Summary
Her beskriver vi en protokol for en generel pulse-chase metode, der tillader kinetic analyse af folde-, transport- og nedbrydning af proteiner skal følges i levende celler.
Abstract
Radioaktive pulse-chase mærkning er et kraftfuldt værktøj til at studere en konformationel modning, transport til deres funktionelle cellular placering, og nedbrydningen af mål proteiner i levende celler. Ved hjælp af kort (puls) radiolabeling gange (< 30 min) og stramt kontrolleret chase gange, det er muligt at mærke kun en lille brøkdel af det samlede proteinindhold pool og følge dens foldning. Når det kombineres med nonreducing/reducere SDS-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og immunoprecipitation med (kropsbygning-specifikke) antistoffer, kan folde processer blive undersøgt i stor detalje. Dette system er blevet brugt til at analysere folde proteiner med en enorm variation i egenskaber som opløselige proteiner, enkelt og multi-pass transmembrane proteiner, stærkt N og O glykosyleret proteiner, og proteiner med og uden omfattende disulfid limning. Puls-chase metoder er grundlaget for kinetiske undersøgelser i en række ekstra funktioner, herunder co og posttranslationelle modifikationer, oligomerisering og polymerisation, hovedsagelig giver mulighed for analyse af et protein fra fødsel til død. Puls-chase undersøgelser på proteinfoldning supplerer med andre biokemiske og biofysiske metoder til at studere proteiner i vitro ved at give øget tidsmæssige opløsning og fysiologiske oplysninger. Metoder som beskrevet i denne hvidbog er let tilpasses studere foldning af næsten enhver protein, der kan udtrykkes i pattedyr eller insekt-celle systemer.
Introduction
Foldning af selv relativt simple proteiner involverer mange forskellige folde enzymer, molekylære chaperoner og kovalente ændringer1. En komplet rekonstituering af disse processer in vitro- er praktisk talt umuligt, da det store antal forskellige involverede komponenter. Det er derfor ønskeligt, at studere proteinfoldning i vivo, i levende celler. Radioaktive pulse-chase teknikker bevise et kraftfuldt værktøj til at studere den syntese, foldning, transport og nedbrydning af proteiner i deres naturlige miljø.
Den metaboliske mærkning af proteiner i løbet af en kort puls med 35S-mærket methionin/cystein, efterfulgt af en jagt i mangel af en radioaktivt mærket, giver mulighed for specifikke tracking af en population af nyligt syntetiserede proteiner i det bredere cellulære miljø. Derefter, target proteiner kan være isolerede via immunoprecipitation og analyseret via SDS-PAGE eller andre teknikker. For mange proteiner, er deres rejse gennem cellen kendetegnet ved ændringer, der er synlige på SDS-PAGE gel. For eksempel, er transport af glykosyleret proteiner fra det endoplasmatiske reticulum (ER) til Golgi kompleks ofte ledsaget af ændringer af N-knyttet glycans eller tilsætning af O-knyttet glycans2,3. Disse ændringer medføre store stigninger i den tilsyneladende molekylemasse, som kan ses af mobilitet ændringer i SDS-PAGE. Modning kan også være præget af proteolytiske splittelser, såsom signal-peptid kavalergang eller fjernelse af pro-peptider, resulterer i ændringer i den tilsyneladende molekylvægt, der let kan følges på SDS-PAGE gel4. Radioaktivitet har betydelige fordele i forhold til sammenlignelige teknikker som cycloheximide jagter, hvor romanen proteinsyntesen er forhindret, som længere behandlinger er giftigt for celler og udelukker ikke et flertal af ældre, steady-state proteiner fra de analyse, som visse proteiner har halveringstider dage. Sammenligning af proteiner under både nonreducing og reducere betingelser giver mulighed for analyse af disulfid obligation dannelse, et vigtigt skridt i foldning af mange sekretoriske proteiner4,5,6, 7.
Her beskriver vi en generel metode til analyse af proteinfoldning og transport i intakt celler, ved hjælp af et radioaktivt pulse-chase tilgang. Mens vi har til formål at give metoden som detaljeret som muligt, protokollen har en næsten ubegrænsede muligheder for tilpasningsevne og vil tillade optimering at studere hver læser specifikke proteiner.
To alternative pulse-chase protokoller, en for vedhængende celler (trin 1.1 protokollens præsenteres her) og en for suspension celler (trin 1.2 i protokollen præsenteres her) er forudsat. Betingelserne her er tilstrækkeligt til at visualisere en protein udtrykt med medium til høj udtryk niveauer. Hvis læseren arbejder med dårligt udtrykte proteiner eller forskellige posttreatment forhold, som flere immunoprecipitations, er det nødvendigt at øge parabol størrelse eller celle nummer korrekt.
For suspension puls chase, er chase prøver på hvert tidspunkt alle taget fra et enkelt rør af celler. Vask trin efter pulsen er udeladt; i stedet, yderligere indarbejdelse af 35S er forhindret ved fortynding med en høj overskud af umærket methionin og cystein.
De præsenterede protokoller bruger radioaktive 35S-mærket cystein og methionin for at følge cellulære proteinfoldning processer. Alle operationer med radioaktivt reagenser skal udføres ved hjælp af passende beskyttelsesforanstaltninger for at minimere eksponering af operatøren og miljø for radioaktiv stråling og udføres i et laboratorium, der er udpeget. Som puls-chase mærkning teknik er relativt ineffektive på kort puls gange (< 15 min), mindre end 1% af grundbeløbet for radioaktivitet er indarbejdet i de nyligt syntetiserede proteiner. Efter tilsætning af target protein via immunoprecipitation indeholder prøven for SDS-PAGE mindre end 0,05% af grundbeløbet for radioaktivitet.
Selvom 35S methionin og cystein mærkning mix er stabiliseret, vil nogle nedbrydning, fremstilling af flygtige radioaktive stoffer, opstå. For at beskytte forskeren og apparatet, bør der tages nogle forholdsregler. Forskeren bør altid adlyde de lokale stråling sikkerhedsregler og kan bære en trækul sygepleje maske, udover en lab coat og (dobbelt) handsker. Stock hætteglas med 35S methionin og cystein bør altid åbnes i et stinkskab eller under en lokal aspiration punkt. Kendt laboratorium forurening steder er centrifuger, pipetter, vandbade, væksthuse og shakers. Forureningen af disse områder er reduceret ved hjælp af pipette tips med en trækul filter, positive-seal microcentrifuge rør (Se Tabel af materialer), akvarium charcoal svampe i vand bade, trækul papirfiltre limet i puls-chase retter, trækul vagt i aspiration systemet, og placeringen af skåle, som indeholder trækul korn i væksthuse og opbevaringsbeholdere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle radioaktive reagenser og procedurer blev håndteret i overensstemmelse med lokale Utrecht Universitet stråling regler og forordninger.
1. puls Chase
-
Puls Chase for vedhængende celler
Bemærk: De mængder, der er givet her er baseret på 60 mm celle kultur retter. For 35 mm og 100 mm retter, multiplicere mængderne med 1/2 eller 2, henholdsvis. Denne protokol bruger en puls tid på 10 min og chase gange 0, 15, 30, 60, 120 og 240 min. Disse kan differentieres afhængigt af de specifikke proteiner undersøgt (behandles nedenfor).- Frø vedhængende celler (f.eks.HEK 293, HeLa, CHO) i seks 60 mm celle kultur retter, således at de vil være subconfluent (80% - 90%) på dagen for puls chase. Brug mindst en parabol pr. tidspunkt og/eller tilstand.
- Hvis det er påkrævet, transfect celler med kommercielt tilgængelige Transfektion reagenser ifølge producentens anvisninger; eller viralt transduce8 cellerne 1 dag før pulse-chase eksperimentere med passende konstruktionen til udtryk.
- Vaske op med 2 mL af wash buffer (Hanks afbalanceret saltopløsning [HBSS]), der tilsættes 2 mL af sult mellemstore (normale kultur medium mangler methionin og cystein og føtal bovint serum [FBS], som minimum afgørende medium [MEM] uden methionin og cystein men med 10 mM HEPES, pH 7,4), og Placer retterne i et 37 ° C befugtet kuvøse med 5% CO2 for 15 min.
- Overføre retterne til stativer i en forvarmet 37 ° C vandbad, så de er i kontakt med vand men ikke flyde. Start en timer.
- På 40 s, Aspirér sult medium, udarbejde 600 µL af pulse løsning (sult medier + 55 µCi/35 mm parabol label, se note foregående trin 1.1.1) i pipette, og Tilføj det forsigtigt til midten af skålen på præcis 1 min. Gentag dette trin 1 min mellemrum for t han resterende retter. Start med den længste chase prøve at spare tid under eksperimentet.
Bemærk: Ved håndtering af radioaktivt materiale, det er vigtigt at følge passende forholdsregler og lokale regler og forordninger for at forhindre utilsigtet eksponering og/eller forurening. - På præcis 11 min og for alle følgende retter, med undtagelse af 0 min chase prøven, tilsættes 2 mL af chase medium direkte til fadet, Aspirér det og igen, tilsættes 2 mL af chase medium. Gentag dette trin 1 min mellemrum for resterende retter. Overføre alle retter til en 37 ° C inkubator.
- På præcis 16 min, tilsættes 2 mL af chase medium (normal næringssubstratet + 10 mM HEPES [pH 7,4], 5 mM cystein og 5 mM methionin) direkte til 0 min prøve parabol på toppen af pulse mellemlang stop mærkning; derefter, Aspirér straks, overføre skålen til en afkølet aluminiumplade, og der tilsættes 2 mL iskold stop buffer (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]).
Bemærk: Dette er 0 min chase prøve. For dette eksempel, gå direkte til trin 1.1.9. - Overføre hver chase parabol tilbage til vandbad 2 min før hver chase tid (f.eks.24 min for en 15 min chase), og på den nøjagtige chase tid (f.eks.26 min for en 15 min chase), Aspirér chase medier (eller overføre det til et microcentrifuge rør, hvis følgende pr otein sekretion) og overføre skålen til en afkølet aluminiumplade. Der tilsættes 2 mL iskold stop buffer.
- Inkuber alle retter på is i stop buffer for ≥5 min; derefter Aspirér stopopløsning og vaske det med 2 mL iskold stopopløsning. Opsug vask og lyse retter med 600 µL af lysisbuffer (fosfatbufferet saltopløsning [PBS] + nondenaturing vaskemiddel [Se Tabel af materialer] + proteasehæmmere + 20 mM NEM). Brug en celle skraber til at sikre, at retterne er mængden kvantitativt.
- Overføre den lysate til en 1,5 mL microcentrifuge rør og centrifugeres 10 min. ved 15.000-20.000 x g og 4 ° C og pellet kerner.
-
Puls Chase for Suspension celler
Bemærk: For at sikre effektiv mærkning, celler bør være pulserende på en koncentration af 3 x 106 til 5 x 106 celler/mL, og chase diskenheder skal være 4 x puls volumen. I følgende eksempel vi pulserende 5 x 106 celler i et volumen på 1 mL i 10 min, til at give fem chase tid point (0, 15, 30, 60 og 120 min) af 1 mL, 1 x 106 celler / tidspunkt. Alle løsninger er den samme som i afsnit 1.1.- Kultur suspension celler (f.eks.3T3, Jurkat) efter en tidligere udgivne protokol9 , således at der er et tilstrækkeligt antal celler på tidspunktet for eksperimentet, mindst 1 x 106 celler pr. gang pege og/eller tilstand.
- Hvis det er påkrævet, transfect celler med kommercielt tilgængelige Transfektion reagenser ifølge fabrikantens anvisninger, eller viralt transduce8 cellerne 1 dag før pulse-chase eksperimentere med passende konstruktionen til udtryk.
- Pellet 5 x 106 celler pr. betingelse i en 50 mL tube for 5 min. ved 250 x g ved stuetemperatur, vaske dem 1 x med 5 mL af sult medier, pellet dem igen, og pelleten dem i 1 mL af sult medier.
- Overfør celler til et 37 ° C vandbad og inkuberes dem for 10-25 min. agitere rørene hver 10-15 min at forhindre celler fra at sætte sig på bunden.
- Starte timeren. På præcis 1 min, tilføje 275 µCi (55 µCi/1 x 106 celler) af ufortyndet etiketten direkte til de rør, der indeholder celler og slyng for at blande.
Bemærk: Ved håndtering af radioaktivt materiale, det er vigtigt at følge passende forholdsregler og lokale regler og forordninger for at forhindre utilsigtet eksponering og/eller forurening. - På præcis 11 min, stop mærkning ved tilsætning af 4 mL af chase medier. Proeven blandes og straks overføre 1 mL til en 15 mL tube på is, der indeholder 9 mL iskold stopopløsning.
Bemærk: Dette er 0 min chase prøve. - Gentag disse trin for hvert efterfølgende tidspunkt. Når alle tidspunkter er indsamlet, sammenpresse cellerne i 5 min. ved 250 x g ved 4 ° C. Opsug mediet (eller overføre det til en ny 15 mL tube hvis efter protein sekretion). Cellerne vaskes med 5 mL af stopopløsning og sammenpresse cellerne i 5 min. ved 250 x g ved 4 ° C.
- Opsug stop løsningen, helt lyse celler med 300 µL af iskold lysisbuffer og inkuberes dem i 20 min. på isen for at sikre en komplet lysering. Overføre den lysate til en 1,5 mL microcentrifuge rør og centrifugeres i 10 min på 15.000-20.000 x g ved 4 ° C til pellet kerner.
2. Immunoprecipitation
- Kombinere antistof (Se diskussionen) og 50 µL af immunoprecipitation perler (fx, protein A-Sepharose) (10% suspension [v/v] i lysisbuffer + 0,25% bovint serumalbumin [BSA]) i et microcentrifuge rør og inkuberes dem ved 4 ° C for ~ 30 min i en shaker.
- Pellet perler i 1 min på 12.000 x g ved stuetemperatur og Opsug supernatanten. Tilføje 200 µL af lysate til de antistof-perle blanding og inkuberes ved 4 ° C i en shaker til 1 h eller hoved-over-hovedet, hvis immunoprecipitation kræver > 1 h.
- Pellet perler i 1 min på 12.000 x g ved stuetemperatur. Opsug supernatanten og tilsættes 1 mL immunoprecipitation wash buffer. Prøven anbringes i en shaker ved stuetemperatur i 5 min.
- Pellet perler som beskrevet i trin 2.3 og Gentag vask 1 x. Derefter Aspirér supernatanten og resuspend perlerne i 20 µL af TE-buffer pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vortex prøven.
- Tilføj 20 µL af 2 x prøvebuffer uden reduktionsmiddel, vortex, varme det til 5 min. ved 95 ° C, og vortex igen.
Bemærk: Hvis der kun forberede reducerende prøver, 2 µL af 500 mM DTT skal tilføjes på dette punkt. Derefter fortsætte til trin 2.7. - Pellet perlerne, som beskrevet i trin 2.3. Overføre 19 µL nonreduced supernatant til en frisk microcentrifuge røret indeholder 1 µL af 500 mM DTT, centrifugeres den stikprøve, og vortex det før opvarmning det i 5 min. ved 95 ° C igen.
- Spin ned prøve for 1 min på 12.000 x g; Dette er den reduceret proeve. Køle det ned til stuetemperatur og tilføje 1.1 µL 1 m NEM til både den reducerede og den nonreduced prøve. Vortex og spin-ned prøverne.
3. SDS-PAGE
- Første bestemme passende SDS-PAGE løsning gel procentdelen for protein af interesse. For eksempel, HIV-1 gp120, når deglycosylated, kører på ~ 60 kDa og analyseres i en 7,5% gel.
- Forbered den løsning gel blanding uden TEMED ifølge producentens anvisninger (x % acrylamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] 0,1% SDS [w/v], og 0,05% ammonium persulfat [APS] [w/v]) og degas under vakuum for > 15 min. Mens gel blandingen afgasning, grundigt rense gel glasplader med 70% ethanol og fnugfri væv og placere dem i en casting apparater.
- Tilføj TEMED til løse gel blandingen (i en endelig koncentration på 0,005% [v/v]), blandes grundigt, og afpipetteres mellem glasplader, forlader ~1.5 cm plads til stabling gel. Omhyggeligt overlay gel med deioniseret vand H2O eller isopropanol og overlade det til at polymerisere.
- Når de løse gel har polymeriserede, forberede stabling gel blandingen (4% acrylamid, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1% SDS [w/v], og 0.025% APS [w/v]).
- Skyl toppen af den løse gel med deioniseret vand H2O, og fjern derefter alle vand.
Bemærk: Brug filtrerpapir til at fjerne de sidste dråber. - Tilføj TEMED til stabling gel blandingen (0,005% [v/v]), blandes grundigt, og overlay den løsning gel med stabling gel og indsætte en 15-godt kam. Når den stabling gel har polymeriserede, overføre det til en kørende kammer og fylde de øvre og nedre kamre med kører buffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM glycin [pH 8.3] og 0,1% SDS [w/v]).
- Indlæse 10 µL af prøven pr. vognbane i en 15-lane minigel. Undgå at indlæse prøverne i først og den sidste lane på gelen og indlæse den nonreducing prøvebuffer i alle tomme baner at forhindre smilende af bands. Kør geler på konstant en 25 mA/gel indtil farvestof front er i bunden af gelen.
- Fjern geler fra glasplader, pletten geler med protein-farvning løsning (10% eddikesyre og 30% methanol i H2O + 0,25% strålende blå R250 [w/v]) for 5 min med agitation, og derefter destain for 30 min med affarvningsopløsning (farvning løsning uden strålende blå R250).
- Arrangere geler forsiden nedad på en plastic wrap og læg 0,4 mm kromatografi papir oven på dem. Placere gel sandwich kromatografi papir-side ned på en gel tørretumbler. Efter producentens anvisninger, tørre geler i 2 timer ved 80 ° C.
- Overføre de tørrede geler til en kassette og overlay dem med Autoradiografi film eller fosfor skærm. Hvis du bruger Autoradiografi film, skal dette trin udføres i et mørkt rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Foldning og sekretion af HIV-1 gp120 fra en vedhængende puls chase er vist i figur 2. Den nonreducing gel (celler NR i figur) viser, at oxidativ foldning af gp120. Umiddelbart efter pulsen mærkning af 5 min (0 min chase) gp120 vises som en diffus band højere i gelen, og som skrider frem chase bandet vandrer ned gel gennem endnu mere diffust folde mellemprodukter (IT), indtil det ophobes i den stramme band (NT) der repræsenterer indbygget foldede gp120. Dette sker som dannelsen af svovlbroer øger kompakthed protein, får det til at overflytte hurtigere end den fuldt reduceret protein. På den reducerende gel (celler Rasmussen i tallet), blevet disulfid obligationer på alle former reduceret så på alle chase gange, de ikke påvirker mobilitet. Dette giver mulighed for analyse af andre ændringer. Skift over tid fra Ru til Rc repræsenterer posttranslationelle signal-peptid kløvningen af gp120: mobilitet øges på grund af tab af signal-peptid, som øger under jagten, som flere proteiner nå de indfødte fold og mister deres signal peptid. På både nonreducing og reducere gel begynder signalet at falde fra ~ 1 h videre som følge af udskillelsen af gp120. Dette kan kontrolleres ved at analysere media (medie i figuren). En sammenligning af de nonreducing og reducere geler afdækker disulfid obligation ændringer og signal-peptid fjernelse. Dette var kun muligt, fordi en anden ændring, N-linked glykosylering og glycan ændringer, blev fjernet fra gp120 (og analysen) ved fordøjelsen med endoglycosidase H lige før SDS-PAGE.
Handel med μ tunge kæde af immunoglobulin M (IgM) fra en suspension puls chase er vist i figur 3. Et skift over tid fra HCER at HCGolgi repræsenterer handel med µ kæden fra Skadestuen til Golgi, som står foran sekretion fra cellen. Denne ændring i molekylvægt er forårsaget af en ændring af N-forbundet glycans i Golgi.
Figur 1 : Skematisk diagram af protokollen til pulse chase, immunoprecipitation og SDS-PAGE. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Folding og sekretion af HIV-1 gp120, bestemmes af vedhængende puls chase. Subconfluent 60 mm retter fra HeLa celler udtrykker HIV-1 gp120 var puls mærket i 10 min og jaget for den angivne tid. Efter immunoprecipitation af gp120 prøverne blev deglycosylated og analyseret ved hjælp af en 7,5% SDS-PAGE gel. DET = folde mellemprodukter; NT = indfødte gp120; Ru = reduceret signal-peptid-uncleaved gp120; RC = reduceret signal-peptid-kløvet gp120; NN: = nonreducing; R = reduktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Handel med den tunge kæde af IgM, afhænger af suspension puls chase. 5 x 106 I.29 µ+ B celler var puls mærket for 5 min og jaget for den angivne tid. Efter immunoprecipitation, blev prøverne analyseret ved hjælp af en 10% SDS-PAGE gel. HC = immunoglobulin μ tunge kæde; LC = immunoglobulin lys kæde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Puls-chase metoder har været af afgørende betydning for udviklingen af forskernes forståelse af proteinfoldning i intakt celler. Mens vi har forsøgt at tilvejebringe en metode, der er så generel som muligt, har denne tilgang potentialet for næsten ubegrænsede variationer at studere forskellige processer, der opstår under folde, transport og liv af proteiner inde i cellen.
Når du udfører en puls chase med vedhængende celler i retter, er det vigtigt at behandle hvert fad, det samme så meget som muligt, som en separat skål bruges til hvert tidspunkt og/eller betingelse i et eksperiment. Især for kort puls og chase gange (< 5 min), det er afgørende at fastholde en stram kontrol over puls og chase gange (med en digital timer). Puls jagter med suspension celler kan bidrage til at reducere denne variabilitet, som alle prøver tages fra et enkelt rør. Som nogle celletyper overholde mindre godt til kultur retter end andre, udvises forsigtighed bør sikre, at cellerne ikke vaskes væk under de forskellige medium ændringer. Dette kan løses ved enten ved hjælp af disse celler i suspension eller ved belægning retter med poly-L lysin eller gelatine, for eksempel, for at overholde cellerne til kultur retter. For at måle reproducerbarhed mærkning mellem retter, undersøges en stikprøve af lysate af SDS-PAGE til at tjekke alle prøver for ens samlede mærkning og protein mønster. Alternativt, væskescintillationstælling af lysates vil nedsætte den samlede tæller pr. minut (cpm) indarbejdet men vil ikke give oplysninger om befolkningens protein mærket.
Hvis et mål protein etiketter dårligt, er signalet øget ved at øge antallet af celler (eller retter) og ikke ved at øge mængden af etiketten. Forlængelse puls tid er en mulighed, når kinetik af den undersøgte proces vil tillade dette. Den ideelle puls tid varierer med hver destination på grund af faktorer som udtryk niveau, transskription rate, antallet af methionines/cysteines og den folde sats af protein. Som sådan, eksperimenter skal være forpligtet sig til at bestemme den bedste balance mellem de ovennævnte faktorer i hvert eksperiment samtidigt med at holder den eksperimentelle formål i tankerne. Hvis mellemprodukter under folde studeres, for eksempel er det ønskeligt at pulse etiket for så kort tid som muligt at have udgangsmaterialet så tæt på en udfoldet tilstand som muligt, mens afvejning udtryk niveauer. Alternativt, hvis transport eller nedbrydning af et protein, der er målet for undersøgelsen, pulse gange kan blive forlænget for at levere de højeste niveauer af signal muligt uden at kompromittere kinetic oplysninger. I almindelighed, kan pulse gange variere fra 2-15 min, når du bruger denne protokol uden ændring. Tidligere forsøg5 har demonstreret en mellemliggende tid på ~ 10 s efter puls før inkorporering af radioaktivitet i pool, total protein; Det er vigtigt at huske på, når der følger kinetic oplysninger fra puls-chase eksperimenter. For korte puls gange (< 2 min), holde alle retter på et vandbad under hele puls tid. Hvis udvidet puls gange (> 1 h) er der anvendes, er det tilrådeligt at øge puls volumen ved 1,5 gange og placere retter på en rocker i et 37 ° C inkubator under puls til at forhindre retterne mod udtørring. Mens mærkning opløsninger indeholdende enkelte 35S-methionin/cystein eller en blanding er tilgængelige, foretrækkes mix, selv når proteiner, der kun indeholder methionin eller cystein er at være mærket, som begge er nødvendige for at opretholde generelle proteinsyntese i cellen. Hvis forsøgsbetingelser kræver specifikke methionin/cystein mærkning, skal niveauer af ikke-radioaktive methionin/cystein under pulsen justeres i overensstemmelse hermed.
Chase gange (og antallet af tiden point) bestemmes på en lignende måde. Et godt sted at begynde er at sætte chase første gang (efter 0 min chase) som svarer til tid, puls, og derefter, fordoble længden af tid for hvert efterfølgende tidspunkt (f.eks.5, 10, 20 og 40 min). Dog skal dette være optimeret til hver specifik protein og spørgsmål.
For at undgå aktivering af stress svar af sult (som kan påvirke proteinsyntesen og foldning), ideelt set, bør nogle umærkede methionin og cystein føjes til sult og radiolabeling løsninger. Mængden vil afhænge af cellelinie, mærkning tid, mængde af radiolabel anvendes og medier diskenheder, og skal teste. Et godt udgangspunkt er 1% af mængden af cystein og methionin findes i cellekulturmedium, som kan øges med stigende puls gange. Sult perioder, enten med eller uden umærkede aminosyrer, bør holdes i intervallet 15-30 min at sikre passende etiket indarbejdelse og forhindrer aktivering af stress svar. Når du bruger en udvidede puls (≥ 1 h), er sult ikke påkrævet.
Lysisbuffer beskrevet her vil være egnet til de fleste formål, men i princippet enhver buffersystem, såsom HEPES, Tris eller MES, vil arbejde. Vaskemiddel koncentrationen skulle lyse celler vil afhænge af antallet af celler og vaskemiddel volumen. Koncentrationen skal altid over den kritiske micelle koncentration (CMC) og mængde af vaskemiddel tilstrækkeligt til lyse celler. En empirisk tommelfingerregel er, at 200 µL 0,5% nondenaturing vaskemiddel (Se Tabel af materialer) er tilstrækkelig til at lyse celle svarende til ~ 1 mg protein (~ 1 x 106 celler). Saltkoncentration og rengøringsmidler kan også varieres efter anvendelsen, men i almindelighed, betingelser, bryde åbne kerner (højt saltindhold, > 0,1% SDS) bør undgås, da tilstedeværelsen af gratis DNA vil forstyrre immunoprecipitation. Hvis dette ikke kan undgås, for eksempel, når komplet cellelysater herunder kerner eller pelleted proteiner skal analyseres, kan DNA forskydes af passerer en lille gauge kanyle forud for immunoprecipitation celler. Dette er at foretrække over sonikering for at forhindre overdreven skummende og produktion af radioaktive aerosoler.
For immunoprecipitation, skal både den optimale mængde af antistoffer og den bedste wash buffer for hvert antigen-antistof kombination testes grundigt for at opnå en balance mellem den ønskede antigen signal og baggrund. Antistoffer bør altid være til stede i selvrisiko i antigener at sikre kvantitative immunoprecipitation; et godt udgangspunkt er 1 µg af antistoffer per immunoprecipitation fra en 35 mm parabol/1 x 106 celler. Baggrunden kan være nedsat ved at øge vaskemiddel eller salt koncentrationer. Især tilføjelsen af ≤0.1% SDS kan bidrage til at reducere baggrunden men kan også forstyrre antigen-antistof interaktioner. For at kontrollere for specificiteten af antistoffer under immunoprecipitation, skal identiske celler mangler target proteinet anvendes, når tilgængelig. Hvis dette ikke er ligetil, såsom når endogene proteiner er ved at blive analyseret, vil overekspression eller udtynding af antigenet arbejde. Til at styre til baggrund (og specificitet), enten preimmune sera (hvis muligt) eller isotype kontrol bør anvendes. For at kontrollere for antigener bindende direkte til immunoprecipitation perler, bør perler uden antistof også anvendes. Betingelserne her bør betragtes som et udgangspunkt, som hvert antigen-antistof par vil kræve en optimering af både wash buffer og vask betingelser. I tilfælde af for meget baggrund, ikke øge antallet af vasker men snarere tidspunktet for vask og/eller sammensætningen af wash buffer. Hvis særligt følsomme interaktioner som i coimmunoprecipitations skal behandles, kan det være at foretrække at udføre alle vask trin ved 4 ° C, ved hjælp af iskold buffere.
En fordel ved vedhængende celler i suspension celler er at narkotika behandlinger kan udføres på næsten ethvert punkt under puls chase. Hvis brugt med anstandsdame hæmmere, for eksempel, er det muligt at differentiere dens virkninger på co - versus posttranslationelle faser af en folde proces. Dette kan forlænges ved at tilpasse lysis og immunoprecipitation vask buffere (drøftet ovenfor) for at tillade coimmunoprecipitation af protein-anstandsdame komplekser under folde10,11,12.
Postlysis behandling af prøver vil udvide anvendelsesområdet for spørgsmål, der kan adresseres. Begrænset protease fordøjelsen af target proteiner inden immunoprecipitation vil give yderligere konformationelle oplysninger og held har været anvendt til at overvåge foldning af proteiner, især dem, der mangler disulfid obligationer13, 14. Protein sammenlægning og kompleks dannelse kan overvåges af saccharose tæthed-gradient centrifugering inden immunoprecipitation15,16.
For at drage fuld fordel af pulse jagter, er tilgængeligheden af høj kvalitet reagenser nødvendig for immunoprecipitations. Når du undersøger folde mellemprodukter, er det vigtigt at have antistoffer, der er i stand til at trække ned alle former for protein under analyse. Hvis specifikke antistoffer mod target proteinet ikke er tilgængelig, kan det erstattes ved hjælp af affinitet tags. Men dette alvorligt begrænser nytten af postlysis metoder, såsom den begrænset proteolyse, at direkte sonde protein kropsbygning, som kun mærket fragmenter kan inddrives.
Følsomheden af pulse jagter er begrænset af antallet af methionin og cystein restkoncentrationer i det pågældende protein. Proteiner med lavt antal methionin/cystein restkoncentrationer kombineret med en lav udtryk niveau er ikke målbart i puls-chase eksperimenter. Når du udfører postlysis ændringer såsom begrænset proteolyse, vil kun methionin/cystein-holdige fragmenter kunne påvises.
Til sidst, givet den kinetiske detalje, at pulse jagter give, de er komplementære til mange andre teknikker og værktøjer, der anvendes til at studere Molekylær cellebiologi ved steady-state niveau. Som sådan, fortsætter de med at være en uvurderlig element i molekylærbiologs værktøjskasse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke alle medlemmerne af Braakman lab, forbi og præsentere, for deres udbytterige drøftelser og hjælpe med at udvikle de metoder, der er præsenteret i denne artikel. Dette projekt har modtaget støtte fra både det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) N ° 235649 og Holland organisation for videnskabelig forskning (NWO) under ECHO-programmet N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
