Summary
Aquí se describe un protocolo para un método de Pulso-persiga general que permite el análisis de la cinético de plegamiento, transporte y degradación de proteínas en células vivas.
Abstract
Radiactivos de Pulso-persiga el etiquetado es una poderosa herramienta para el estudio de la maduración conformacional, el transporte y su localización celular funcional, la degradación de las proteínas de la blanco en células vivas. Mediante el uso de tiempos radiolabeling cortos (pulso) (< 30 min) y firmemente controlada por tiempos de persecución, es posible que sólo una pequeña fracción de la piscina de la proteína total de la etiqueta y seguir su plegamiento. Cuando se combina con nonreducing, reduciendo electroforesis del gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y la inmunoprecipitación con anticuerpos (específicos de conformación), procesos de plegamiento puede examinarse con gran detalle. Este sistema se ha utilizado para analizar el plegado de proteínas con una gran variación de propiedades como proteínas solubles, proteínas transmembranales únicas y de multipaso, pesadamente proteínas N - y O-glicosiladas y proteínas con y sin extenso disulfuro de la vinculación. Pulso-persiga los métodos son la base de estudios cinéticos en una gama de características adicionales, incluyendo co - modificaciones del posttranslational, Oligomerización y polimerización, esencialmente, lo que permite el análisis de una proteína desde el nacimiento hasta la muerte. Pulso-persiga los estudios en el plegamiento de la proteína son complementarios con otros métodos bioquímicos y biofísicos para el estudio de proteínas en vitro proporcionando información fisiológica y mayor resolución temporal. Los métodos como se describe en este artículo se adaptan fácilmente para estudiar el plegamiento de casi cualquier proteína que puede expresarse en sistemas mamíferos o insectos-cell.
Introduction
El plegamiento de incluso relativamente simple de las proteínas consiste en muchas diversas enzimas plegables chaperones moleculares y modificaciones covalentes1. Una reconstitución completa de estos procesos en vitro es prácticamente imposible, dado el gran número de diferentes componentes involucrados. Es altamente deseable, por lo tanto, estudiar la proteína plegable en vivo, en células vivas. Técnicas radiactivas Pulso-persiga probar una herramienta poderosa para el estudio de la síntesis, plegable, transporte y degradación de proteínas en su ambiente natural.
El metabólico etiquetado de proteínas durante un pulso corto con 35S-labeled metionina/cisteína, seguido de una persecución en la ausencia de una etiqueta radiactiva, permite el seguimiento específico de una población de proteínas recién sintetizadas en el más amplio medio celular. Luego, las proteínas blanco pueden ser aislada mediante inmunoprecipitación y analizan por SDS-PAGE u otras técnicas. Para muchas proteínas, su viaje a través de la célula se caracteriza por modificaciones visibles en gel de SDS-PAGE. Por ejemplo, el transporte de proteínas glicosiladas desde el retículo endoplásmico (ER) del complejo de Golgi es acompañado a menudo por modificaciones de glycans N-ligados o la adición de O-linked glycans2,3. Estas modificaciones provocan grandes aumentos en la masa molecular aparente, que puede verse por los cambios de movilidad en SDS-PAGE. Maduración también puede ser marcada por las divisiones proteolíticas, tales como péptido señal escote o la eliminación de pro-péptidos, dando por resultado cambios en la masa molecular aparente que puede seguirse fácilmente en gel de SDS-PAGE4. Radiactividad tiene considerables ventajas sobre técnicas comparables como persecuciones de cicloheximida, donde se impide la síntesis de nuevas proteínas, como tratamientos más largos son tóxicos para las células y no excluyen a la mayoría de las proteínas mayores, estado de la Análisis, como algunas proteínas tienen vidas medias de días. La comparación de proteínas en ambos nonreducing y reducción de condiciones permite el análisis de la formación del enlace de disulfuro, un paso importante en el plegamiento de las proteínas secretoras muchos de4,5,6, 7.
Aquí describimos un método general para el análisis del plegamiento de la proteína y el transporte en las células intactas, utilizando un enfoque de Pulso-persiga radiactivos. Mientras que nos hemos dirigido para proporcionar el método detallado como sea posible, el protocolo tiene un potencial casi ilimitado para la adaptabilidad y permitirá la optimización para el estudio de proteínas específicas de cada lector.
Se proporcionan dos protocolos alternativos Pulso-persiga, para células adherentes (paso 1.1 del protocolo presentado aquí) y las células de suspensión (paso 1.2 del protocolo presentado aquí). Las condiciones proporcionan aquí son suficientes para visualizar una proteína expresada con niveles de media a alta expresión. Si el lector está trabajando con proteínas mal expresadas o varias condiciones posttreatment, tales como múltiples immunoprecipitations, es necesario aumentar el tamaño del plato o número de células adecuado.
Para la persecución de pulso de suspensión, las muestras de chase tomadas en cada momento se toman de un solo tubo de células. Los pasos de lavado después de que el pulso se omiten; en cambio, más incorporación de 35S es prevenida por dilución con un alto exceso de cisteína y metionina sin etiqueta.
Los protocolos presentados usan radiactivos 35S etiquetado cisteina y metionina para seguir procesos de plegamiento de proteínas celulares. Todas las operaciones con reactivos radiactivos deben realizarse utilizando medidas de protección adecuadas para reducir al mínimo cualquier exposición del operador y el medio ambiente a la radiación radiactiva y realizarse en un laboratorio designado. Pulso-persiga etiquetado técnica es relativamente ineficaz en tiempos de pulso corto (< 15 min), menos del 1% de la cantidad a partir de la radiactividad se incorpora en las proteínas recién sintetizadas. Después el enriquecimiento de la proteína mediante inmunoprecipitación de blanco, la muestra para SDS-PAGE contiene menos de 0.05% de la cantidad inicial de radiactividad.
Aunque los 35S metionina y cisteína etiquetado mezcla se estabiliza, se producirá cierta descomposición, produciendo compuestos radiactivos. Para proteger el investigador y el aparato, se deben tomar algunas precauciones. El investigador siempre debe obedecer a las normas de seguridad de radiación local y puede llevar carbón y una máscara, además de una bata de laboratorio y guantes (doble) de enfermería. Los frascos de stock con 35S metionina y cisteína siempre deben abrirse en una campana de humos, o bajo un punto de aspiración local. Puntos de contaminación de laboratorio conocidas son centrífugas, pipetas, baños, incubadoras y agitadores. La contaminación de estas áreas se reduce mediante el uso de puntas de pipeta con filtro de carbón, tubos de microcentrífuga de sello positivo (véase Tabla de materiales), esponjas de carbón de acuario de agua baños, carbón filtro papeles pegados en los platos de Pulso-persiga, protector de carbón en el sistema de aspiración y la colocación de platos que contienen carbón granos en incubadoras y recipientes de almacenamiento.
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Protocol
Todos los procedimientos y reactivos radiactivos se manejaron con arreglo a las normas y reglas locales de radiación de la Universidad de Utrecht.
1. pulso Chase
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Pulso Chase para células adherentes
Nota: Los volúmenes dados aquí se basan en platos de cultivo celular 60 mm. Para 35 mm o 100 mm platos, multiplicar los volúmenes por 1/2 o 2, respectivamente. Este protocolo utiliza un tiempo de pulso de tiempos de 0, 15, 30, 60, 120 y 240 min 10 min y chase. Estos pueden variar dependiendo de las proteínas específicas estudiadas (discutidas abajo).- Las células adherentes (por ejemplo, HEK 293, HeLa, CHO) de la semilla en seis platos de cultura de célula de 60 mm para que sean subconfluent (80% - 90%) en el día de la persecución del pulso. Utilice al menos uno de los platos por momento y condición.
- Si es necesario, transfectar las células con reactivos de transfección comercialmente disponibles según las instrucciones del fabricante; o virus transduce8 las células 1 día antes del pulso-persiga experimentan con la estructura adecuada para la expresión.
- Lavar los platos con 2 mL de tampón de lavado (Hank equilibrada solución de sal [HBSS]), agregar 2 mL de medio de hambre (normal medio de cultivo carece de metionina y cisteína y suero bovino fetal [SBF], como medio esencial mínimo [MEM] sin metionina y cisteína pero con 10 mM HEPES, pH 7,4) y colocar los platos en una incubadora humidificada de 37 ° C con 5% CO2 durante 15 minutos.
- Transferir los platos a las barras en un baño de agua precalentado 37 ° C para que estén en contacto con agua, pero no flotar. Iniciar un temporizador.
- A los 40 s, aspirar el medio de la inanición, elaborar 600 μl de solución de pulso (hambre media + 55 plato μCi/35 mm etiqueta, véase la nota anterior paso 1.1.1) con la pipeta y agregarla suavemente al centro del plato en exactamente 1 minuto repetir este paso en intervalos de 1 minuto para t platos restantes. Comience con la mayor muestra de chase para ahorrar tiempo durante el experimento.
Nota: Cuando se maneja material radioactivo, es esencial seguir las precauciones apropiadas y normas y regulaciones locales para prevenir la exposición accidental y contaminación. - En exactamente 11 minutos para todos los platos siguientes, excepto la muestra de la persecución de 0 min, agregar 2 mL de medio de chase directamente al plato, aspirarlo y otra vez, añadir 2 mL de medio de chase. Repetir a intervalos de 1 minuto para platos restantes. Transferir todos los platos a una incubadora de 37 ° C.
- Exactamente 16 min, agregar 2 mL de medio de chase (medio de cultivo normal + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM cisteína y metionina de 5 mM) directamente en el plato de muestra de 0 min encima medio pulso deje de etiquetado; Luego, aspirar inmediatamente, transferir el plato a una placa de aluminio refrigerado por y añadir 2 mL de tampón de helada parada (HBSS + 20 mM N- etilmaleimida [NEM]).
Nota: Esta es la muestra de la persecución de 0 min. Para esta muestra, proceder directamente a paso 1.1.9. - Transferir cada plato de chase a baño María 2 min antes de cada tiempo de persecución (p. ej., 24 min para una persecución de 15 min) y, en el momento de la persecución exacta (por ejemplo, 26 min para una persecución de 15 min), aspirar los medios de comunicación de chase (o transferir a un tubo de microcentrífuga si pr otein secreción) y el plato se transfieren a una placa de aluminio refrigerado. Añadir 2 mL de helado Tope amortizante.
- Incubar todos los platos en el hielo en el Tope amortizante de ≥5 min; Luego, aspirar la solución y lavar con 2 mL de solución de parada fría. Aspire el lavado y lyse platos con 600 μl de tampón de lisis (tampón fosfato salino [PBS] + nondenaturing detergente [véase Tabla de materiales] inhibidores de la proteasa + 20 mM NEM). Use un raspador celular para asegurar que los platos son lisis cuantitativo.
- Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar durante 10 min a 15.000-20.000 x g y 4 ° C para que sedimenten los núcleos.
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Persecución de pulso para la suspensión de las células
Nota: Para garantizar un etiquetado eficaz, deben ser pulsadas células a una concentración de 3 x 106 a 5 x 106 células/mL y volúmenes de persecución deben ser 4 x el volumen de pulso. En el siguiente ejemplo, hemos pulsado 5 x 106 células en un volumen de 1 mL por 10 min, para producir cinco perseguir tiempo puntos (0, 15, 30, 60 y 120 min) de 1 mL, que contiene 1 x 106 células por momento. Todas las soluciones son las mismas que en la sección 1.1.- Las células de suspensión (p. ej., 3T3, Jurkat) según un protocolo previamente publicados9 la cultura por lo que hay un número suficiente de células en el momento del experimento, por lo menos 1 x 106 células por tiempo punto o condición.
- Si es necesario, transfectar las células con reactivos de transfección comercialmente disponibles según las instrucciones del fabricante, o virus transduce8 las células 1 día antes del pulso-persiga experimentan con la estructura adecuada para la expresión.
- 5 x 106 células por condición en un tubo de 50 mL por 5 min a x 250 g a temperatura ambiente de la pelotilla, lavar 1 x con 5 mL de medio de hambre, otra vez de los pellets y resuspender en 1 mL de medio de hambre.
- Transferir las células a un baño de agua de 37 ° C e incubarlos de 10-25 minutos agitar los tubos cada 10-15 minutos para evitar que las células de colocar en la parte inferior.
- Iniciar el temporizador. En exactamente 1 minuto, añada 275 μCi (55 μCi/1 x 106 células) de etiqueta sin diluir directamente en el tubo que contiene las células y agitar para mezclar.
Nota: Cuando se maneja material radioactivo, es esencial seguir las precauciones apropiadas y normas y regulaciones locales para prevenir la exposición accidental y contaminación. - En exactamente 11 minutos, parada de etiquetado añadiendo 4 mL de medio de chase. Mezcle la muestra e inmediatamente transferir 1 mL a un tubo de 15 mL en hielo, que contiene 9 mL de solución de parada fría.
Nota: Esta es la muestra de la persecución de 0 min. - Repita estos pasos para cada punto de tiempo sucesivos. Una vez recopilados todos los puntos de tiempo, sedimenten las células durante 5 minutos a 250 x g a 4 ° C. Aspire el medio (o transferir a un nuevo tubo de 15 mL si después de la secreción de la proteína). Lavar las células con 5 mL de solución de parada y sedimenten las células durante 5 minutos a 250 x g a 4 ° C.
- Aspire la solución de parada, totalmente lyse las células con 300 μL de tampón de lisis helada e incubar por 20 min en hielo para garantizar una lisis completa. Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar durante 10 min a 15.000-20.000 x g a 4 ° C para que sedimenten los núcleos.
2. inmunoprecipitación
- Combina el anticuerpo (véase la discusión) y 50 μl de inmunoprecipitación granos (p. ej., proteína A-sefarosa) (10% suspensión [v/v] en tampón de lisis + 0.25% albúmina de suero bovino [BSA]) en una microcentrífuga tubo e incubar a 4 ° C por 30 min en una coctelera Boston.
- Los granos durante 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente de la pelotilla y aspirar el sobrenadante. Añadir 200 μL de lisado a la mezcla de grano de anticuerpo e incubar a 4 ° C en un agitador de 1 h o cabeza sobre cabeza si requiere la inmunoprecipitación > 1 h.
- De pellets los granos durante 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y agregar 1 mL de tampón de lavado de inmunoprecipitación. Colocar la muestra en un agitador a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Los granos de la pelotilla como se describe en el paso 2.3 y repetir el lavado 1 x. A continuación, aspirar el sobrenadante y resuspender las cuentas en 20 μl de tampón TE pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vórtice de la muestra.
- Añadir 20 μl de 2 x de buffer de muestra sin el agente de reducción, vortex, calentar por 5 min a 95 ° C y agitar nuevamente.
Nota: Si sólo preparar muestras reductoras, 2 μl de 500 mM DTT se debe agregar en este punto. A continuación, proceda al paso 2.7. - Como se describe en el paso 2.3 de pellets los granos. Transferencia de 19 μl del sobrenadante nonreduced a un tubo de microcentrífuga fresco que contiene 1 μl de 500 mM DTT, centrifugar la muestra y vortex antes de calentar por 5 min a 95 ° C nuevamente.
- Desactivación de la muestra durante 1 min a 12.000 x g; se trata de la muestra reducida. Enfriar a temperatura ambiente y añadir 1,1 μl de 1 M NEM a la reducción y la muestra nonreduced. Vórtice y giro de las muestras.
3. SDS-PAGE
- En primer lugar, determinar el apropiado SDS-PAGE resolución gel porcentaje de la proteína de interés. Por ejemplo, HIV-1 gp120, cuando deglycosylated, a ~ 60 kDa y se analiza en un gel de 7,5%.
- Preparar la mezcla de gel de resolución sin TEMED según las instrucciones del fabricante (x % acrilamida, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] SDS 0.1% [p/v] y 0.05% persulfato de amonio [APS] [w/v]) y desgasificación bajo vacío para > 15 minutos. Mientras que la desgasificación de la mezcla de gel, bien limpiar las placas de vidrio gel con etanol al 70% y los tejidos libres de pelusas y colocarlos en un aparato de fundición.
- Añadir TEMED a la mezcla de gel de resolución (en una concentración final de 0.005% [v/v]), homogeneizar y pipeta entre placas de vidrio, dejando de ~1.5 cm para el gel de apilamiento. Cuidadosamente el gel con desionizada H2O o isopropanol del recubrimiento y dejar polimerizar.
- Una vez que el gel de resolución ha polimerizado, preparar la mezcla de gel de apilamiento (4% de acrilamida, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], SDS 0.1% [p/v] y 0.025% APS [p/v]).
- Lave la parte superior del gel de resolución con desionizada H2O y, a continuación, quitar toda el agua.
Nota: Utilice papel de filtro para eliminar las últimas gotas. - Añadir TEMED a la mezcla de gel de apilamiento (0,005% [v/v]), mezclar bien y el gel de resolución con el gel de apilamiento del recubrimiento e inserte un peine de 15 pozos. Una vez que ha polimerizado el gel de apilamiento, traslado a una cámara de ejecución y llenar las cámaras superiores e inferiores con el almacenador intermediario de funcionamiento (25 mM Tris-HCl, glicina 192 mM [pH 8.3] y 0.1% SDS [p/v]).
- Cargar 10 μl de muestra por carril en un minigel de 15 carriles. Evitar cargar las muestras en el primer y el último carril en el gel y el tampón de muestra nonreducing en todos los carriles vacíos para evitar que la sonrisa de bandas de carga. Corren los geles constante 25 mA/gel hasta el frente de tinte es en la parte inferior del gel.
- Retire el gel de las placas de vidrio, teñir los geles con solución de tinción de proteínas (10% de ácido acético y metanol 30% H2O + brillante 0.25% azul R250 [w/v]) durante 5 minutos con agitación y luego, desmanchar por 30 min con extracción (coloración de la solución solución sin R250 azul brillante).
- Organizar los geles boca abajo sobre un plástico abrigo y, luego, coloque papel de cromatografía de 0.4m m encima de ellos. Ponga el gel sandwich cromatografía en papel-lado abajo en un gel secador. Siguiendo las instrucciones del fabricante, secar los geles por 2 h a 80 ° C.
- Transferir los geles secos en una casete y recubrimiento con pantalla de cine o fósforo de autorradiografía. Si usan la película de autorradiografía, este paso debe realizarse en un cuarto oscuro.
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Representative Results
El plegamiento y la secreción de la gp120 del VIH-1 de una persecución de pulso adherente se muestra en la figura 2. El gel nonreducing (Nº de células en la figura) muestra el plegamiento oxidativo de gp120. Inmediatamente después del pulso de etiquetado de gp120 de 5 min (min 0 chase) aparece como una banda difusa en el gel, y conforme avanza la persecución, la banda migra por el gel a través de la aún más difundida plegamiento intermedios (IT) hasta que se acumula en la banda estrecha (NT) representa gp120 forma nativa plegada. Esto ocurre a medida que la formación de enlaces disulfuro aumenta la compacidad de la proteína, haciendo que migran más rápido que la proteína completamente reducida. En el gel reductor (células R en la figura), el disulfuro de todas las formas se han reducido tal que, en todo momento de la persecución, no afectan movilidad. Esto permite el análisis de otras modificaciones. El cambio en el tiempo de Ru a Rc representa el clivaje postraduccional de péptido señal de gp120: la movilidad aumenta debido a la pérdida del péptido señal, que aumenta durante la persecución como proteínas más alcanzan el pliegue natural y pierden su péptido señal. En el gel nonreducing y reducir la señal comienza a disminuir de ~ 1 h adelante debido a la secreción de gp120. Esto puede controlarse mediante el análisis de los medios de comunicación (media en la figura). Una comparación de los geles nonreducing y reducción revela cambios de Enlace disulfuro y eliminación del péptido señal. Esto sólo fue posible porque otra modificación, N-ligado glycosylation y glicanos modificaciones, fueron sacados de gp120 (y análisis) por digestión con endoglycosidase H justo antes de SDS-PAGE.
El tráfico de la cadena pesada μ de la inmunoglobulina M (IgM) de una persecución de pulso de la suspensión se muestra en la figura 3. Un cambio en el tiempo de HCER a HCGolgi representa el tráfico de la cadena μ desde ER hasta el Golgi, que precede a la secreción de la célula. Este cambio en la masa molecular es causada por la modificación de glycans N-ligados en el Golgi.
Figura 1 : Esquema del protocolo para pulso chase, inmunoprecipitación y SDS-PAGE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Plegamiento y la secreción de gp120 de HIV-1, determinado por el pulso adherente persiga. Platos de 60 mm subconfluente de células HeLa expresión de gp120 del VIH-1 fueron pulso marcado por 10 min y perseguida por la indicada veces. Después de la inmunoprecipitación de gp120, las muestras se deglycosylated y se analizaron usando un gel de SDS-PAGE de 7,5%. SE = intermediarios de plegamiento; NT = nativo gp120; RU = reducido gp120 uncleaved de péptido señal; RC = reducción gp120 troceados de péptido señal; NR: = nonreducing; R = reducción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Trata de la cadena pesada de IgM, determinado por la persecución de pulso suspensión. 5 x 106 I.29 μ+ B células eran pulso marcado por 5 min y perseguida por la indicada veces. Después de inmunoprecipitación, las muestras fueron analizadas usando un gel de SDS-PAGE 10%. HC = cadena pesada de la inmunoglobulina μ; LC = cadena ligera de inmunoglobulina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pulso-persiga métodos han sido esenciales para el desarrollo de la comprensión de los científicos del plegamiento en las células intactas de la proteína. Mientras que hemos intentado ofrecer un método que es tan general como sea posible, este enfoque tiene el potencial de las variaciones casi ilimitadas estudiar varios procesos que ocurren durante el plegamiento, el transporte y la vida de las proteínas dentro de la célula.
Cuando se realiza una persecución de pulso utilizando células adherentes en platos, es esencial para el tratamiento de cada plato de la misma medida de lo posible, como un plato separado se utiliza para cada punto del tiempo o condición en un experimento. Especialmente para tiempos cortos de pulso y chase (< 5 min), es esencial para mantener un estricto control sobre los tiempos de pulso y chase (con un temporizador digital). Secuencias de pulso con las células de suspensión pueden ayudar a reducir esta variabilidad como todas las muestras se toman de un solo tubo. Como algunos tipos de células adhieren menos bien a los platos de la cultura que otros, se debe tener cuidado para asegurar que las células no se lavan lejos durante los distintos cambios del medio. Esto se puede solucionar mediante estas células en suspensión o los platos con poli L lisina o gelatina, por ejemplo, la capa que se adhieran a las células a los platos de la cultura. Para medir la reproducibilidad de etiquetado entre platos, debe examinarse una muestra del lisado por SDS-PAGE para verificar todas las muestras de patrón idéntico de etiquetado y de la proteína total. Por otra parte, recuento de centelleo líquido de lisados establecerá el total cuentas por minuto (cpm) incorporado pero no proporcionará información sobre la población de proteína marcada.
Si una proteína diana etiquetas mal, la señal se incrementa al aumentar el número de células (o platos) en lugar de aumentando la cantidad de la etiqueta. Alargar el tiempo de pulso es una opción cuando la cinética del proceso estudiado lo permitirá. El tiempo de pulso ideal variará con cada destino debido a factores como el nivel de expresión, la tasa de transcripción, el número de methionines/cisteínas y la tasa de plegamiento de la proteína. Como tal, la experimentación debe realizarse para determinar el mejor equilibrio entre los factores mencionados en cada experimento, manteniendo el objetivo experimental en mente. Si se están estudiando productos intermedios durante el plegado, por ejemplo, es deseable a pulso la etiqueta para tan brevemente una época como sea posible tener el material de partida a un estado desplegado como sea posible, y equilibrar los niveles de expresión. Alternativamente, si el transporte o la degradación de una proteína es el objetivo de estudio, tiempos de pulso pueden ser alargados para proporcionar los más altos niveles de señal posible sin comprometer la información cinética. En general, tiempos de pulso pueden variar de 2-15 min cuando se usa este protocolo sin modificación. Previa experimentación5 ha demostrado un tiempo de retraso de ~ 10 s después el pulso antes de la incorporación de radiactividad en la piscina de la proteína total; Esto es importante a tener en cuenta al derivar información cinética de Pulso-persiga los experimentos. De corto pulso veces (< 2 min), mantener todos los platos en el baño de agua durante el tiempo de pulso todo. Si amplía los tiempos de pulso (> 1 h) está siendo usado, es recomendable para aumentar el volumen del pulso en 1.5 veces y coloque los platos en un eje de balancín en una incubadora de 37 ° C durante el pulso para impedir que los platos se sequen. Si bien existen soluciones de etiquetado que contiene los 35S-metionina/cisteína o una mezcla, la mezcla se prefiere incluso cuando proteínas que sólo contienen metionina o cisteína están siendo etiquetadas como ambas cosas son necesarias para mantener la síntesis de proteínas generales en la célula. Si las condiciones experimentales requieren etiquetado específico de metionina/cisteína, los niveles de metionina/cisteína no radiactiva durante el pulso deben modificarse en consecuencia.
Chase veces (y el número de puntos de tiempo) se determinan de manera similar. Un buen punto de partida es la primera vez de chase (después de la persecución de 0 min) como igual al tiempo de pulso y, a continuación, doble la cantidad de tiempo para cada punto del tiempo sucesivos (p. ej., 5, 10, 20 y 40 min). Sin embargo, esto debe ser optimizado para cada proteína específica y pregunta.
Para evitar la activación de respuestas de estrés por inanición (que puede afectar a la síntesis de proteínas y plegables), idealmente, deben agregarse a las soluciones de inanición y radiolabeling algunos sin etiqueta de metionina y cisteína. La cantidad dependerá de la línea celular, el tiempo de etiquetado, cantidad de radiomarcaje utilizado y volúmenes de medios de comunicación y necesita pruebas. Un buen punto de partida es el 1% de la cantidad de cisteína y metionina, presente en el medio de cultivo celular, que puede incrementarse con el aumento de tiempos de pulso. Períodos de hambre, ya sea con o sin aminoácidos sin etiqueta, se debe tener en el rango de 15-30 min para garantizar la incorporación de la etiqueta adecuada y evitar la activación de respuestas de estrés. Cuando se utiliza un pulso largo (≥1 h), el hambre no es necesario.
El tampón de lisis se describe aquí será conveniente para la mayoría de los casos, pero en principio, cualquier sistema de tampón HEPES, Tris o MES, funcionará. La concentración de detergente necesaria para lyse las células dependerá del número de células y volumen de detergente. La concentración debe ser siempre por encima de la concentración micelar crítica (CMC) y la cantidad de detergente suficiente para lisar las células. Una regla empírica es que 200 μL de detergente nondenaturing 0.5% (véase Tabla de materiales) es suficiente para lisar el equivalente celular ~ 1 mg de proteína (~ 1 x 106 células). La concentración de sales y detergentes también pueden variar según la aplicación, pero en general, condiciones que abren núcleos (sal alta, > 0.1% SDS) debe evitarse ya que la presencia de DNA libre interferirá en la inmunoprecipitación. Si esto no se puede evitar, por ejemplo, cuando los lysates de la célula completa incluyendo núcleos o concentrados de proteínas necesitan ser analizados, ADN puede ser esquilado por pasar las células a través de una aguja de pequeño calibre antes de inmunoprecipitación. Esto se prefiere sobre la sonicación para evitar la formación excesiva de espuma y la producción de aerosoles radiactivos.
Por inmunoprecipitación, la cantidad óptima de anticuerpos y la mejor solución de lavado para cada combinación antígeno-anticuerpo deben probarse cuidadosamente para lograr un equilibrio entre la señal deseada del antígeno y el fondo. Los anticuerpos siempre deben estar presentes en exceso sobre los antígenos para la inmunoprecipitación cuantitativa; un buen punto de partida es 1 μg de anticuerpos por inmunoprecipitación de un plato de 35 mm/1 x 106 células. El fondo puede reducirse aumentando el detergente o concentraciones de sal. En particular, la adición de ≤0. 1% SDS puede ayudar a reducir el fondo pero también puede interrumpir las interacciones antígeno-anticuerpo. Control de la especificidad de los anticuerpos durante la inmunoprecipitación, células idénticas que carecen de la proteína diana deben utilizarse cuando esté disponible. Si esto no es sencillo, como cuando proteínas endógenas están siendo analizadas, la sobreexpresión o agotamiento del antígeno va a funcionar. A fondo (y especificidad), ya sea suero preinmunizados sueros control (siempre que sea posible) o se deben utilizar controles de isotipo. Para el control de antígenos atar directamente a las cuentas de inmunoprecipitación, granos sin anticuerpo puede usarse también. Las condiciones establecidas aquí deben considerarse como punto de partida cada par antígeno-anticuerpo requiere una optimización de tampón de lavado y las condiciones de lavado. En caso de mucho fondo, no aumentan el número de lavados sino más bien el tiempo de lavado o la composición de la solución de lavado. Si las interacciones particularmente sensibles tales como en coimmunoprecipitations tienen que tratarse, puede ser preferible para llevar a cabo todos los pasos de lavado a 4 ° C, usando buffers heladas.
Una de las ventajas de las células adherentes sobre las células de suspensión es esa droga que tratamientos se pueden realizar en prácticamente cualquier punto durante la persecución de pulso. Si se utiliza con inhibidores de la acompañante, por ejemplo, es posible distinguir sus efectos en las co - versus posttranslational fases de un proceso de doblado. Esto puede ampliarse mediante la adaptación de los buffers de lavado lisis y la inmunoprecipitación (discutidos arriba) para permitir la coimmunoprecipitation de complejos de proteína-acompañante durante plegable10,11,12.
El tratamiento postlysis de las muestras ampliará el alcance de las preguntas que pueden abordarse. La digestión de proteasa limitada de proteínas de la blanco antes de inmunoprecipitación proporcionará información conformacional adicional y se ha utilizado con éxito para controlar el plegamiento de las proteínas, especialmente aquellos que carecen de enlaces disulfuro13, 14. Agregación de proteínas y formación de complejos pueden controlarse mediante centrifugación del gradiente de densidad de sacarosa antes de inmunoprecipitación15,16.
Para aprovechar al máximo de secuencias de pulso, la disponibilidad de reactivos de alta calidad se requiere para immunoprecipitations. Al examinar el plegamiento intermedios, es esencial tener anticuerpos que son capaces de tirar abajo todas las formas de la proteína bajo análisis. Si no hay anticuerpos específicos contra la proteína diana, puede sustituirse por medio de etiquetas de afinidad. Sin embargo, esto limita seriamente la utilidad de los métodos postlysis, como la proteolisis limitada, a la sonda directamente la conformación de la proteína, ya pueden recuperar sólo fragmentos de etiquetado.
La sensibilidad de las secuencias de pulso está limitada por el número de residuos de cisteína y metionina de la proteína en cuestión. Proteínas con números bajos de residuos de metionina/cisteína, juntados con un nivel bajo de expresión son imperceptibles en Pulso-persiga los experimentos. Al realizar modificaciones postlysis como proteólisis limitada, fragmentos metionina/cisteína-que contiene sólo será perceptibles.
Para concluir, dado el detalle cinético que pulso persigue proporcionar, son complementarios a muchas otras técnicas y herramientas utilizadas para el estudio de biología molecular de la célula a nivel de estado estacionario. Como tal, siguen siendo un componente valioso en la caja de herramientas del biólogo molecular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores gracias a todos los miembros del laboratorio Braakman, pasado y presentan, para sus discusiones fructíferas y ayudan en el desarrollo de los métodos presentados en este artículo. Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de investigación en séptimo programa marco (FP7/2007-2013) N ° de la Unión 235649 y la organización de países bajos de investigación científica (NWO) bajo el eco-programa N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
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- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
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- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
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