Summary

कैंसर में सेलुलर Phenotypes पर Microenvironmental प्रभाव पूछताछ करने के लिए Microarrays का उपयोग

Published: May 21, 2019
doi:

Summary

यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य यह दिखाने के लिए है कि कैसे microenvironment microarrays (MEMA) गढ़ा जा सकता है और सुसंस्कृत कोशिकाओं के phenotype पर सरल combinatorial microenvironments के हजारों के प्रभाव से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया.

Abstract

कोशिकाओं के फीनोटाइप पर सूक्ष्म पर्यावरण के प्रभाव को समझना एक कठिन समस्या है क्योंकि विवो में सूक्ष्म पर्यावरण में घुलनशील विकास कारकों और मैट्रिक्स-संबद्ध प्रोटीन दोनों के जटिल मिश्रण के कारण एक कठिन समस्या है। इसके अलावा, इन विट्रो में microenvironments के मॉडलिंग के लिए आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों आम तौर पर प्रोटीन है कि अधूरी परिभाषित कर रहे हैं और बैच से बैच परिवर्तनशीलता से पीड़ित जटिल मिश्रण का उपयोग. microenvironment microarray (MEMA) मंच एक परख में सेलुलर phenotypes पर उनके प्रभाव के लिए microenvironment प्रोटीन के सरल संयोजन के हजारों के आकलन के लिए अनुमति देता है. MEMAs अच्छी तरह से प्लेटों में तैयार कर रहे हैं, जो व्यक्तिगत ligands के अलावा सरणी extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन युक्त कुओं को अलग करने के लिए अनुमति देता है. प्रत्येक मुद्रित ECM के साथ घुलनशील लिगंड का संयोजन एक अद्वितीय संयोजन रूपों. एक ठेठ MEMA परख से अधिक शामिल 2,500 अद्वितीय combinatorial microenvironments कि कोशिकाओं को एक परख में उजागर कर रहे हैं. एक परीक्षण के मामले के रूप में, स्तन कैंसर सेल लाइन MCF7 MEMA मंच पर चढ़ाया गया था. इस परख के विश्लेषण कारकों की पहचान की है कि दोनों को बढ़ाने और वृद्धि और इन कोशिकाओं के प्रसार को बाधित. MEMA मंच अत्यधिक लचीला है और कैंसर अनुसंधान से परे अन्य जैविक सवालों के साथ उपयोग के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Introduction

दो आयामी (2 डी) monolayers में प्लास्टिक पर कैंसर सेल लाइनों की Culturing कैंसर शोधकर्ताओं के लिए प्रमुख workhorses में से एक बनी हुई है. हालांकि, microenvironment तेजी से सेलुलर phenotypes को प्रभावित करने की क्षमता के लिए मान्यता प्राप्त किया जा रहा है. कैंसर में, ट्यूमर microenvironment कई सेलुलर व्यवहार को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, विकास सहित, अस्तित्व, आक्रमण, और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया1,2. पारंपरिक monolayer सेल संस्कृतियों आम तौर पर microenvironment प्रभावों की कमी है, जो अधिक जटिल तीन आयामी (3 डी) assays के विकास के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए नेतृत्व किया है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध तहखाने झिल्ली अर्क सहित. हालांकि, इन शुद्ध matrices आम तौर पर उपयोग करने के लिए जटिल हैं और बैच परिवर्तनशीलता3 और जटिल रचनाओं3के रूप में तकनीकी समस्याओं से ग्रस्त हैं. परिणामस्वरूप, विशिष्ट प्रोटीनों को फ़ंक्शन असाइन करना कठिन हो सकता है जो कोशिकीय फीनोटाइप्स3को प्रभावित कर सकता है।

इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने माइक्रोएमेंटेरेन माइक्रोरेरे (एमईएमए) तकनीक विकसित की है, जोमाइक्रोएमेंटेंस को अपचारी मैट्रिक्स (ईसीएम) और घुलनशील वृद्धि कारक प्रोटीन 4, 5 के सरल संयोजन ों तक कम कर देता है। . MEMA मंच प्रमुख microenvironmental कारकों है कि कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित की पहचान सक्षम बनाता है. एक सरणी प्रारूप का उपयोग करके, microenvironment कारकों के संयोजन के हजारों एक ही प्रयोग में परख किया जा सकता है. यहाँ वर्णित MEMA 2,500 विभिन्न अद्वितीय microenvironment शर्तों पूछताछ. ईसीएम प्रोटीन अच्छी तरह से प्लेटों में मुद्रित विकास पैड जिस पर कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जा सकता है फार्म. घुलनशील ligands व्यक्तिगत कुओं में जोड़ रहे हैं, प्रत्येक अलग जगह है जो कोशिकाओं को उजागर कर रहे हैं पर अद्वितीय combinatorial microenvironments (ECM + ligand) बनाने. कोशिकाओं को कई दिनों के लिए सुसंस्कृत कर रहे हैं, तो तय, दाग, और इन विशिष्ट microenvironment संयोजन के लिए जोखिम का एक परिणाम के रूप में सेलुलर phenotypes का आकलन करने के लिए छवि. चूंकि microenvironments सरल संयोजन कर रहे हैं, यह प्रोटीन है कि कोशिकाओं में प्रमुख phenotypic परिवर्तन ड्राइव की पहचान करने के लिए सीधा है. MEMAs सफलतापूर्वक कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि कई सेलुलर phenotypes को प्रभावित, उन है कि सेल भाग्य निर्णय ड्राइव और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया सहित4,5,6,7. इन प्रतिक्रियाओं को सरल 2 D प्रयोगों में मान्य किया जा सकता है और फिर उन परिस्थितियों में मूल्यांकन किया जा सकता है जो ट्यूमर माइक्रोएमेंम्पवायरन की जटिलता को फिर से दोहराते हैं। MEMA मंच अत्यधिक सेल प्रकार और समापन बिंदु की एक किस्म के लिए अनुकूल है, बशर्ते कि अच्छा phenotypic biomarkers उपलब्ध हैं.

Protocol

नोट: अनुमानित समय सहित संपूर्ण MEMA प्रक्रिया का ओवरव्यू चित्र 1में दर्शाए गए प्रवाह आरेख में रेखांकित किया गया है। इस प्रोटोकॉल 8 अच्छी प्लेटों में MEMAs के निर्माण का विवरण. प्रोटोकॉल अन्?…

Representative Results

सेल विकास और प्रसार पर microenvironmental प्रभावों को सरल बनाने के लिए और शर्तों है कि बढ़ावा दिया या सेल विकास और प्रसार को बाधित की पहचान करने के लिए, स्तन कैंसर सेल लाइन MCF7 आठ 8 अच्छी तरह से MEMAs के एक सेट पर बीज के रूप ?…

Discussion

“आयामीता” और संदर्भ के महत्व microenvironment11के साथ उनकी बातचीत के माध्यम से कैंसर की कोशिकाओं की विशेषता में उपकरण के रूप में इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों के विकास में एक प्रेरित कारक रहा है , और इन विट…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम नेटवर्क सेलुलर हस्ताक्षर (LINCS) अनुदान HG008100 (J.W.G., L.M.H., और J.E.K.) के NIH आम निधि पुस्तकालय द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Aushon 2470 Aushon BioSystems Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA Nikon High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler BioTek liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution Sigma T2069
EDTA Invitrogen 15575-038
Glycerol Sigma G5516
Triton X100 Sigma T9284
Tween 20 Sigma P7949
Kolliphor P338 BASF 50424591
384-well microarray plate, cylindrical well Thermo Fisher ab1055
Nunc 8 well dish Thermo Fisher 267062
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Science 15710
BSA Fisher BP-1600
Sodium Azide Sigma S2002
Cell Mask Molecular Probes H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor Molecular Probes C10357
DAPI Promo Kine PK-CA70740043
ALCAM R & D Systems 656-AL ECM
Cadherin-20 (CDH20) R & D Systems 5604-CA ECM
Cadherin-6 (CDH6) R & D Systems 2715-CA ECM
Cadherin-8 (CDH8) R & D Systems 188-C8 ECM
CD44 R & D Systems 3660-CD ECM
CEACAM6 R & D Systems 3934-CM ECM
Collagen I Cultrex 3442-050-01 ECM
Collagen Type II Millipore CC052 ECM
Collagen Type III Millipore CC054 ECM
Collagen Type IV Sigma C5533 ECM
Collagen Type V Millipore CC077 ECM
COL23A1 R & D Systems 4165-CL ECM
Desmoglein 2 R & D Systems 947-DM ECM
E-cadherin (CDH1) R & D Systems 648-EC ECM
ECM1 R & D Systems 3937-EC ECM
Fibronectin R & D Systems 1918-FN ECM
GAP43 Abcam ab114188 ECM
HyA-500K R & D Systems GLR002 ECM
HyA-50K R & D Systems GLR001 ECM
ICAM-1 R & D Systems 720-IC ECM
Laminin Sigma L6274 ECM
Laminin-5 Abcam ab42326 ECM
Lumican R & D Systems 2846-LU ECM
M-Cad (CDH15) R & D Systems 4096-MC ECM
Nidogen-1 R & D Systems 2570-ND ECM
Osteoadherin/OSAD R & D Systems 2884-AD ECM
Osteopontin (SPP) R & D Systems 1433-OP ECM
P-Cadherin (CDH3) R & D Systems 861-PC ECM
PECAM1 R & D Systems ADP6 ECM
Tenascin C R & D Systems 3358-TC ECM
VCAM1 R & D Systems ADP5 ECM
vitronectin R & D Systems 2308-VN ECM
Biglycan R & D Systems 2667-CM ECM
Decorin R & D Systems 143-DE ECM
Periostin R & D Systems 3548-F2 ECM
SPARC/osteonectin R & D Systems 941-SP ECM
Thrombospondin-1/2 R & D Systems 3074-TH ECM
Brevican R & D Systems 4009-BC ECM
Elastin BioMatrix 5052 ECM
Fibrillin Lynn Sakai Lab OHSU N/A ECM
ANGPT2 RnD_Systems_Own 623-AN-025 Ligand
IL1B RnD_Systems_Own 201-LB-005 Ligand
CXCL8 RnD_Systems_Own 208-IL-010 Ligand
IGF1 RnD_Systems_Own 291-G1-200 Ligand
TNFRSF11B RnD_Systems_Own 185-OS Ligand
BMP6 RnD_Systems_Own 507-BP-020 Ligand
FLT3LG RnD_Systems_Own 308-FK-005 Ligand
CXCL1 RnD_Systems_Own 275-GR-010 Ligand
DLL4 RnD_Systems_Own 1506-D4-050 Ligand
HGF RnD_Systems_Own 294-HGN-005 Ligand
Wnt5a RnD_Systems_Own 645-WN-010 Ligand
CTGF Life_Technologies_Own PHG0286 Ligand
LEP RnD_Systems_Own 398-LP-01M Ligand
FGF2 Sigma_Aldrich_Own SRP4037-50UG Ligand
FGF6 RnD_Systems_Own 238-F6 Ligand
IL7 RnD_Systems_Own 207-IL-005 Ligand
TGFB1 RnD_Systems_Own 246-LP-025 Ligand
PDGFB RnD_Systems_Own 220-BB-010 Ligand
WNT10A Genemed_Own 90009 Ligand
PTN RnD_Systems_Own 252-PL-050 Ligand
BMP3 RnD_Systems_Own 113-BP-100 Ligand
BMP4 RnD_Systems_Own 314-BP-010 Ligand
TNFSF11 RnD_Systems_Own 390-TN-010 Ligand
CSF2 RnD_Systems_Own 215-GM-010 Ligand
BMP5 RnD_Systems_Own 615-BMC-020 Ligand
DLL1 RnD_Systems_Own 1818-DL-050 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 296-HR-050 Ligand
KNG1 RnD_Systems_Own 1569-PI-010 Ligand
GPNMB RnD_Systems_Own 2550-AC-050 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 350-NS-010 Ligand
IL15 RnD_Systems_Own 247-ILB-005 Ligand
TNF RnD_Systems_Own 210-TA-020 Ligand
IGFBP3 RnD_Systems_Own 675-B3-025 Ligand
WNT3A RnD_Systems_Own 5036-WNP-010 Ligand
PDGFAB RnD_Systems_Own 222-AB Ligand
AREG RnD_Systems_Own 262-AR-100 Ligand
JAG1 RnD_Systems_Own 1277-JG-050 Ligand
BMP7 RnD_Systems_Own 354-BP-010 Ligand
TGFB2 RnD_Systems_Own 302-B2-010 Ligand
VEGFA RnD_Systems_Own 293-VE-010 Ligand
IL6 RnD_Systems_Own 206-IL-010 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 351-FS-010 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 378-SM Ligand
IGFBP2 RnD_Systems_Own 674-B2-025 Ligand
SHH RnD_Systems_Own 1314-SH-025 Ligand
FASLG RnD_Systems_Own 126-FL-010 Ligand

References

  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  3. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  4. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
  5. Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
  6. Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
  7. Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  8. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  9. Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , (2013).
  10. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
  11. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  12. Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a “normal” cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
  13. Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
  14. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
  15. Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
  16. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).

Play Video

Cite This Article
Smith, R., Devlin, K., Kilburn, D., Gross, S., Sudar, D., Bucher, E., Nederlof, M., Dane, M., Gray, J. W., Heiser, L., Korkola, J. E. Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer. J. Vis. Exp. (147), e58957, doi:10.3791/58957 (2019).

View Video