अध्ययन करने के लिए, जीवित कोशिकाओं में । रेडियोधर्मी पल्स-चेस तकनीक संश्लेषण, तह, परिवहन, और उनके प्राकृतिक वातावरण में प्रोटीन के क्षरण का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित ।

३५S-लेबल methionine/cysteine के साथ एक छोटी नाड़ी के दौरान प्रोटीन के चयापचय लेबलिंग, एक रेडियोधर्मी लेबल के अभाव में एक पीछा द्वारा पीछा किया, व्यापक सेलुलर वातावरण में नव संश्लेषित प्रोटीन की आबादी के विशिष्ट ट्रैकिंग की अनुमति देता है । फिर, लक्ष्य प्रोटीन immunoprecipitation के माध्यम से अलग किया जा सकता है और एसडीएस के माध्यम से विश्लेषण-पृष्ठ या अंय तकनीकों । कई प्रोटीन के लिए, सेल के माध्यम से उनकी यात्रा एसडीएस-पृष्ठ जेल पर दिखाई दे रहे हैं कि संशोधनों के द्वारा चिह्नित है । उदाहरण के लिए, endoplasmic जालिका (ईआर) से Golgi परिसर में ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन का परिवहन अक्सर N-लिंक्ड glycans के संशोधनों के साथ होता है या ओ-लिंक्ड glycans2,3के अलावा । इन संशोधनों के कारण स्पष्ट आणविक द्रव्यमान में बड़ी वृद्धि होती है, जो एसडीएस में गतिशीलता परिवर्तन द्वारा देखा जा सकता है-पृष्ठ. परिपक्वता भी proteolytic दरारें द्वारा चिह्नित किया जा सकता है, जैसे सिग्नल पेप्टाइड दरार या समर्थक के हटाने पेप्टाइड्स, स्पष्ट आणविक द्रव्यमान है कि आसानी से एसडीएस पर पीछा किया जा सकता में परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप-पृष्ठ जेल4. रेडियोधर्मिता जैसे cycloheximide चेस, जहां उपंयास प्रोटीन संश्लेषण रोका जाता है के रूप में तुलनीय तकनीक पर काफी लाभ है, के रूप में अब उपचार कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे है और पुराने के बहुमत से बाहर नहीं है, स्थिर राज्य प्रोटीन से विश्लेषण, के रूप में कुछ प्रोटीन है आधा दिनों की रहती है । दोनों और कम करने की स्थिति के तहत प्रोटीन की तुलना डाइसल्फ़ाइड बांड गठन के विश्लेषण की अनुमति देता है, कई स्रावी प्रोटीन की तह में एक महत्वपूर्ण कदम4,5,6, 7.

यहां हम प्रोटीन तह और बरकरार कोशिकाओं में परिवहन के विश्लेषण के लिए एक सामांय विधि का वर्णन, एक रेडियोधर्मी पल्स-चेस दृष्टिकोण का उपयोग कर । जब तक हम के रूप में संभव के रूप में विस्तृत विधि प्रदान करने का उद्देश्य है, प्रोटोकॉल अनुकूलन क्षमता के लिए एक लगभग असीम संभावना है और अनुकूलन प्रत्येक पाठक विशिष्ट प्रोटीन का अध्ययन करने की अनुमति होगी ।

दो वैकल्पिक पल्स चेस प्रोटोकॉल, अनुयाई कोशिकाओं के लिए एक (यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के चरण १.१) और निलंबन कोशिकाओं के लिए एक (यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के चरण १.२) प्रदान की जाती हैं । यहां उपलब्ध कराई गई शर्तों को उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के माध्यम से व्यक्त एक प्रोटीन कल्पना करने के लिए पर्याप्त हैं । यदि पाठक खराब व्यक्त प्रोटीन या विभिन्न posttreatment स्थितियों, जैसे कई immunoprecipitations के साथ काम कर रहा है, यह उचित रूप से पकवान आकार या सेल संख्या में वृद्धि करने के लिए आवश्यक है ।

निलंबन पल्स चेस के लिए, हर समय बिंदु पर लिया चेस नमूने सभी कोशिकाओं की एक ट्यूब से लिया जाता है । नाड़ी के बाद धो चरण छोड़ दिए जाते हैं; इसके बजाय, ३५एस के आगे निगमन unlabel्ड methionine और cysteine की एक उच्च अतिरिक्त के साथ कमजोर पड़ने से रोका जाता है ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल रेडियोधर्मी ३५एस का उपयोग करें-लेबल cysteine और methionine सेलुलर प्रोटीन तह प्रक्रियाओं का पालन करें । रेडियोधर्मी एजेंट के साथ सभी आपरेशनों के ऑपरेटर और रेडियोधर्मी विकिरण के लिए पर्यावरण के किसी भी जोखिम को कम करने और एक नामित प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा करने के लिए उपयुक्त सुरक्षात्मक उपायों का उपयोग किया जाना चाहिए । पल्स-चेस लेबलिंग तकनीक के रूप में कम पल्स बार में अपेक्षाकृत अक्षम है (< 15 मिनट), रेडियोधर्मिता के प्रारंभिक राशि के कम से 1% नव संश्लेषित प्रोटीन में शामिल किया गया है. immunoprecipitation के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन के संवर्धन के बाद, एसडीएस के लिए नमूना पृष्ठ रेडियोधर्मिता की प्रारंभिक राशि के कम से ०.०५% होता है ।

हालांकि ३५एस methionine और cysteine लेबलिंग मिश्रण स्थिर है, कुछ अपघटन, अस्थिर रेडियोधर्मी यौगिकों उपज, हो जाएगा । शोधकर्ता और तंत्र की रक्षा के लिए कुछ सावधानियां बरती जानी चाहिए । शोधकर्ता हमेशा स्थानीय विकिरण सुरक्षा नियमों का पालन करना चाहिए और एक प्रयोगशाला कोट और (डबल) दस्ताने के अलावा एक चारकोल नर्सिंग मास्क, पहन सकते हैं । ३५एस methionine और cysteine के साथ शेयर शीशियों हमेशा एक धुएं डाकू में खोला जाना चाहिए, या एक स्थानीय आकांक्षा बिंदु के तहत । ज्ञात प्रयोगशाला प्रदूषित धब्बे केंद्रापसारक, पिपेट, पानी स्नान, मशीन, और शेखर हैं । इन क्षेत्रों के संदूषण एक लकड़ी का कोयला फिल्टर के साथ पिपेट सुझावों का उपयोग करके कम है, सकारात्मक मुहर microcentrifuge ट्यूबों ( सामग्री की तालिकादेखें), पानी स्नान में मछलीघर लकड़ी का कोयला स्पंज, चारकोल फिल्टर कागज नाड़ी में चिपके-चेस व्यंजन, आकांक्षा प्रणाली में लकड़ी का कोयला गार्ड, और बर्तन और मशीन और भंडारण कंटेनरों में लकड़ी का कोयला युक्त अनाज की नियुक्ति ।

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Protocol

सभी रेडियोधर्मी एजेंट और प्रक्रियाओं स्थानीय Utrecht विश्वविद्यालय विकिरण नियमों और विनियमों के अनुसार संभाला गया था ।

1. पल्स चेस

  1. अनुयाई कोशिकाओं के लिए पल्स चेस
    नोट: यहां दिए गए वॉल्यूम ६० mm सेल कल्चर डिश पर आधारित हैं । ३५ मिमी या १०० मिमी व्यंजन के लिए, क्रमशः 1/2 या 2 द्वारा खंड गुणा । इस प्रोटोकॉल 0, 15, 30, ६०, १२०, और २४० मिनट की 10 मिनट और चेस टाइंस के एक पल्स समय का उपयोग करता है । ये विशिष्ट प्रोटीन के आधार पर विभिंन जा सकता है (नीचे चर्चा) का अध्ययन किया जा रहा है ।
    1. बीज अनुयाई कोशिकाओं (जैसे, HEK २९३, हेला, चो) में ६ ६० mm सेल संस्कृति व्यंजन है कि वे subconfluent जाएगा (८०%-९०%) पल्स चेस के दिन । समय बिंदु और/या शर्त प्रति कम से कम एक डिश का प्रयोग करें ।
    2. यदि आवश्यक हो, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक रिएजेंट के साथ कक्षों को transfect; या, वायरल transduce8 कोशिकाओं 1 दिन पल्स से पहले-चेस प्रयोग अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त निर्माण के साथ ।
    3. धोने बफर के 2 मिलीलीटर के साथ बर्तन धोने (हांक के संतुलित नमक समाधान [HBSS]), भुखमरी मध्यम (सामांय संस्कृति मध्यम कमी methionine और cysteine और भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS], जैसे ंयूनतम आवश्यक माध्यम [मेम] methionine और cysteine के बिना के 2 मिलीलीटर जोड़ें लेकिन 10 मिमी HEPES, पीएच ७.४) के साथ, और 5% CO2 के साथ एक ३७ ° c humidified मशीन में पकवान 15 मिनट के लिए जगह है ।
    4. एक गर्म ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रैक के लिए बर्तन स्थानांतरण इतना है कि वे पानी के संपर्क में हैं, लेकिन नाव नहीं है । कोई टाइमर प्रारंभ करें ।
    5. ४० s पर, भुखमरी मध्यम महाप्राण, ऊपर ६०० पल्स समाधान के µ एल ड्रा (भुखमरी मीडिया + ५५ µ ci/35 मिमी डिश लेबल, पिपेट में कदम 1.1.1) पिछले नोट देखें, और यह बिल्कुल 1 मिनट में पकवान के केंद्र को धीरे से जोड़ें । t के लिए 1 मिनट अंतराल पर इस चरण को दोहराएँ वह शेष व्यंजन । अपने प्रयोग के दौरान समय बचाने के लिए सबसे लंबे चेस नमूने के साथ शुरू करो ।
      नोट: जब रेडियोधर्मी सामग्री हैंडलिंग, यह उचित सावधानियों और स्थानीय नियमों और विनियमों का पालन करने के लिए आवश्यक है आकस्मिक जोखिम और/
    6. वास्तव में 11 मिनट और सभी निंनलिखित व्यंजन के लिए, 0 मिनट चेस नमूना को छोड़कर, के लिए पीछा मध्यम के 2 मिलीलीटर सीधे पकवान, महाप्राण, और फिर से जोड़ने के लिए, चेस मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें । शेष व्यंजन के लिए 1 मिनट अंतराल पर इस चरण को दोहराएँ । एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए सभी व्यंजन स्थानांतरण ।
    7. ठीक 16 मिनट में, 2 मिलीलीटर का पीछा मध्यम (सामांय संस्कृति मध्यम + 10 mm HEPES [pH ७.४], 5 mm cysteine, और 5 mm methionine) सीधे 0 न्यूनतम नमूना डिश के लिए पल्स माध्यम के शीर्ष पर लेबलिंग बंद करने के लिए जोड़ें; फिर, महाप्राण तुरंत, एक ठंडा एल्यूमीनियम प्लेट के लिए पकवान हस्तांतरण, और बर्फ के 2 मिलीलीटर-ठंडा रोक बफर जोड़ें (HBSS + 20 मिमी N-ethylmaleimide [NEM]) ।
      नोट: यह 0 मिनट चेस नमूना है । इस नमूने के लिए, चरण 1.1.9 करने के लिए सीधे आगे बढ़ें ।
    8. प्रत्येक चेस समय से पहले पानी स्नान 2 मिनट के लिए एक चेस डिश वापस हस्तांतरण (जैसे, एक 15 मिनट का पीछा के लिए 24 मिनट) और, सटीक चेस समय (जैसे, एक 15 मिनट का पीछा करने के लिए 26 मिनट), महाप्राण चेस मीडिया (या एक microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण अगर निंनलिखित पीआर otein स्राव) और एक ठंडा एल्यूमीनियम थाली के लिए पकवान हस्तांतरण । बर्फ के 2 मिलीलीटर-ठंड रोक बफर जोड़ें ।
    9. ≥ 5 मिनट के लिए बंद बफर में बर्फ पर सभी व्यंजन मशीन; फिर, महाप्राण रोकें समाधान और बर्फ के 2 मिलीलीटर ठंड बंद समाधान के साथ धो लो । महाप्राण ६०० µ के साथ धोने और लाइसे व्यंजन lysis बफर के एल (फास्फेट-बफर खारा [पंजाबियों] + nondenaturing डिटर्जेंट [ सामग्री की तालिकादेखें] + चिढ़ाना अवरोधों + 20 मिमी NEM) । यह सुनिश्चित करने के लिए कि व्यंजन मात्रात्मक रूप से लीजड ड हैं, एक सेल खुरचनी का उपयोग करें ।
    10. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए lysate स्थानांतरण और १५,००० पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक-२०,००० x जी और 4 डिग्री सेल्सियस नाभिक गोली ।
  2. निलंबन कोशिकाओं के लिए पल्स चेस
    नोट: कुशल लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए, कोशिकाओं को 3 x 106 से 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर स्पंदित किया जाना चाहिए, और चेस मात्रा 4x पल्स मात्रा होना चाहिए । निम्नलिखित उदाहरण में, हम 10 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर की एक मात्रा में 5 x 106 कोशिकाओं स्पंदित, पांच चेस समय अंक (0, 15, 30, ६०, और १२० मिनट) 1 मिलीलीटर की उपज के लिए, जिसमें 1 एक्स 106 कोशिकाओं के प्रति समय बिंदु । सभी समाधान अनुभाग १.१ में समान हैं ।
    1. कल्चर को पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल9 के अनुसार सस्पेंशन सेल (उदा., 3T3, Jurkat) किया जाता है ताकि प्रयोग के समय पर्याप्त संख्या में सेल हो सके, कम से 1 x 106 सेल प्रति समय बिंदु और/
    2. यदि आवश्यक हो, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक रिएजेंट के साथ transfect कोशिकाओं, या वायरल transduce8 कोशिकाओं 1 दिन पल्स चेस प्रयोग से पहले अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त निर्माण के साथ ।
    3. 5 मिनट के लिए एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में हालत प्रति 106 कोशिकाओं के कमरे के तापमान पर २५० x g पर गोली, उन्हें 5 भुखमरी मीडिया के मिलीलीटर के साथ 1x धो, उंहें फिर से गोली, और उंहें भुखमरी मीडिया के 1 मिलीलीटर में resuspend ।
    4. एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और 10-25 मिनट के लिए उन्हें गर्मी के लिए आंदोलन ट्यूबों हर 10-15 मिनट के नीचे बसने से रोकने के लिए कोशिकाओं.
    5. टाइमर प्रारंभ करें । बिल्कुल 1 मिनट में, जोड़ें २७५ µ ci (५५ µ सीआई/1 एक्स 106 कोशिकाओं) पतला लेबल की कोशिकाओं और भंवर मिश्रण करने के लिए सीधे युक्त ।
      नोट: जब रेडियोधर्मी सामग्री हैंडलिंग, यह उचित सावधानियों और स्थानीय नियमों और विनियमों का पालन करने के लिए आवश्यक है आकस्मिक जोखिम और/
    6. बिल्कुल 11 मिनट में, चेस मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़कर लेबलिंग बंद करो । मिश्रण नमूना और तुरंत बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर हस्तांतरण, बर्फ ठंड बंद समाधान के 9 मिलीलीटर युक्त ।
      नोट: यह 0 मिनट चेस नमूना है ।
    7. प्रत्येक क्रमिक समय बिंदु के लिए इन चरणों को दोहराएँ । एक बार सभी समय अंक एकत्र कर रहे हैं, 4 डिग्री सेल्सियस पर २५० x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं गोली । महाप्राण मध्यम (या यह एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण अगर प्रोटीन स्राव निंनलिखित) । बंद करो समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो और 4 डिग्री सेल्सियस पर २५० x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं गोली ।
    8. महाप्राण बंद करो समाधान, पूरी तरह से लाइसे बर्फ ठंडा lysis बफर के ३०० µ एल के साथ कोशिकाओं को और बर्फ पर 20 मिनट के लिए उंहें एक पूरा lysis सुनिश्चित करने के लिए गर्मी । एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए lysate स्थानांतरण और १५,००० पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक-२०,००० एक्स जी 4 डिग्री सेल्सियस पर नाभिक गोली ।

2. Immunoprecipitation

  1. गठबंधन एंटीबॉडी (चर्चा देखें) और immunoprecipitation मोतियों की ५० µ l (जैसे, प्रोटीन ए-Sepharose) (10% निलंबन [v/v] lysis बफर में + ०.२५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन [BSA]) एक microcentrifuge ट्यूब में और एक शेखर में ~ 30 मिनट के लिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  2. कमरे के तापमान पर १२,००० x g पर 1 मिनट के लिए मोतियों की गोली और supernatant महाप्राण । जोड़ने के लिए lysate के २०० µ एल एंटीबॉडी-मनका मिश्रण और 4 ° c में 1 h या सिर पर सिर के लिए एक शेखर में मशीन अगर immunoprecipitation > 1 एच की आवश्यकता है ।
  3. कमरे के तापमान पर १२,००० x g पर 1 मिनट के लिए मोतियों की गोली । महाप्राण supernatant और immunoprecipitation वॉश बफ़र की 1 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक शेखर में नमूना प्लेस ।
  4. चरण २.३ में वर्णित के रूप में मोतियों की गोली और धो 1x दोहराने । उसके बाद, supernatant को महाप्राण और ते के 20 µ l में मोतियों को resuspend करें बफर, pH ६.८ (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA). भंवरी ने नमूने लिए ।
  5. कम करने के एजेंट के बिना 2x नमूना बफर के 20 µ एल जोड़ें, यह भंवर, यह 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, और भंवर फिर से ।
    नोट: यदि केवल नमूने को कम करने की तैयारी, ५०० mM डीटीटी के 2 µ एल इस बिंदु पर जोड़ा जाना चाहिए । उसके बाद, चरण २.७ के लिए आगे बढ़ें ।
  6. चरण २.३ में वर्णित के रूप में मोतियों की गोली । ५०० मिमी डीटीटी के 1 µ एल युक्त एक ताजा microcentrifuge ट्यूब को कम supernatant के 19 µ एल स्थानांतरण, नमूना केंद्रापसारक, और यह 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर फिर से हीटिंग से पहले भंवर ।
  7. १२,००० x gपर 1 मिनट के लिए नमूना नीचे स्पिन; यह कम नमूना है । यह कमरे के तापमान के लिए नीचे ठंडा और 1 मीटर NEM के १.१ µ एल जोड़ने के लिए दोनों कम और कम नमूना । भंवर और नमूनों नीचे स्पिन ।

3. एसडीएस-PAGE

  1. सबसे पहले, ब्याज की प्रोटीन के लिए उपयुक्त एसडीएस-पृष्ठ संपति जेल प्रतिशत का निर्धारण । उदाहरण के लिए, एचआईवी-1 gp120, जब deglycosylated, पर चलाता है ~ ६० केडीए और एक ७.५% जेल में विश्लेषण किया है ।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार TEMED के बिना संपति जेल मिश्रण तैयार करें (x% acrylamide, ३७५ मिमी Tris-एचसीएल [pH ८.८,] ०.१% एसडीएस [w/v], और ०.०५% अमोनियम persulfate [एपीएस] [डब्ल्यू/वी]) और > 15 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत degas । जबकि जेल मिश्रण degassing है, अच्छी तरह से ७०% इथेनॉल और एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतकों के साथ जेल ग्लास प्लेटें साफ और उंहें एक कास्टिंग उपकरण में जगह है ।
  3. TEMED को हल करने के लिए जेल मिश्रण जोड़ें (०.००५% के अंतिम एकाग्रता में [v/v]), अच्छी तरह से मिश्रण है, और ग्लास प्लेटों के बीच पिपेट, जा ~ १.५ सेमी स्टैकिंग जेल के लिए स्थान । ध्यान से जेल के ओवरले ज2हे या isopropanol और polymerize के लिए छोड़ दें ।
  4. एक बार संपति जेल पॉलिमर है, स्टैकिंग जेल मिश्रण तैयार (4% acrylamide, १२५ mM Tris-HCl [pH ६.८], ०.१% एसडीएस [w/v], और ०.०२५% ए पी एस [डब्ल्यू/वी]) ।
  5. निस्तब्धता एच2ओ के साथ संपति जेल के ऊपर फ्लश और, फिर, सभी पानी निकाल दें ।
    नोट: अंतिम बूंदों को निकालने के लिए फ़िल्टर काग़ज़ का उपयोग करें ।
  6. स्टैकिंग जेल मिश्रण करने के लिए TEMED जोड़ें (०.००५% [v/v]), अच्छी तरह से मिश्रण, और जेल स्टैकिंग के साथ संपति जेल ओवरले और एक 15-अच्छी तरह से कंघी डालें । एक बार स्टैकिंग जेल बहुलक है, यह एक चल रहे कक्ष के लिए स्थानांतरण और बफर चल (25 मिमी Tris-एचसीएल, १९२ mm glycine [पीएच ८.३], और ०.१% एसडीएस [डब्ल्यू/वी]) के साथ ऊपरी और निचले कक्षों को भरने ।
  7. एक 15-लेन minigel में नमूना प्रति लेन के 10 µ एल लोड । जेल पर पहले और अंतिम लेन में नमूनों लदान से बचें और बैंड के मुस्कुराते को रोकने के लिए सभी खाली गलियों में बहुत ही देर नमूना बफर लोड । जैल को लगातार एक 25 mA/जब तक डाई सामने जेल के नीचे है जेल चलाते हैं ।
  8. जैल को शीशे की प्लेटों से निकाल लें, दाग प्रोटीन के साथ जैल-धुंधला समाधान (10% एसिटिक एसिड और एच2में 30% मेथनॉल O + ०.२५% प्रतिभाशाली नीले R250 [w/v]) आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए, और फिर, दाग के साथ 30 मिनट के लिए दाग समाधान (धुंधला शानदार ब्लू R250 बिना समाधान) ।
  9. जैल एक प्लास्टिक लपेटो पर चेहरे नीचे की व्यवस्था और, फिर, उनमें से शीर्ष पर ०.४ mm क्रोमैटोग्राफी कागज जगह है । जेल सैंडविच क्रोमैटोग्राफी कागज साइड एक जेल ड्रायर पर नीचे रखें । निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, जैल को ८० डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सुखाएं ।
  10. एक कैसेट के लिए सूख जैल स्थानांतरण और autoradiography फिल्म या फास्फोरस स्क्रीन के साथ उन्हें ओवरले । यदि autoradiography फिल्म का उपयोग कर, यह कदम एक अंधेरे कमरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

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Representative Results

तह और एक अनुयाई पल्स चेस से एचआईवी-1 gp120 के स्राव चित्रा 2में दिखाया गया है । (संख्या में NR) जेल gp120 की ऑक्सीडेटिव तह दिखाता है । तुरंत 5 मिनट के पल्स लेबलिंग के बाद (0 मिन चेस) gp120 एक फैलाना जेल में उच्च बैंड के रूप में प्रकट होता है, और पीछा प्रगति के रूप में, बैंड भी अधिक फैलाना तह मध्यवर्ती के माध्यम से जेल नीचे स्थानांतरित कर (यह) जब तक यह तंग बैंड में जमा (NT) कि natively जोड़ gp120 का प्रतिनिधित्व करता है । यह डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन के रूप में होता है प्रोटीन की संकुचितता बढ़ जाती है, यह पूरी तरह से कम प्रोटीन की तुलना में तेजी से स्थानांतरित करने के लिए कारण । कम करने पर जेल (आंकड़ा में आर कोशिकाओं), सभी रूपों पर डाइसल्फ़ाइड बांड इस तरह कम किया गया है कि, सभी चेस समय पर, वे गतिशीलता को प्रभावित नहीं करते । यह अंय संशोधनों के विश्लेषण की अनुमति देता है । आरयू से आर सी के लिए समय पर बदलाव gp120 के posttranslational संकेत-पेप्टाइड दरार का प्रतिनिधित्व करता है: गतिशीलता संकेत पेप्टाइड के नुकसान की वजह से बढ़ जाती है, जो पीछा के दौरान बढ़ जाती है के रूप में अधिक प्रोटीन देशी गुना पाने के लिए और उनके संकेत पेप्टाइड खोना. दोनों और कम करने वाले जेल पर, संकेत gp120 के स्राव के कारण ~ 1 ज आगे से कम करने के लिए शुरू होता है । इससे मीडिया (आंकड़ा में मध्यम) का विश्लेषण करके निगरानी की जा सकती है । गैर-डाइसल्फ़ाइड और कम करने वाले जैल की तुलना एक बांड परिवर्तन और संकेत-पेप्टाइड हटाने को उजागर करता है । यह केवल संभव था क्योंकि एक और संशोधन, N-लिंक्ड glycosylation, और glycan संशोधनों, gp120 से हटा दिया गया था (और विश्लेषण) endoglycosidase H के साथ पाचन द्वारा बस से पहले एसडीएस-पृष्ठ ।

एक सस्पेंशन पल्स चेस से immunoglobulin मीटर (आईजीएम) की µ भारी चेन की तस्करी चित्रा 3में दिखाया गया है । एचसीईर से एचसीGolgi समय के साथ एक पारी में ईर से µ चैन की तस्करी का प्रतिनिधित्व करता है Golgi, जो कोशिका से स्राव से पहले होता है. आणविक द्रव्यमान में यह परिवर्तन Golgi में एन-लिंक्ड glycans के संशोधन के कारण होता है.

Figure 1
चित्रा 1 : पल्स चेस, immunoprecipitation, और एसडीएस-पृष्ठ के लिए प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : तह और एचआईवी के स्राव-1 gp120, अनुयाई पल्स चेस द्वारा निर्धारित । एचआईवी-1 gp120 व्यक्त हेला कोशिकाओं के Subconfluent ६० mm व्यंजन 10 मिनट के लिए लेबल पल्स थे और संकेत दिया समय के लिए पीछा किया । gp120 के immunoprecipitation के बाद, नमूने deglycosylated और ७.५% एसडीएस-पृष्ठ जेल का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । IT = तह मध्यवर्ती; NT = मूल gp120; Ru = कम सिग्नल-पेप्टाइड-uncleav gp120; आर सी = कम सिग्नल-पेप्टाइड-सट gp120; नृ: = न R = कम करना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 : आईजीएम की भारी श्रृंखला के नलए, निलंबन पल्स चेस द्वारा निर्धारित । 5 x 106 I. 29 µ+ बी कोशिकाओं 5 मिनट के लिए लेबल नाड़ी थे और संकेत दिया समय के लिए पीछा किया । immunoprecipitation के बाद, नमूने एक 10% एसडीएस-पृष्ठ जेल का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । HC = immunoglobulin µ भारी शृंखला; LC = immunoglobulin हल्की श्रृंखला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

पल्स-चेस विधियों बरकरार कोशिकाओं में प्रोटीन तह के वैज्ञानिकों की समझ विकसित करने के लिए आवश्यक हो गया है । जब तक हम एक तरीका है कि संभव के रूप में सामांय है प्रदान करने का प्रयास किया है, इस दृष्टिकोण लगभग असीम बदलाव के लिए क्षमता के लिए विभिंन प्रक्रियाओं है कि तह के दौरान हो, परिवहन, और कोशिका के अंदर प्रोटीन के जीवन का अध्ययन किया है ।

जब व्यंजन में अनुयाई कोशिकाओं का उपयोग कर एक पल्स चेस प्रदर्शन, यह प्रत्येक डिश के रूप में जितना संभव हो उतना इलाज के लिए आवश्यक है, के रूप में एक अलग पकवान हर समय बिंदु के लिए प्रयोग किया जाता है और एक प्रयोग में/ विशेष रूप से लघु पल्स और चेस टाइंस (< 5 मिनट) के लिए, यह नाड़ी और चेस टाइंस (एक डिजिटल टाइमर के साथ) पर एक तंग नियंत्रण बनाए रखने के लिए आवश्यक है । पल्स पीछा निलंबन कोशिकाओं के साथ सभी नमूनों एक ट्यूब से लिया जाता है के रूप में इस परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद कर सकते हैं. के रूप में कुछ कोशिका प्रकार दूसरों की तुलना में संस्कृति व्यंजन को कम अच्छी तरह से पालन, देखभाल के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को दूर विभिंन माध्यम परिवर्तन के दौरान धोया नहीं कर रहे है लिया जाना चाहिए । यह या तो निलंबन में इन कोशिकाओं का उपयोग करके या पाली के साथ व्यंजन कोटिंग द्वारा दूर किया जा सकता-L lysine या जिलेटिन, उदाहरण के लिए, संस्कृति व्यंजन के लिए कोशिकाओं का पालन करने के लिए. व्यंजन के बीच लेबलिंग के reproducibility को मापने के लिए, lysate का एक नमूना समान कुल लेबलिंग और प्रोटीन पैटर्न के लिए सभी नमूनों की जांच करने के लिए एसडीएस-PAGE द्वारा जांच की जानी चाहिए । वैकल्पिक रूप से, lysates की तरल जुटाना गिनती कुल गिनती-प्रति मिनट (सीपीएम) शामिल स्थापित करेगा, लेकिन लेबल प्रोटीन जनसंख्या के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करेगा ।

यदि एक लक्ष्य प्रोटीन लेबल खराब, संकेत कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि (या व्यंजन) के बजाय लेबल की मात्रा में वृद्धि से बढ़ जाती है । लंबी नाड़ी समय एक विकल्प है जब अध्ययन प्रक्रिया के कैनेटीक्स इस अनुमति देगा है । आदर्श पल्स समय अभिव्यक्ति स्तर के रूप में कारकों के कारण प्रत्येक लक्ष्य के साथ भिन्न हो जाएगा, प्रतिलेखन दर, methionines की संख्या/cysteines, और प्रोटीन की तह दर. इस तरह, प्रयोग के रूप में प्रायोगिक उद्देश्य ध्यान में रखते हुए प्रत्येक प्रयोग में उपर्युक्त कारकों के बीच सबसे अच्छा संतुलन का निर्धारण किया जाना चाहिए । अगर तह के दौरान मध्यवर्ती अध्ययन किया जा रहा है, उदाहरण के लिए, यह संभव के रूप में छोटे एक समय के रूप में संभव के रूप में एक खुलासा राज्य के करीब के रूप में शुरू सामग्री है, जबकि अभिव्यक्ति का स्तर संतुलन के लिए लेबल पल्स करने के लिए वांछनीय है । वैकल्पिक रूप से, यदि परिवहन या एक प्रोटीन का क्षरण अध्ययन का लक्ष्य है, पल्स बार काइनेटिक जानकारी समझौता किए बिना संभव संकेत के उच्चतम स्तर प्रदान करने के लिए लंबा हो सकता है. सामांय में, पल्स टाइंस 2-15 मिनट से लेकर जब संशोधन के बिना इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं । पिछले प्रयोग5 कुल प्रोटीन पूल में रेडियोधर्मिता के शामिल होने से पहले नाड़ी के बाद ~ 10 एस के एक अंतराल समय का प्रदर्शन किया है; पल्स-चेस प्रयोगों से काइनेटिक जानकारी प्राप्त करते समय इस बात को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है. कम पल्स टाइंस के लिए (< 2 मिनट), पूरे पल्स समय के दौरान पानी के स्नान पर सभी व्यंजन रखें । यदि विस्तारित पल्स बार (> 1 एच) इस्तेमाल किया जा रहा है, यह पल्स के दौरान एक झूली कुरसी पर १.५ बार और जगह व्यंजन द्वारा पल्स मात्रा बढ़ाने के लिए सलाह दी जाती है के लिए बाहर सुखाने से बर्तन को रोकने के लिए । जबकि लेबल युक्त समाधान व्यक्तिगत ३५S-methionine/cysteine या मिश्रण उपलब्ध हैं, मिश्रण भी पसंद है जब प्रोटीन है कि केवल methionine या cysteine होते है लेबल किया जा रहा है के रूप में दोनों सामांय प्रोटीन संश्लेषण को बनाए रखने की जरूरत है कक्ष में । यदि प्रयोगात्मक शर्तों विशिष्ट methionine/cysteine लेबलिंग की आवश्यकता होती है, नाड़ी के दौरान रेडियोधर्मी methionine/cysteine के स्तर तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ।

चेस टाइंस (और समय अंक की संख्या) एक समान फैशन में निर्धारित कर रहे हैं । एक अच्छा प्रारंभिक जगह के लिए पहले चेस समय निर्धारित (0 मिनट पीछा के बाद) के रूप में पल्स समय के बराबर है और है, तो, डबल एक बार लगातार समय बिंदु के लिए समय की लंबाई (जैसे, 5, 10, 20, और ४० मिनट) । हालांकि, यह प्रत्येक विशिष्ट प्रोटीन और सवाल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

भुखमरी से तनाव प्रतिक्रियाओं के सक्रियकरण को रोकने के लिए (जो प्रोटीन संश्लेषण और तह को प्रभावित कर सकते हैं), आदर्श रूप में, कुछ unlabel्ड methionine और cysteine भुखमरी और radiolabeling समाधान करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए । मात्रा सेल लाइन पर निर्भर करेगा, लेबलिंग समय, radiolabel उपयोग की मात्रा, और मीडिया संस्करणों, और परीक्षण की आवश्यकता होगी । एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु सेल संस्कृति माध्यम में मौजूद cysteine और methionine की मात्रा का 1% है, जो बढ़ती नाड़ी समय के साथ बढ़ाया जा सकता है । भुखमरी अवधि, चाहे के साथ या बिना लेबल अमीनो एसिड, 15-30 मिनट की सीमा में रखा जाना चाहिए पर्याप्त लेबल शामिल करने और तनाव प्रतिक्रियाओं के सक्रियकरण को रोकने के लिए । जब एक विस्तारित पल्स (≥ 1 ज) का उपयोग कर, भुखमरी की आवश्यकता नहीं है ।

lysis बफर यहां वर्णित अधिकांश प्रयोजनों के लिए उपयुक्त हो जाएगा, लेकिन सिद्धांत रूप में, किसी भी बफर प्रणाली, जैसे HEPES, Tris, या एमईएस, काम करेंगे । डिटर्जेंट लाइसे कोशिकाओं की जरूरत एकाग्रता कोशिकाओं और डिटर्जेंट की मात्रा की संख्या पर निर्भर करेगा । एकाग्रता हमेशा क्रिटिकल micelle एकाग्रता (सीएमसी) और लाइसे कोशिकाओं के लिए पर्याप्त डिटर्जेंट की मात्रा से ऊपर होना चाहिए । अंगूठे का एक अनुभवजंय नियम है कि ०.५% nondenaturing डिटर्जेंट की २०० µ एल ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए सेल के समकक्ष लाइसे के लिए पर्याप्त है ~ 1 प्रोटीन के मिलीग्राम (~ 1 x 106 कोशिकाओं) । नमक एकाग्रता और डिटर्जेंट भी आवेदन के अनुसार विविध किया जा सकता है, लेकिन सामांय तौर पर, खुले नाभिक (उच्च नमक, > 0.1% एसडीएस) तोड़ने की स्थिति के रूप में मुक्त डीएनए की उपस्थिति immunoprecipitation के साथ हस्तक्षेप करेगा बचा जाना चाहिए । यदि इस से बचा नहीं जा सकता है, उदाहरण के लिए, जब नाभिक या छर्रों प्रोटीन सहित पूरा सेल lysates विश्लेषण की जरूरत है, डीएनए immunoprecipitation से पहले एक छोटी गेज सुई के माध्यम से कोशिकाओं गुजर द्वारा कतरनी किया जा सकता है । अत्यधिक फोम और रेडियोधर्मी एयरोसोल्स के उत्पादन को रोकने के लिए इतना के रूप में यह sonication से अधिक पसंद है ।

immunoprecipitation के लिए, दोनों एंटीबॉडी के इष्टतम मात्रा और प्रत्येक एंटीबॉडी-प्रतिजन संयोजन के लिए सबसे अच्छा धोने बफर अच्छी तरह से वांछित प्रतिजन संकेत और पृष्ठभूमि के बीच एक संतुलन को प्राप्त करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । एंटीबॉडी हमेशा मात्रात्मक immunoprecipitation सुनिश्चित करने के लिए एंटीजन से अधिक में मौजूद होना चाहिए; एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु एक ३५ mm पकवान/1 x 106 कोशिकाओं से immunoprecipitation प्रति एंटीबॉडी के 1 µ जी है । डिटर्जेंट या नमक की सांद्रता बढ़ाने से बैकग्राउंड में कमी आ सकती है । विशेष रूप से, ≤ ०.१% एसडीएस के अलावा बहुत पृष्ठभूमि को कम करने के लिए मदद कर सकते हैं, लेकिन भी एंटीबॉडी-antigen सहभागिता को बाधित कर सकता है । immunoprecipitation के दौरान एंटीबॉडी की विशिष्टता के लिए नियंत्रित करने के लिए, समान कोशिकाओं लक्ष्य प्रोटीन की कमी जब उपलब्ध इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यदि यह सीधा नहीं है, जैसे जब अंतर्जात प्रोटीन का विश्लेषण किया जा रहा है, तो अधिक से अधिक व्यक्त या प्रतिजन की कमी काम करेगा । पृष्ठभूमि (और विशिष्टता) के लिए नियंत्रण करने के लिए, या तो प्रतिरक्षित सीरा (जहां संभव हो) या isotype नियंत्रण का उपयोग किया जाना चाहिए । immunoprecipitation मोतियों को सीधे बाध्यकारी एंटीजन के लिए नियंत्रण करने के लिए, एंटीबॉडी के बिना मोतियों का भी इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यहां उपलब्ध कराई गई शर्तों के रूप में एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में माना जाना चाहिए प्रत्येक एंटीबॉडी-antigen जोड़ी दोनों धोने बफ़र और वाश शर्तों का अनुकूलन की आवश्यकता होगी । बहुत अधिक पृष्ठभूमि के मामले में, धोने की संख्या में वृद्धि नहीं बल्कि धोने और/या धोने बफर की संरचना का समय है । यदि विशेष रूप से संवेदनशील coimmunoprecipitations के रूप में इस तरह के साथ निपटा जाना है, यह 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी धो कदम बाहर ले जाने के लिए बेहतर हो सकता है, बर्फ ठंड buffers का उपयोग कर ।

निलंबन कोशिकाओं पर अनुयाई कोशिकाओं का एक लाभ यह है कि दवा उपचार पल्स चेस के दौरान वस्तुतः किसी भी बिंदु पर प्रदर्शन किया जा सकता है । यदि निगरानी अवरोधकों के साथ प्रयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, यह एक तह प्रक्रिया के सह बनाम posttranslational चरणों पर अपने प्रभाव अंतर करने के लिए संभव है । इस lysis और immunoprecipitation धोने बफ़र्स (ऊपर चर्चा) तह10,11,12के दौरान प्रोटीन निगरानी परिसरों के coimmunoprecipitation की अनुमति के लिए अनुकूल द्वारा बढ़ाया जा सकता है ।

नमूनों के postlysis उपचार को संबोधित किया जा सकता है कि सवालों का दायरा चौड़ा होगा । सीमित immunoprecipitation से पहले लक्ष्य प्रोटीन के पाचन को छेड़ो अतिरिक्त गठन की जानकारी प्रदान करेगा और सफलतापूर्वक प्रोटीन की तह पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से उन डाइसल्फ़ाइड बांडों की कमी13, 14. प्रोटीन एकत्रीकरण और जटिल गठन सुक्रोज घनत्व-ढाल केंद्रापसारक से पहले immunoprecipitation15,16से निगरानी की जा सकती है ।

पल्स चेस का पूरा लाभ लेने के लिए, उच्च गुणवत्ता वाले रिएजेंट की उपलब्धता immunoprecipitations के लिए आवश्यक है । जब तह मध्यवर्ती की जांच, यह एंटीबॉडी है कि विश्लेषण के तहत प्रोटीन के सभी रूपों नीचे खींचने में सक्षम है आवश्यक है । यदि लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं, इस संबंध टैग का उपयोग करके प्रतिस्थापित किया जा सकता है । हालांकि, इस तरह के सीमित प्रोटियोलिसिस के रूप में postlysis तरीकों की उपयोगिता को गंभीर रूप से प्रतिबंधित, सीधे प्रोटीन अनुरूप जांच करने के लिए, के रूप में केवल टैग टुकड़े बरामद किया जा सकता है ।

पल्स पीछा की संवेदनशीलता प्रश्न में प्रोटीन में methionine और cysteine अवशेषों की संख्या तक सीमित है । कम अभिव्यक्ति स्तर के साथ मिलकर methionine/cysteine अवशेषों की कम संख्या के साथ प्रोटीन-नाड़ी चेस प्रयोगों में undetect हैं । जब postlysis संशोधन जैसे सीमित प्रोटियोलिसिस के प्रदर्शन, केवल methionine/cysteine-युक्त अंशों का पता लगाना होगा ।

समाप्त करने के लिए, काइनेटिक विस्तार दिया है कि पल्स पीछा प्रदान करते हैं, वे कई अंय तकनीकों और स्थिर राज्य स्तर पर आणविक कोशिका जीवविज्ञान अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों के पूरक हैं । जैसे, वे आणविक जीवविज्ञानी toolbox में एक अमूल्य घटक होना जारी है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक Braakman लैब, अतीत और वर्तमान के सभी सदस्यों को धंयवाद, उनके उपयोगी विचार विमर्श के लिए और इस लेख में प्रस्तुत तरीकों के विकास में मदद करते हैं । इस परियोजना को यूरोपीय संघ के सातवें ढांचे के कार्यक्रम (FP7/2007-2013) एन ° २३५६४९ और नीदरलैंड संगठन के वैज्ञानिक अनुसंधान (NWO) के तहत दोनों यूरोपीय अनुसंधान परिषद से धन प्राप्त हुआ है इको-प्रोग्राम N ° 711.012.008 के अंतर्गत ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes Sarstedt 72.706.400
Acetic Acid Sigma A6283 glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm GE Life Sciences 28956475
Bromophenol Blue Sigma B8026 Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films Kodak Z350370-50EA
Cell-culture media Various N/A Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine Various N/A Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper Whatman 1872047
Charcoal filtered pipette tips Molecular bioproducts 5069B
Charcoal vacu-guard Whatman 67221001
Coomassie Brilliant Blue R250 Sigma 112,553 for electrophoresis
Cysteine Sigma C7352 Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 
Dithiothreitol (DTT) Sigma 10197777001 Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix Perkin Elmer NEG772014MC Other size batches of label are available depending on useage
EDTA Sigma E1644 Molecular biology grade
Gel-drying equipment Various N/A
Glycerol Sigma G5516 Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper GE Life Sciences 3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 24020117
Kimwipes delicate task wipes VWR 21905-026
MES Sigma  M3671 Molecular biology grade
Methanol Sigma MX0490 
Methionine Sigma M5308 Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment Various N/A
NaCl Sigma S7653 Molecular biology grade
N-ethylmaleimide Sigma E3876 Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS Sigma P5368 Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads GE health-care 17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L3771 Molecular biology grade
Triton X-100 Sigma T8787 Molecular biology grade
Trizma base (Tris) Sigma T6066 Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager Amersham 29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath Nalgene 5970-0320PK

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References

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जैव रसायन अंक १४४ प्रोटीन तह radiolabeling एसडीएस-PAGE immunoprecipitation पल्स चेस संरचना विश्लेषण कैनेटीक्स
प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण
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McCaul, N., Yeoh, H. Y., van… More

McCaul, N., Yeoh, H. Y., van Zadelhoff, G., Lodder, N., Kleizen, B., Braakman, I. Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase. J. Vis. Exp. (144), e58952, doi:10.3791/58952 (2019).

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