Summary
ここで折りたたみ、トランスポート、および生きているセルで続かれるべき蛋白質の分解の速度論的解析を可能にする一般的なパルス追跡法のためのプロトコルについて述べる。
Abstract
放射性パルス追跡ラベル構造の成熟、彼らの機能細胞の場所、生きているセルのターゲット蛋白質の分解輸送を研究するための強力なツールです。Radiolabeling 時間 (パルス) を使用して (< 30 分) チェイス回が厳重とフォールディングに従う総蛋白プールの小さい一部分だけをラベルすることが可能です。パンピング/削減 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) と (コンホメーション特異) 抗体で免疫沈降と組み合わせると、プロセスを折りたたみは非常に詳細に調べることができます。このシステムは、分析の可溶性タンパク質、単一および複数パスの膜貫通タンパク質、大きく N と O 糖タンパク質などの性質の巨大な変化とタンパク質とタンパク質豊富なジスルフィドと折りたたみに使用されています接合。パルス追跡方法は、co、翻訳後修飾、重合と重合、基本的に誕生から死への蛋白質の分析が可能などの追加機能の範囲に速度論の根拠です。タンパク質の折り畳みのパルス追跡研究は増加の時間分解能と生理学的情報を提供することによって体外タンパク質研究のため他の生化学的および生物物理学的方法で補完されます。本稿に記載されている方法は哺乳動物または昆虫細胞システムで表現できるあらゆる蛋白質ほとんどのフォールディング研究に簡単に合わせられます。
Introduction
比較的単純なタンパク質の折り畳み多くの折り畳み式の異なる酵素、分子シャペロンと共有結合の変更1が含まれます。膨大な数に関与するさまざまなコンポーネントでは、このこれらのプロセスの in vitroの完全な再構築は実質的に不可能です。したがって、生細胞の生体内でフォールディングの研究に非常に望ましいです。放射性パルス追跡技術は、合成、折りたたみ、トランスポート、および彼らの自然環境におけるタンパク質の分解を勉強するための強力なツールを証明します。
新陳代謝35S] メチオニン ・ システインと短パルス中に蛋白質の分類、放射性ラベルのない状態でチェイスに続いて、新生タンパク質の細胞より広い環境の人口の特定の追跡ができます。ターゲット蛋白質分離を介して免疫沈降をすることができ、経由でSDS のページまたはその他の手法を分析します。多くのタンパク質の SDS ページのゲルの表示変更がセルを介して彼らの旅はマークされます。たとえば、ゴルジ体小胞体 (ER) から糖タンパク質の輸送はしばしば N リンク糖鎖の変更または o-結合糖鎖2,3の追加を伴います。これらの変更は、SDS ページの移動変化によって見ることができる明白な分子量の大きい増加を引き起こします。信号ペプチド胸の谷間などの pro-ペプチドの SDS ページのゲルの4に簡単に続くことができる分子の質量変化により除去の蛋白質分解開裂によって成熟を付けることもできます。放射能はシクロヘキシミド追うなど同等の技術でかなりのメリット新規タンパク質合成ができない長い治療細胞に有毒であるから古い、定常状態のタンパク質の大部分を排除しないと、分析、いくつかのタンパク質の半減期日があります。パンピングの両方の下で蛋白質の比較、ジスルフィド結合形成、多く分泌蛋白質4,5,6,の折り畳み過程における重要なステップの解析条件を減らすことができます7。
ここで放射性パルス追跡方法を使用してタンパク質の折り畳みとそのまま細胞内輸送の分析の一般的な方法を説明します。としてメソッドを提供している間で、プロトコル、可能な限り詳細な適応能力のほぼ無限の可能性を持って、各リーダーの特定蛋白質を研究する最適化できるようになります。
2 つの代替パルス追跡プロトコル、付着性のセル (ここで提示されたプロトコルの手順 1.1) のいずれかと懸濁細胞 (ここで提示されたプロトコルの手順 1.2) の 1 つを提供しています。ここでは、媒体式レベルで表現される蛋白質を可視化するための十分な条件が記載されて。リーダーが使用して不十分に表現された蛋白質または複数の immunoprecipitations などの閉口条件場合皿のサイズを増やすか、携帯番号を適切に必要です。
懸濁液パルス追跡の各時点で追跡サンプルがセルの単管から取得されます。洗浄の手順後、パルスは省略されます。代わりに、さらに35S の設立は、ラベル付けされていないメチオニンとシステインの高い過剰希釈によって防がれます。
示されたプロトコルは細胞の蛋白質折りたたみのプロセスに従うこと放射性35S ラベル システインとメチオニンを使用します。放射性試薬の操作は、オペレーターと放射性放射環境の任意の露出を最小限にし、指定のラボで実行する適切な保護措置を使用して実行する必要があります。パルス追跡として標識法は比較的非効率的短パルス時 (< 15 分)、新生タンパク質に組み込まれている開始放射能量の 1% 未満。免疫沈降を介してターゲットのタンパク質の濃縮、SDS ページのサンプルには放射能の開始量の 0.05% 未満が含まれています。
35S メチオニンとシステインの分類の組合せが安定、揮発性の放射性化合物をもたらすいくつかの分解が発生します。研究者と装置を保護するためにいくつかの注意が取られなければ必要があります。研究者は局所放射線安全規則に従う必要があります常に、マスク、白衣、手袋 (ダブル) ほかを看護炭を着ることがあります。35S メチオニンとシステインのストックのバイアルは、発煙のフードまたはローカル吸引ポイントの下で常に開いてください。知られている実験室汚染スポットは、シェーカー、インキュベーター、水浴ピペット遠心分離機です。活性炭フィルター、肯定的なシール マイクロ遠心チューブ用 (材料の表を参照してください)、水風呂、炭濾紙パルス追跡皿に接着で水族館炭スポンジ ピペット チップを使用して、これらの地域の汚染が減少します。吸引システムとインキュベーターや貯蔵容器に炭の粒を含んでいる皿の配置で炭のガード。
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Protocol
すべての放射性試薬およびプロシージャは、ユトレヒト大学放射線のローカル規則および規制に従った処理されました。
1. パルス追跡
-
付着性のセルのためのパルス追跡
注: ここで指定されたボリュームは、60 mm 細胞培養皿に基づいています。35 mm または 100 mm の皿、1/2 または 2 をそれぞれのボリュームを掛けます。このプロトコルは、0、15、30、60、120、240 分の時間 10 分とチェイスのパルス時間を使用します。これらは、(以下説明) 検討している特定の蛋白質によって変えることができます。- されるので、6 60 mm 細胞培養皿で付着性のセル (例えば、HEK 293、hela 細胞の町) の種子パルス追跡の日にサブコンフルエント (80%-90%)。時点および/または条件ごとに少なくとも 1 つの料理を使用します。
- 必要な場合は transfect 製造元の指示によると市販のトランスフェクション試薬を用いる細胞または、ウイルス8セル 1 前日パルス追跡実験式の適切な構築を変換します。
- 2 mL の洗浄バッファー (ハンクの平衡塩溶液 [HBSS]) で皿を洗う、飢餓媒体 (通常培養液など最低限必要な媒体 [MEM] メチオニンとシステインなしメチオニンとシステインおよびウシ胎児血清 [FB] に欠けている 2 mL を追加10 mM HEPES、pH 7.4)、し、15 分間 5% CO2と 37 ° C 加湿インキュベーターに料理を配置します。
- 彼らは水と接触がフロートしないようにラック prewarmed 37 ° C の水浴中に皿を転送します。タイマーを起動します。
- 40 s、飢餓培地を吸引、パルス解 (飢餓メディア + 55 µCi/35 mm ディッシュ ラベル、1.1.1 のステップの前の注を参照) の 600 μ L をピペットにそっとお皿の中央に追加まさに 1 分繰り返しこの手順 t の 1 分間隔で彼の残りの料理。テスト中に時間を節約する最長のチェイス サンプルを開始します。
注意: 放射性物質を処理する場合、偶発的な露出および/または汚染を防ぐために適切な予防措置及びローカル ルールに従うことが重要です。 - 11 分正確に、0 分追跡サンプルを除いて、すべての次の料理の皿に直接追跡中の 2 mL を追加、それを吸引し、再度、チェイス培地 2 mL を追加します。料理の残り 1 分間隔でこの手順を繰り返します。すべての料理を 37 ° C の定温器に転送します。
- 16 分丁度で追跡中の 2 mL を追加 (通常培 + 10 mM HEPES 【 ペーハー 7.4、5 mM システインとメチオニン 5 mM) の分類; 停止するパルス媒体上 0 分サンプル皿に直接すぐに吸引、冷却アルミ プレートに皿を転送し、2 mL の冷たい停止バッファー (HBSS + 20 mM Nエチルマレイミド [NEM]) を追加します。
注: これは 0 分追跡サンプルです。このサンプルでは 1.1.9 をステップに進みます。 - 各追跡の時間 (例えば、15 分追跡 24 分) 前に各チェイス皿を水風呂 2 分に転送、正確な追跡に (例えば、15 分間追跡の 26 分)、吸引チェイス メディアや pr に続いて場合微量遠心チューブに転送タンパク質分泌) と冷却アルミ プレートに皿を転送します。2 mL の冷たい停止バッファーを追加します。
- ≥5 分; 停止バッファー内の氷の上のすべての料理を孵化させなさい停止液を吸引し、冷たい停止液を 2 mL で洗います。洗濯物を吸引させ、換散バッファーの 600 μ L で料理を分離 (リン酸緩衝生理食塩水 [PBS] + nondenaturing 洗剤 [材料表を見る] プロテアーゼ阻害剤 + 20 mM NEM)。料理が定量的分離がように細胞スクレーパーを使用します。
- 1.5 mL 遠心チューブ ・遠心分離機 15,000-20,000 × gで 10 分間の核をペレットへの 4 ° C にライセートを転送します。
-
浮遊細胞の場合パルス追跡
注: 効率的なラベル付けするには、セルが 3 × 106 5 × 106セル/ml の濃度で短パルス ・ チェイス ボリュームは 4 パルス量 x をする必要があります。次の例では、我々 は 10 分の 1 mL の容積の 5 x 10 の6セルをパルス、屈する 5 を追いかける時間時点あたり 1 x 10 の6セルを含む 1 mL の (0、15、30、60、および 120 分) を指します。すべてのソリューションは、セクション 1.1 と同じです。- 時間あたり少なくとも 1 x 10 の6セル ポイントおよび/または条件の実験の時に細胞の十分な数がある、(例えば、3T3 Jurkat) 以前に公開されたプロトコル9によると懸濁液細胞を培養します。
- 必要な場合 transfect 市販トランスフェクション試薬製造元の指示に従って細胞またはウイルス8セル 1 前日パルス追跡実験式の適切な構築を変換します。
- 室温で 250 x gで 5 分間 50 mL のチューブで条件ごと 5 x 10 の6セルをペレット、洗って飢餓メディアの 5 mL の 1x それらをもう一度、ペレットし、飢餓のメディアの 1 つの mL でそれらを再懸濁します。
- 37 ° C の水浴にセルを転送し、10-25 分攪拌チューブ下部に沈降から細胞を防ぐためにすべての 10 〜 15 分のためにそれらをインキュベートします。
- タイマーを開始します。1 分丁度でセルを含むチューブに直接原液ラベルの 275 µCi (55 µCi/106セル × 1) を追加し、混合旋回します。
注意: 放射性物質を処理する場合、偶発的な露出および/または汚染を防ぐために適切な予防措置及びローカル ルールに従うことが重要です。 - 11 分丁度でチェイス メディアの 4 つの mL を追加することによって表示を停止します。サンプルをミックスし、すぐに冷たい停止液を 9 mL を含有した氷の 15 の mL の管に 1 mL を転送します。
注: これは 0 分追跡サンプルです。 - 連続時間ポイントごとにこの手順を繰り返します。すべての時間ポイントが収集されると、ペレット 4 ° C で 250 x gで 5 分間細胞培地を吸引 (またはタンパク質の分泌に続く場合新しい 15 mL チューブに転送)。洗浄停止液を 5 mL のセルと 4 ° C で 250 x gで 5 分間細胞のペレット
- 停止液を吸引、完全に冷えた換散バッファーの 300 μ L で細胞を溶解、完全な換散を確保するため氷の上 20 分間インキュベートします。1.5 mL 遠心チューブ、ペレット、核への 4 ° C で 15,000-20,000 × gで 10 分間遠心するライセートを転送します。
2. 免疫沈降
- 抗体を結合 (議論を参照) および免疫沈降ビーズ (例えば、蛋白質 A セファローズ) の 50 μ L (10% サスペンション [v] の換散バッファー + 0.25% ウシ血清アルブミン [BSA]) 遠心機でチューブし、シェーカーで 30 分程度、4 ° C でそれらを孵化させなさい。
- 常温 12,000 × gで 1 分のビーズをペレットし、上清を吸引します。抗体ビーズ混合物に溶解液 200 μ L を追加し、免疫沈降法が必要な場合, 1 h または頭以上のシェーカーの 4 ° C で > 1 h。
- 常温 12,000 × gで 1 分のビーズをペレットします。上清を吸引し、免疫沈降洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。5 分間室温でシェーカーにサンプルを配置します。
- 2.3 の手順で説明するように、ビーズをペレットし、洗浄を繰り返し 1 x。上清を吸引し、TE バッファー pH 6.8 (10 mM トリス-HCl、1 mM EDTA) の 20 μ L のビードを再停止しなさい。渦サンプル。
- 2x サンプルバッファー還元剤なしの 20 μ L を追加渦、再び 95 ° C、および渦で 5 分間加熱します。
注: 場合にのみ還元サンプルを準備して、2 μ L 500 mM DTT の追加してくださいこの時点で。手順 2.7 に進みます。 - 2.3 の手順で説明するように、ビーズをペレットします。500 mM DTT の 1 μ L を含む新鮮な遠心管にケト清 19 μ L を転送、遠心分離機のサンプル、および渦再び 95 ° C で 5 分間加熱すること前に。
- 12,000 × g; で 1 分のサンプル スピンダウンします。これは、低下したサンプルです。室温まで冷却し、1 M NEM の 1.1 μ L を減少とケトのサンプルに追加します。渦とスピン ダウン サンプルします。
3. SDS のページ
- まず、割合を決定する適切な SDS-PAGE 解決ゲル蛋白質のための関心の。たとえば、HIV 1 gp120、とき deglycosylated、〜 60 kDa で実行され、7.5% ゲルの分析です。
- 製造元の指示に従って TEMED せず解決のゲルの混合物を準備 (375 mM トリス-HCl [pH 8.8,] 0.1% SDS w/v % アクリルアミド x と 0.05% 過硫酸アンモニウム [AP] [w/v]) の真空下でドガと > 15 分。ゲル混合物を脱泡しながら徹底的に 70% のエタノールおよび組織の糸くずのゲルのガラス プレートをきれいにし鋳造装置にそれらを置きます。
- (最終濃度は 0.005% [v]) で解決のゲル混合物に TEMED を追加、混和、およびスタッキングのゲル ~1.5 cm スペースを残してガラス板間のピペットします。慎重に脱イオン H2O またはイソプロパノールでゲルをオーバーレイし、重合しておきます。
- 解決のゲル重合は、一度準備スタッキングのゲル混合物 (4% アクリルアミド、125 mM トリス-HCl [pH 6.8] 0.1 %sds [w/v] と 0.025 %aps [w/v])。
- 脱イオン H2O 解決のゲルの上をフラッシュし、その後、すべての水を削除します。
注: 最後の滴を削除するのにフィルターを使用します。 - TEMED をスタッキングのゲルの混合物 (0.005% [v]) に追加、徹底的に、ミックスしスタッキングのゲルと解決のゲルをオーバーレイし、15 も櫛を挿入します。スタッキングのゲルの重合が実行中の商工会議所にそれを転送し、バッファーを実行すると上下両院を埋める (25 mM トリス-HCl、グリシン 192 mM [pH 8.3] と 0.1 %sds [w/v])。
- 15 レーン minigel の車線ごとにサンプルの 10 μ L をロードします。最初のサンプルとゲルで最後のレーンを読み込まないし、バンドの笑顔を防ぐためにすべての空レーンで非還元サンプル バッファーをロードします。ゲルをランで定数 25 mA/ゲル、ゲルの下に色素フロントまで。
- ゲルをガラス板から削除、タンパク質染色液とゲルを染色 (10% 酢酸と H2O + 0.25% 華麗な 30% メタノール ブルー R250 [w/v]) 撹拌と 5 分のため、脱染め色 (染色液で 30 分間すすぐと鮮やかなブルー R250 せずソリューション)。
- ゲル プラスチックのフェイス ダウンをラップし、それらの上に 0.4 mm の濾紙を入れを配置します。ゲル サンドイッチ クロマトグラフィー紙側を上に置くゲル乾燥機。製造元の指示に従って、ゲル 80 ° C で 2 時間乾燥します。
- カセットに乾燥ゲルを転送し、オートラジオグラフィー フィルムまたは蛍光体スクリーンをかぶせます。オートラジオグラフィー フィルムを使用している場合は、暗い部屋でこの手順を実行する必要があります。
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Representative Results
折りたたみと付着性パルス追跡から HIV 1 gp120 の分泌は、図 2に示すです。Gp120 の酸化的フォールディング パンピング ゲル (セル NR の図) を示しています。パルス入力後すぐに 5 分 (0 分チェイス) gp120 のラベリング ゲルでより高いびまん性バンドとして表示され、チェイスが進むにつれてバンドはゲルによってダウン移行, さらたみ中間体 (IT) それをタイトなバンド (NT) の蓄積まで拡散ネイティブ折り返し gp120 を表します。これには、ジスルフィド結合の形成につれて完全還元蛋白質より速く移行するタンパク質のコンパクトさが発生します。(図のセル R) 削減のゲルのすべての形態の二硫化物結束は常時チェイスに移動は影響しませんように、削減されています。これはその他の変更の分析することができます。Rc に Ru から時間をかけてシフトを表します gp120 の翻訳後の信号ペプチドの開裂: 信号のペプチッドは、追跡中ににつれて、多くのタンパク質ネイティブの倍を達成し、シグナルペプチドを失うことの損失のため流動性を増加させます。パンピングと削減のゲルの信号は gp120 の分泌のための ~ 1 h 以降から減少を開始します。これは、メディア (図中) を分析することによって監視できます。パンピングと削減のジェルの比較は、ジスルフィド結合の変更と信号ペプチド除去を発見します。別の修正、N 結合糖鎖と糖鎖の変更、SDS ページの直前にエンドグリコシダーゼ H と消化 gp120 (と分析) から削除されたので、これはのみ可能です。
免疫グロブリン M (IgM) 懸濁液パルス追跡からの μ 重鎖の人身売買は、図 3に示します。時間をかけて HCERから HCゴルジ体へのシフトは、μ チェーンを小胞体からゴルジ体は、細胞から分泌に先立つの人身売買を表します。分子固まりのこの変更は、ゴルジ装置で糖鎖の N リンクの変更によって引き起こされます。
図 1: パルス追跡、免疫沈降、および SDS-PAGE のプロトコルの概略図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:のフォールディングと付着性パルス ・ チェイスに決定 1 HIV gp120 の分泌と。1 HIV gp120 の発現 HeLa 細胞の 10mj/cm ^2 の 60 mm 料理だったパルス 10 分のラベルし、示されたため追われて回。Gp120 の免疫沈降後、サンプル deglycosylated され、7.5 %sds ページのゲルを使用して分析しました。それ = フォールディング中間体;NT = ネイティブ gp120;Ru = 減らされた信号ペプチド分解されていない gp120;Rc = 減らされた信号ペプチド切断 gp120;NR: = パンピング;R = 削減します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: Igm 抗体の重鎖の人身売買、懸濁液パルス追跡によって決定されます。5 × 106 I.29 μ+ B 細胞がパルス 5 分のラベルし、示されたため追いかけ回。免疫沈降後、10 %sds ページのゲルを使用してサンプルを分析しました。HC = 免疫グロブリン μ 重鎖;LC = 免疫グロブリン軽鎖。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
パルス追跡方法はそのままなセルのフォールディングの科学者の理解を深めるために不可欠されています。できるだけ一般的な方法を提供しようとしている我々 は、折りたたみ、トランスポート、および蛋白質の細胞内中に発生するさまざまなプロセスを研究するバリエーションはほぼ無限の可能性がありますこのアプローチ。
料理の付着性細胞を用いたパルス追跡を実行すると、同じ別料理として、可能な限り各時点および/または実験の条件でそれぞれの料理を治療するために欠かせません。短いパルスとチェイスの時間の特に (< 5 分)、(デジタル タイマー) とパルスとチェイスの倍以上の厳格な制御を維持するために不可欠です。懸濁細胞にパルス追跡は、すべてのサンプルは、単管から取得されます、この変動を減らすために助けることができます。ある細胞のタイプは、培養皿に他よりより少しをよく付着、セルが洗い流されておらず様々 な媒体変更時に確保するため注意が必要があります。懸濁液のこれらのセルを使用するか、または培養皿に細胞を付着するポリ L リジンやゼラチンなどで皿をコーティングすることにより、これを克服することができます。料理の間にラベルの再現性を測定するため同一合計ラベル付けおよびタンパク質パターンのすべてのサンプルをチェックする SDS ページでライセート サンプルを調べる必要があります。また、液体シンチレーション カウンター lysates の合計の分カウント (cpm) を取り入れ、標識タンパク質の人口に関する情報を提供しないを確立します。
ターゲット蛋白質の不十分なラベル、ラベルの量を増やすのではなく、セル (または料理) の数を増やすことによって信号が増加します。研究プロセスの速度論は、これを許可するとき、パルス時間を延長はオプションです。理想的なパルス時間は各ターゲット式レベル、転写率、メチオニン ・ システインの数、タンパク質の折り畳みの速度などの要因により異なります。そのため、各実験では実験の目的を念頭に置いて上記の要因の最適なバランスを決定する実験を行われなければなりません。たとえば、折りたたみ時に中間体は、検討されている場合はパルスのラベルには短い表現のレベルのバランスを取りながら、できるだけ伸ばした状態に近い原料を持っている可能な限りの時間をことをお勧めします。また、トランスポートまたは蛋白質の分解研究の対象である、キネティック情報を損なうことがなく可能な限り信号の最高レベルを提供するためにパルス時間が長くことがあります。一般に、パルス時間範囲 2 15 分から変更することがなくこのプロトコルを使用する場合です。以前の実験5 〜 10 のタイムラグを示している総蛋白プールへの放射能の取り込み前にパルスの後 sこのパルス追跡実験から運動情報を派生する場合を念頭に重要です。略して (< 2 分) 時間パルス、パルス全体の時間の間に風呂の水にすべての料理を保つため。パルス時間を拡張する場合 (> 1 h) が使用されているそれは 1.5 倍パルス量を増やす、皿が乾くを防ぐためにパルスの間に 37 ° C のインキュベーターでロッカーに料理を置くことをお勧めします。メチオニンやシステインが含まれて蛋白質は両方の一般的な蛋白質合成を維持するに必要なレッテルを貼られる時でさえ個々35S メチオニン ・ システインまたはミックスを含むラベリング ・ ソリューションが利用可能なミックスは最寄りセル。実験条件は、特定のメチオニン ・ システインのラベリングを必要とする場合、パルスの間に非放射性のメチオニン ・ システインのレベルを調整する必要があります。
チェイス回 (と時間の点の数) は、同様の方法で決定されます。良い出発点は、パルス時間に等しいものとして (0 分チェイス) 後最初のチェイス時間を設定し、連続時間の各ポイントのための時間の長さを 2 倍して、(たとえば5、10、20、40 分)。ただし、これは特定の蛋白質と質問ごとに最適化されなければなりません。
理想的には、(これはタンパク質合成と折りたたみに影響を与える可能性があります) 飢餓によるストレス反応の活性化を防ぐため、いくつかのラベルが付いていないメチオニンとシステインを飢餓とカイネティックスのソリューションに追加する必要があります。量は、細胞株、ラベリングの時間、特に使用量、メディア ボリュームによって異なります、テストが必要になります。良い出発点は、システイン、メチオニン、パルス時間の増加とともに増加することができます細胞培養培地に存在量の 1% です。飢餓期間かどうかラベル付けされていないアミノ酸の有無に十分なラベル定款を確保し、ストレス反応の活性化を防ぐために 15-30 分の範囲で保持する必要があります。拡張パルス (≥ 1 h) を使用しているとき、飢餓は必要ではありません。
ここで記述されている換散バッファー、ほとんどの目的に適しているが、原則として HEPES、トリス、MES などの任意のバッファー システムが動作します。細胞を溶解に必要な洗剤の濃度は、細胞と洗剤量の数に依存します。濃度は臨界ミセル濃度 (CMC) と細胞を溶解するのに十分な洗剤の量上必ず必要があります。経験則は、0.5 %nondenaturing 洗剤 200 μ L (材料の表を参照してください) 細胞蛋白 (1 ~ 10 の6セル x) ~ 1 mg 相当を溶解するだけで十分です。塩濃度と洗剤も用途に合わせて、変化する可能性が、一般的には、ブレーク条件を開く核 (高い塩 > 0.1 %sds) 自由な DNA の存在が免疫沈降を妨げるとして避けるべきであります。これ回避できない、例えば、核または小球形にされた蛋白質を含む完全なセル lysates が分析する必要があるとき DNA は免疫沈降の前に小さなゲージの針を通して細胞を渡すことによって変形できます。これは、過剰な発泡を防ぐために超音波処理と放射性エアロゾルの生産より優先されます。
免疫沈降のための抗体の最適な量と抗体抗原の組み合わせごとに最高の洗浄バッファーの両方の目的抗原信号とバック グラウンドの間のバランスを達成するために徹底的にテストする必要があります。抗体は常に存在する必要があります; 定量的免疫沈降を確保するため抗原超過で良い出発点は、1 μ g 当たり 10 の6セル × 35 mm 料理/1 から免疫沈降抗体のです。背景は、洗剤や塩濃度を高めることによって減らすことができます。特に、0.1 %sds 添加はバック グラウンドを大幅に削減することができますが、抗体-抗原の相互作用を及ぼし。免疫沈降の間に抗体の特異性を制御するため、利用可能な場合はターゲット蛋白質に欠けている同じセルを使用してください。これは内因性のタンパク質を分析しているときなど、簡単ではありません、過剰発現または抗原の枯渇が動作します。(ある場合)、背景 (と特異性) のいずれかの効果をもたなかった血清を制御するまたはアイソタイプ コントロールを使用する必要があります。抗原免疫沈降ビーズへの直接バインドを制御するため抗体なしのビーズも使用する必要があります。ここで提供される条件は、抗原抗体各組洗浄バッファーと洗浄条件の最適化が必要になります、出発点として見なす必要があります。あまりにも多くの背景の場合に増やさない研ぎ回数が、洗濯の時間ではなくおよび/または洗浄バッファーの組成。Coimmunoprecipitations など、特に機密性の高い相互作用は、対処する必要がある、4 ° c、冷たいバッファーを使用してすべての洗浄手順を実施することが望ましい場合があります。
付着性のセルの懸濁細胞上の利点の 1 つは、パルス追跡中に実質的に任意の時点で治療を行うことがその薬です。シャペロン阻害剤を使用する場合たとえば、それは co -対翻訳後の段階折りたたみ過程への影響を区別することが可能。これによって拡張できます、coimmunoprecipitation を許可する (前述) 換散および免疫沈降の洗浄バッファーを適応タンパク質シャペロン複合体の折りたたみ10、11,12時。
サンプルの postlysis 治療、対処することができます質問を広げます。免疫沈降が立体構造の追加情報を提供する特にそれら欠けている二硫化物結束13、タンパク質の折り畳みを監視する使用されています前に、ターゲット蛋白質の制限酵素分解 14。免疫沈降15,16前にショ糖密度勾配遠心法による蛋白質の集合・複合体形成を監視できます。
パルスの追跡をフルに活用するには、高品位の試薬の可用性は immunoprecipitations 必要です。折り畳み中間体を調べると、分析中のタンパク質のすべてのフォームを引くことができる抗体を持つことが不可欠です。ターゲット蛋白質に特異抗体が利用できない場合これは親和性の札を使用して置き換えることができます。ただし、これは厳しく限られたタンパク質分解、直接タグの片だけを回復できるようにタンパク質の立体構造を調べるなど、postlysis の方法の有用性を制限します。
パルスの追跡の感度は問題の蛋白質メチオニンとシステイン残基の数によって制限されます。低発現レベルと相まってメチオニン ・ システイン残基の低い数字が付いている蛋白質はパルス追跡実験で検出されません。限られた分解など postlysis の変更を実行すると、検出できるはメチオニン、システイン含有の片だけに。
最後に、与えられたパルス追跡運動の詳細を提供する、彼らは他の多くのテクニックや定常状態レベルの分子細胞生物学を研究するために使用ツールを補完するもの。などは継続する分子生物学のツールボックスの貴重なコンポーネント。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者過去 Braakman ラボのすべてのメンバーに感謝し実りある議論のため、現在、この記事で紹介する手法の開発に役立ちます。このプロジェクトは、欧州連合の第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) N ° 235649 の下で欧州研究評議会とオランダ組織の科学的研究 (NWO) エコー プログラム N ° 711.012.008 の下の両方から資金を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
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