Summary
Her beskriver vi en protokoll for en generell puls-jage metode som tillater kinetisk analyse av folding, transport- og nedbrytning av proteiner som skal følges i levende celler.
Abstract
Radioaktivt puls-jage merking er et kraftig verktøy for å studere conformational modning, transport til deres funksjonelle mobilnettet plassering og nedbrytning av målet proteiner i levende celler. Med kort (puls) radiolabeling ganger (< 30 min) og strengt kontrollert chase ganger, er det mulig å merke bare en liten brøkdel av totale protein og følge sin folding. Kombinert med nonreducing/redusere SDS-polyakrylamid gel gelelektroforese (SDS-side) og immunoprecipitation med (konformasjon-spesifikk) antistoffer, kan folding prosesser undersøkes i stor detalj. Dette systemet har blitt brukt til å analysere folding av proteiner med en stor variasjon i egenskaper som løselig proteiner, enkelt og multi-pass transmembrane protein, tungt N - og O-glycosylated proteiner og proteiner med og uten omfattende disulfide binding. Puls-jage metoder er grunnlaget for kinetic studier til en rekke tilleggsfunksjoner, inkludert co og posttranslational modifikasjoner, oligomerization og polymerisasjon, i hovedsak slik at analyse av et protein fra fødselen til døden. Puls-jage studier protein folding er komplementære andre biokjemiske og Biofysiske metoder for å studere proteiner i vitro økt midlertidig løsning og fysiologiske informasjon. Metodene som beskrives i dette papiret er tilpasset lett for å studere folding av nesten alle protein som kan uttrykkes i pattedyr eller insekt-cellen.
Introduction
Folding av selv relativt enkel proteiner involverer mange ulike folding enzymer, molekylær chaperones og kovalente modifikasjoner1. En komplett rekonstituering av disse prosessene i vitro er praktisk talt umulig, gitt det store antallet ulike komponenter involvert. Det er svært ønskelig, derfor, å studere protein folding i vivoi live celler. Radioaktivt puls-jage teknikker være et kraftig verktøy for å studere syntese, folding, transport og nedbrytning av proteiner i sitt naturlige miljø.
Den metabolske merking av proteiner under en kort puls med 35S-merket metionin/cystein, etterfulgt av en jakt i fravær av en radioaktiv etikett, tillater spesifikk sporing av innbyggere nylig syntetisert proteiner i bredere mobilnettet miljøet. Deretter målet proteiner kan være isolert via immunoprecipitation og analysert via SDS-siden eller andre teknikker. For mange proteiner, er sin reise gjennom cellen preget av endringer som er synlige på SDS side gel. For eksempel er transport av glycosylated proteiner fra det endoplasmatiske retikulum (ER) til Golgi komplekset ofte ledsaget av modifikasjoner av N-koblede glykaner eller tillegg av O-koblede glykaner2,3. Disse endringene føre til store økninger i tilsynelatende molekylær masse, som kan sees av mobilitet endringer i SDS-side. Modning kan også merkes av proteolytisk cleavages, som signal-peptid spalting eller fjerning av pro-peptider, noe som resulterer i endringer i tilsynelatende molekylær massen som kan følges lett på SDS-side gel4. Radioaktivitet har betydelige fordeler fremfor sammenlignbare teknikker som gapestokk jager, hvor romanen proteinsyntese er forhindret, lengre behandlinger er giftig for celler og utelukker ikke flertallet av eldre, stabil proteiner fra den analyse, som noen proteiner har dager. Sammenligning av proteiner under både nonreducing og redusere forholdene tillater analyse av disulfide obligasjon formasjonen, et viktig skritt i folding av mange sekretoriske proteiner4,5,6, 7.
Her beskriver vi en generell metode for analyse av proteinfolding og transport i intakt celler, med en radioaktiv puls-jage tilnærming. Mens å gi metoden som detaljert som mulig, protokollen har en nesten ubegrensede muligheter for tilpasning og vil tillate optimalisering å studere hver leserens spesifikke proteiner.
To alternative puls-jage protokoller, én for tilhenger celler (trinn 1.1 av protokollen presenteres her) og én for suspensjon celler (trinn 1.2 av protokollen presenteres her) er gitt. Betingelsene gis her er nok å visualisere et protein uttrykt med middels til høy-uttrykk nivåer. Hvis leseren arbeider med dårlig uttrykt proteiner eller ulike posttreatment forhold, som flere immunoprecipitations, er det nødvendig å forstørre parabolen eller celle nummer riktig.
For suspensjon puls chase, er chase prøver tatt på hvert tidspunkt alle tatt fra en enkelt rør av celler. Vask trinnene etter pulsen utelates; i stedet ytterligere hindres innlemmelse av 35S av fortynning med en høy overskudd av umerkede metionin og cystein.
Presentert protokollene bruk radioaktivt 35S-merket cystein og metionin for å følge mobilnettet protein-folding prosesser. Alle operasjoner med radioaktive reagenser bør utføres med passende forholdsregler å minimere eventuelle eksponering av operatøren og miljø for radioaktiv stråling og utføres i et utpekt laboratorium. Som puls-jakten merking teknikk er relativt ineffektiv kort puls ganger (< 15 min), mindre enn 1% av startbeløpet for radioaktivitet er innarbeidet i de nylig syntetisert proteinene. Etter anriking av målet protein via immunoprecipitation inneholder utvalget for SDS siden mindre enn 0.05% av startbeløpet for radioaktivitet.
Selv om de 35S metionin og cystein merking blanding har stabilisert seg, vil noen nedbryting, gir flyktige radioaktivt forbindelser, skje. For å beskytte forskeren og apparatet, bør forholdsregler tas. Forskeren må alltid følge lokale stråling sikkerhetsreglene og kan slites trekull sykepleie maske, foruten en labfrakk og (doble) hansker. Lager ampuller med 35S metionin og cystein bør alltid åpnes i avtrekksvifte, eller under en lokal aspirasjon punkt. Kjente laboratorium forurensning flekker er sentrifuger, Pipetter, vann bad, inkubatorer og shakers. Forurensning av disse områdene reduseres ved hjelp av pipette-spisser med filtere trekull, positiv-seglet microcentrifuge rør (se Tabell for materiale), akvariet trekull svamper vann bad, trekull filter Papers limt i puls-jage retter, trekull vakt i aspirasjon systemet, og plasseringen av retter som inneholder trekull korn i inkubatorer og lagercontainere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle radioaktivt reagenser og prosedyrer ble håndtert i samsvar med lokale Universitetet i Utrecht stråling regler og forskrifter.
1. pulse Chase
-
Puls jakten på tilhenger celler
Merk: Volumene gitt her er basert på 60 mm celle kultur retter. For 35 mm eller 100 mm retter, multiplisere volumene med 1/2 eller 2, henholdsvis. Denne protokollen bruker en puls tid 10 min og chase ganger 0, 15, 30, 60, 120 og 240 minutter. Disse kan endres avhengig av spesifikke proteiner blir studert (omtalt under).- Frø tilhenger celler (f.eksHEK 293, jakten, CHO) i seks 60 mm celle kultur retter slik at de er subconfluent (80% - 90%) ved puls jakten. Bruke minst en rett per punkt og/eller tilstand.
- Eventuelt transfect cellene med kommersielt tilgjengelig transfection reagenser i henhold til produsentens instruksjoner; Du kan eventuelt virally transduce8 cellene 1 dag før puls-jakten eksperimentere med den aktuelle konstruere for uttrykket.
- Vaske med 2 mL vaskebuffer (Hanks balansert salt løsning [HBSS]), tilsett 2 mL av sult medium (normal kultur medium mangler metionin og cystein og fosterets bovin serum [FBS], for eksempel minimum viktig medium [minne] uten metionin og cystein men med 10 mM HEPES, pH 7.4), og plassere retter i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO2 i 15 min.
- Overføre retter til brettene i en prewarmed 37 ° C vannbad slik at de er i kontakt med vann, men ikke flyte. Start en tidtaker.
- På 40 s, Sug opp den sult mediet, trekke opp 600 µL av puls løsning (sult media + 55 µCi/35 mm parabolen etikett, se teksten foran trinn 1.1.1) i pipette, og legger den forsiktig til midten av fatet på nøyaktig 1 min. Gjenta dette trinnet i 1 minutt intervaller på t Han gjenværende retter. Start med den lengste chase prøven å Spar tid under eksperimentet.
Merk: Når du håndterer radioaktivt materiale, er det viktig å følge forsiktighetsregler, regler og krav for å hindre utilsiktet eksponering og/eller forurensning. - For alle følgende retter, unntatt 0 min chase utvalget, og nøyaktig 11 min legge 2 mL av chase medium direkte til parabolen, Sug opp den og igjen, legger 2 mL av chase medium. Gjenta dette trinnet med 1 minutt intervaller for gjenværende retter. Overføre alle retter til en 37 ° C inkubator.
- På nøyaktig 16 min, legge 2 mL av chase medium (normal kultur medium + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM cystein og 5 mM metionin) direkte til 0 min prøve retten over puls medium å stoppe merking; deretter Sug opp umiddelbart, overføre retten til en avkjølt aluminiumsplate og legge 2 mL iskald stopp buffer (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]).
Merk: Dette er 0 min chase prøven. For dette eksemplet, kan du gå direkte til trinn 1.1.9. - Overføre hver chase rett tilbake til vannbad 2 min før hver chase (f.eks24 minutter for en 15 min chase) og samtidig nøyaktig chase (f.eks26 min for en 15 min jakt), Sug opp chase media (eller overføre den til et microcentrifuge rør hvis følgende pr otein sekresjon) og overføre retten til en avkjølt aluminiumsplate. Legg 2 mL iskald stopp buffer.
- Inkuber alle retter på is i stopp bufferen for ≥5 min; deretter Sug opp stopp løsning og vaske det med 2 mL iskald stopp. Sug opp vask og lyse retter med 600 µL av lyseringsbuffer (fosfat-bufret saline [PBS] + nondenaturing vaskemiddel [se Tabellen for materiale] proteasehemmere + 20 mM NEM). Bruk cellen skraper for å sikre at rettene er lysed kvantitativt.
- Overføring av lysate til en 1,5 mL microcentrifuge rør og sentrifuge for 10 min 15.000-20.000 x g og 4 ° C pellets kjerner.
-
Puls Chase for suspensjon celler
Merk: For å sikre effektiv merking, cellene skal være pulsed på en konsentrasjon av 3 x 106 5 x 106 celler/mL, og jage volumer bør være 4 x puls volumet. I følgende eksempel pulserende vi 5 x 106 celler i et volum på 1 mL for 10 min, for å gi jage fem tiden peker (0, 15, 30, 60 og 120 min) på 1 mL, med 1 x 106 celler per punkt. Alle løsninger er de samme som i avsnitt 1.1.- Kultur suspensjon cellene (f.eks3T3, Jurkat) i henhold til en tidligere publisert protokollen9 slik at det er et tilstrekkelig antall celler ved eksperimentet, minst 1 x 106 celler per gang peker og/eller tilstand.
- Eventuelt transfect celler med kommersielt tilgjengelig transfection reagenser i henhold til produsentens instruksjoner eller virally transduce8 cellene 1 dag før puls-jakten eksperimentere med den aktuelle konstruere for uttrykket.
- Pellets 5 x 106 celler per betingelse i en 50 mL tube for 5 min på 250 x g ved romtemperatur, vask dem 1 x med 5 mL av sult media, pellets dem igjen, og resuspend dem i 1 mL av sult media.
- Overføre cellene til en 37 ° C vannbad og ruge dem for 10-25 min. agitere rør hvert 10-15 min å hindre cellene seg nederst.
- Starte tidtakeren. På nøyaktig 1 min, legge til 275 µCi (55 µCi/1 x 106 celler) ufortynnet etiketten direkte i røret som inneholder cellene og virvel for å blande.
Merk: Når du håndterer radioaktivt materiale, er det viktig å følge forsiktighetsregler, regler og krav for å hindre utilsiktet eksponering og/eller forurensning. - Akkurat 11 minutter, stoppe merking ved å legge 4 mL chase medier. Bland prøven og øyeblikkelig overføre 1 mL til en 15 mL tube på is, som inneholder 9 mL iskald stopp løsning.
Merk: Dette er 0 min chase prøven. - Gjenta disse trinnene for hvert påfølgende punkt. Når alle tidspunkt er samlet, pellets celler for 5 min på 250 x g på 4 ° C. Sug opp mediet (eller overføre den til en ny 15 mL tube hvis følgende protein sekresjon). Vask cellene med 5 mL stopp og pellets celler for 5 min på 250 x g på 4 ° C.
- Sug opp stopp løsning, helt lyse cellene med 300 µL av iskalde lyseringsbuffer og ruge dem for 20 min på is å sikre en komplett lysis. Overføring av lysate til en 1,5 mL microcentrifuge rør og sentrifuge for 10 min 15.000-20.000 x g på 4 ° C pellets kjerner.
2. Immunoprecipitation
- Kombinere antistoff (se diskusjon) og 50 µL av immunoprecipitation perler (f.eks protein A-Sepharose) (10% suspensjon [v/v] i lyseringsbuffer + 0,25% bovin serum albumin [BSA]) i et microcentrifuge rør og Inkuber dem ved 4 ° C i ~ 30 min i en shaker.
- Pellets perler for 1 min 12 000 x g ved romtemperatur og Sug opp nedbryting. Legge til 200 µL av lysate antistoff-perle blandingen og ruge på 4 ° C i en shaker 1t eller hode-over-hodet hvis immunoprecipitation krever > 1t.
- Pellets perler for 1 min 12 000 x g ved romtemperatur. Sug opp nedbryting og tilsett 1 mL av immunoprecipitation vaskebuffer. Plass prøven i en shaker ved romtemperatur for 5 min.
- Pellets perler som beskrevet i trinn 2.3 og gjenta vask 1 x. Deretter Sug opp nedbryting og resuspend perler i 20 µL av TE buffer, pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vortex prøven.
- Legge til 20 µL av 2 x prøve buffer uten reduksjonsmiddel, vortex, varme den i 5 min på 95 ° C og vortex igjen.
Merk: Hvis bare forbereder redusert eksemplene, 2 µL av 500 mM DTT bør legges på dette punktet. Deretter videre til trinn 2.7. - Pellets perler som beskrevet i trinn 2.3. Overføre 19 µL nonreduced nedbryting av til en frisk microcentrifuge rør som inneholder 1 µL av 500 mM DTT, sentrifuge samplingsfrekvens, og vortex det før varme den i 5 min på 95 ° C igjen.
- Nedspinning utvalget for 1 min på 12.000 x g; Dette er redusert prøven. Avkjøle det ned til romtemperatur og legge 1.1 µL av 1 M NEM til både den reduserte og nonreduced prøven. Vortex og Nedspinning prøvene.
3. SDS-SIDE
- Først bestemme den aktuelle SDS side løse gel prosenten av protein av interesse. For eksempel HIV-1 gp120, når deglycosylated, går på ~ 60 kDa og analyseres i en 7,5% gel.
- Forberede løse gel blandingen uten TEMED i henhold til produsentens instruksjoner (x % akrylamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] 0,1% SDS [w/v], og utgjør 0,05% ammonium persulfate [APS] [w/v]) og degas under vakuum for > 15 min. Mens gel blandingen er avgassing, grundig ren gel glassplater med 70% etanol og lofri vev og plassere dem i en avstøpning apparater.
- Legge til TEMED til løse gel blanding (i en siste konsentrasjon av 0.005% [v/v]), bland godt og Pipetter mellom glassplater, ~1.5 cm avstand for stabling gel. Nøye overlegg gel med deionisert H2O eller isopropanol og la den danner.
- Når løse gel har polymerized, forberede stabling gel blandingen (4% akrylamid, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], 0,1% SDS [w/v], og 0.025% APS [w/v]).
- Tømme toppen av løse gel med deionisert H2O, og deretter fjerner alt vannet.
Merk: Bruk filter papir for å fjerne den siste dråper. - Legge til TEMED til stabling gel blanding (0.005% [v/v]), bland godt, og overlegg løse gel med stabling gel og sette inn en 15-vel kam. Når stabling gel har polymerized, overføre det til en løpende kammer og fylle kamrene med kjører buffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM glysin [pH 8.3] og 0,1% SDS [w/v]).
- Laste inn 10 µL av vareprøve per kjørefelt i en 15-spors minigel. Unngå lasting prøvene i første og siste kjørefelt på gel og laste nonreducing eksempel buffer i alle tomme baner å hindre den smilende band. Løpe geléer på konstant en 25 mA/gel til fargestoff fronten er på bunnen av gel.
- Fjerne geléer fra glassplater, stain gels med protein-flekk løsning (10% eddiksyre og 30% metanol i H2O + 0,25% briljant blå R250 [w/v]) i 5 min med agitasjon, og deretter destain i 30 min med destaining løsning (farging løsning uten briljant blå R250).
- Ordne geléer forsiden ned på en plast brytes, og deretter plassere 0.4 mm kromatografi papir oppå. Plass gel sandwich kromatografi papir-siden på en gel tørketrommel. Etter produsentens instruksjoner, tørr geléer 2 h på 80 ° C.
- Overføre tørket geléer på et bånd og klæ dem med autoradiography film eller fosfor skjermen. Hvis bruk autoradiography filmen, må dette trinnet utføres i et mørkt rom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenleggbar og sekresjon av HIV-1 gp120 fra en tilhenger puls chase er vist i figur 2. Nonreducing gel (celler NR i figuren) viser oksidativt folding av gp120. Umiddelbart etter pulsen merking av 5 min (0 min chase) gp120 vises som et diffus band høyere i gel, og som til jakten pågår, bandet overfører ned gel gjennom enda mer diffust folding mellomprodukter (IT) til akkumuleres i tett bandet (NT) som representerer innfødt kastet gp120. Dette skjer som dannelsen av disulfide obligasjoner øker compactness av protein, forårsaker det å flytte raskere enn fullstendig redusert protein. På å redusere gel (celler R i figuren), er disulfide obligasjoner på alle former redusert slik at bestandig chase, de ikke påvirker mobilitet. Dette gjør at analyse av andre endringer. Skiftet over tid fra Ru til Rc representerer posttranslational signal-peptid spalting av gp120: mobilitet øker på grunn av tap av signal peptid, noe som øker under jakten som mer proteiner oppnå innfødt fold og mister deres signal peptid. Både nonreducing og redusere gel begynner signalet å redusere ~ 1 h videre på grunn av utskillelsen av gp120. Dette kan overvåkes ved å analysere media (Medium i figuren). En sammenligning av nonreducing og redusere geléer avdekker disulfide obligasjon endringer og signal-peptid fjerning. Dette var bare mulig fordi en annen endring, N-tilknyttet glykosylering og glycan modifikasjoner, ble fjernet fra gp120 (og analyse) fordøyelsen med endoglycosidase H like før SDS-side.
Smugling av µ tunge kjeden av immunglobulin M (IgM) fra en suspensjon puls jage vises i Figur 3. Et skifte over tid fra HCER til HCGolgi representerer smugling av µ lm ER til Golgi, som står foran sekret fra cellen. Denne endringen i molekylær masse skyldes endring av N-tilknyttet glykaner i i Golgi.
Figur 1 : Skjematisk diagram av protokollen for puls chase, immunoprecipitation og SDS side. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Folding og sekresjon av HIV-1 gp120, bestemmes av tilhenger puls chase. Subconfluent 60 mm retter fra HeLa celler uttrykke HIV-1 gp120 var puls merket for 10 min og jaget for angitt tid. Etter immunoprecipitation av gp120, prøvene var deglycosylated og analysert ved hjelp av en 7,5% SDS side gel. DET = folding mellomprodukter; NT = opprinnelig gp120; Ru = redusert signal-peptid-uncleaved gp120; RC = redusert signal-peptid-kløyvde gp120; NN: = nonreducing; R = redusere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Smugling i den tunge kjeden av IgM, bestemmes av suspensjon puls chase. 5 x 106 I.29 µ+ B-cellene var puls merket for 5 min og jaget for angitt tid. Etter immunoprecipitation, ble prøvene analysert ved hjelp av en 10% SDS side gel. HC = immunglobulin µ tunge kjede; LC = immunglobulin lys kjeden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Puls-jage metoder har vært avgjørende for utvikling av forskernes forståelse av protein folding i intakt celler. Mens vi har forsøkt å gi en metode som er generelt som mulig, har dette potensial for nesten ubegrensede varianter å studere ulike prosesser som oppstår under den folding, transport, og livet til proteiner i cellen.
Når du utfører en puls jage bruke tilhenger celler i retter, er det viktig å behandle hver rett det samme så mye som mulig, som en egen rett brukes for hvert punkt og/eller tilstand i et eksperiment. Spesielt for kort puls og chase ganger (< 5 min), er det viktig å opprettholde en stram kontroll over puls og chase ganger (med en digital timer). Puls jager med suspensjon celler kan bidra til å redusere denne variasjonen som alle prøvene er tatt fra et enkelt rør. Som noen celletyper følge mindre godt kultur retter enn andre, bør forsiktighet utvises slik at cellene ikke er vasket bort under de ulike medium endringene. Dette kan løses ved hjelp av disse cellene i suspensjon eller belegg retter med poly-L-lysin eller gelatin, for eksempel å følge cellene til kultur-retter. For å måle reproduserbarhet av merking mellom retter, bør et utvalg av lysate bli undersøkt av SDS-siden for å sjekke alle prøver for identisk total merking og protein mønster. Alternativt, flytende scintillation telling av lysates vil etablere det totale teller per minuttet (cpm) innlemmet, men vil ikke gi informasjon om befolkningen protein merket.
Hvis et mål protein etiketter dårlig, økes signalet ved å øke antall celler (eller retter) i stedet for å øke mengden av etiketten. Forlenge puls tiden er et alternativ når the kinetics av studerte prosessen tillater dette. Den ideelle pulsen vil variere med hver mål på grunn av faktorer som hvilket uttrykk, transkripsjon hastigheten, antall methionines/cysteinene og folding frekvensen av protein. Som sådan, må eksperimentering foretas å bestemme den beste balansen mellom de ovennevnte faktorene i hvert eksperiment samtidig eksperimentelle målet i tankene. Hvis mellomprodukter under folding blir undersøkt, for eksempel er det ønskelig å puls etiketten som kort tid som mulig å ha utgangsmaterialet så nær en utbrettet tilstand som mulig, mens balansering uttrykk nivåer. Alternativt, hvis transport eller nedbrytning av et protein er målet for studien, puls ganger kan bli forlenget for å gi de høyeste nivåene av signal mulig uten at kinetisk informasjon. Generelt, kan puls ganger variere fra 2-15 min når du bruker denne protokollen uten endringer. Tidligere eksperimentering5 har vist opphold på ~ 10 s etter pulsen før innlemmelse av radioaktivitet i totale protein bassenget. Dette er viktig å huske på når avledet kinetic informasjon fra puls-jage eksperimenter. For kort puls ganger (< 2 min), holde alle rettene på vannbad under hele puls tid. Hvis utvidet puls ganger (> 1 h) er brukt, er det tilrådelig å øke pulsen volumet av 1,5 ganger og plassere retter på en rocker i en 37 ° C inkubator under pulsen å hindre rettene tørker ut. Mens finnes merking løsninger som inneholder personlige 35S-metionin/cystein eller en blanding, foretrekkes blanding selv når proteiner som bare inneholder metionin eller cystein blir merket som både er nødvendig for å opprettholde generell proteinsyntese i cellen. Hvis eksperimentelle forhold krever bestemte metionin/cystein merking, må nivåene av nonradioactive metionin/cystein under pulsen justeres tilsvarende.
Chase ganger (og antall tidspunkt) bestemmes på en lignende måte. Et godt utgangspunkt er å sette første chase gang (etter 0 min chase) som lik puls tid, og deretter doble lengden av tid for hvert påfølgende punkt (f.eks, 5, 10, 20 og 40 min). Men må dette være optimalisert for hver bestemt protein og spørsmål.
For å hindre aktivering av stressresponser av sult (som kan påvirke proteinsyntese og folding), ideelt sett, bør noen umerkede metionin og cystein legges til den sult og radiolabeling løsninger. Antallet avhenger på cellen linjen, merking tiden, antall radiolabel brukt og media volumer, og vil trenge testing. Et godt utgangspunkt er 1% av mengden cystein og metionin i celle kultur medium, som kan økes med økende puls ganger. Sult perioder, enten med eller uten umerkede aminosyrer, bør holdes i størrelsesorden 15-30 min å sikre tilstrekkelig etiketten innlemmelse og forhindre aktiveringen av stressresponser. Når du bruker en utvidet puls (≥1 h), kreves ikke sult.
Lyseringsbuffer beskrevet her vil være egnet for de fleste formål, men i prinsippet alle buffer system, som HEPES, Tris eller MES, vil fungere. Vaskemiddel konsentrasjonen trengs til lyse cellene avhenger av antall celler og vaskemiddel volum. Konsentrasjonen bør alltid være over kritiske micelle konsentrasjon (CMC) og antall vaskemiddel tilstrekkelig til lyse cellene. En empirisk tommelfingerregel er at 200 µL av 0,5% nondenaturing vaskemiddel (se Tabell for materiale) er tilstrekkelig til å lyse celle tilsvarende ~ 1 mg protein (~ 1 x 106 celler). Salt konsentrasjonen og vaskemidler kan også varieres i henhold til programmet, men generelt tilstander som bryter åpne kjerner (høy salt, > 0,1% SDS) bør unngås så tilstedeværelsen av gratis DNA vil påvirke immunoprecipitation. Hvis dette ikke unngås, for eksempel når komplett celle lysates inkludert kjerner eller pelleted proteiner må analyseres, kan DNA bli skåret av cellene passerer en liten måler nål før immunoprecipitation. Dette er foretrukket over sonication for å unngå overdreven skummende og produksjon av radioaktivt aerosoler.
For immunoprecipitation, må både den optimale mengden av antistoffer og den beste vaskebuffer for hver kombinasjon av antistoff-antigen testes grundig for å oppnå en balanse mellom ønskede antigen signalet og bakgrunn. Antistoffer bør alltid være tilstede i overkant over antigener å sikre kvantitative immunoprecipitation; et godt utgangspunkt er 1 µg av antistoffer per immunoprecipitation fra en 35 mm parabolen/1 x 106 celler. Bakgrunnen kan reduseres ved å øke den vaskemiddel eller salt konsentrasjoner. Spesielt tillegg av ≤0.1% SDS kan hjelpe å sterkt redusere bakgrunnen, men kan også forstyrre antistoff-antigen interaksjoner. Hvis du vil kontrollere for spesifisitet av antistoffer under immunoprecipitation, bør identiske celler mangler målet protein brukes når tilgjengelig. Hvis dette ikke er enkelt, for eksempel når endogene proteiner blir analysert, fungerer den overuttrykte eller uttømming av antigen. Kontrollere for bakgrunnen (og spesifisitet), enten preimmune sera (hvis mulig) eller isotype kontroller skal brukes. Bestemme for antigener bindende direkte til immunoprecipitation perler, bør perler uten antistoff også bli brukt. Vilkår her bør anses som utgangspunkt som hvert antistoff-antigen par vil kreve en optimalisering av både vaskebuffer vask. I tilfelle for mye bakgrunn, øke ikke antall vasker, men heller da vask og/eller sammensetningen av vaskebuffer. Hvis spesielt følsomme interaksjoner som i coimmunoprecipitations må behandles, kan det være lurt å gjennomføre alle vask trinnene på 4 ° C med iskald buffere.
En fordel med tilhenger celler over suspensjon cellene er at stoffet behandlinger kan utføres på nesten helst under puls jakten. Hvis brukt med Anstandsdame hemmere, for eksempel er det mulig å skille sin effekt på co - versus posttranslational fasene av en sammenleggbar prosess. Dette kan utvides ved å tilpasse lyse og immunoprecipitation vaskebuffere (omtalt ovenfor) for å tillate coimmunoprecipitation av protein-Anstandsdame komplekser under folding10,11,12.
Postlysis behandling av prøvene vil utvide omfanget av spørsmål som kan rettes. Begrenset protease fordøyelsen av målet proteiner før immunoprecipitation gir conformational tilleggsinformasjon og har blitt brukt til å overvåke folding av proteiner, særlig de mangler disulfide obligasjoner13, 14. Protein aggregering og komplekse formasjon kan overvåkes av sukrose tetthet-gradient sentrifugering før immunoprecipitation15,16.
For å dra full nytte av puls jager, kreves tilgjengeligheten av høy kvalitet reagenser for immunoprecipitations. Når å sammenleggbar mellomprodukter, er det viktig å ha antistoffer som kan trekke ned alle former for protein under analyse. Hvis spesifikke antistoffer mot protein målet ikke er tilgjengelig, kan dette erstattes ved hjelp av affinitet. Dette begrenser imidlertid nytten av postlysis metoder, for eksempel begrenset proteolyse, å direkte undersøke protein konformasjon, som bare merket fragmenter kan gjenopprettes.
Følsomheten til puls jager er begrenset av antall metionin og cystein rester i protein i spørsmålet. Proteiner med lave antall metionin/cystein rester kombinert med en lav uttrykk er undetectable puls-jage eksperimenter. Når du utfører postlysis endringer, for eksempel begrenset proteolyse, vil bare metionin/cystein inneholder fragmenter være synlig.
For å konkludere, gitt kinetic detaljer som puls jager gir, de er komplementære til mange andre teknikker og verktøy for å studere molekylære cellebiologi på stabil nivå. Som sådan, fortsetter de å være en uvurderlig komponent i molekylær biolog verktøykassen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker alle medlemmer av Braakman lab, forbi og presentert for diskusjonene fruktbart og å utvikle metodene i denne artikkelen. Dette prosjektet har mottatt finansiering fra både europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) N ° 235649 og Nederland organisasjonen av vitenskapelig forskning (NWO) under ECHO-programmet N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
