कैंसर में सेलुलर Phenotypes पर Microenvironmental प्रभाव पूछताछ करने के लिए Microarrays का उपयोग
Summary
यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य यह दिखाने के लिए है कि कैसे microenvironment microarrays (MEMA) गढ़ा जा सकता है और सुसंस्कृत कोशिकाओं के phenotype पर सरल combinatorial microenvironments के हजारों के प्रभाव से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया.
Abstract
कोशिकाओं के फीनोटाइप पर सूक्ष्म पर्यावरण के प्रभाव को समझना एक कठिन समस्या है क्योंकि विवो में सूक्ष्म पर्यावरण में घुलनशील विकास कारकों और मैट्रिक्स-संबद्ध प्रोटीन दोनों के जटिल मिश्रण के कारण एक कठिन समस्या है। इसके अलावा, इन विट्रो में microenvironments के मॉडलिंग के लिए आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों आम तौर पर प्रोटीन है कि अधूरी परिभाषित कर रहे हैं और बैच से बैच परिवर्तनशीलता से पीड़ित जटिल मिश्रण का उपयोग. microenvironment microarray (MEMA) मंच एक परख में सेलुलर phenotypes पर उनके प्रभाव के लिए microenvironment प्रोटीन के सरल संयोजन के हजारों के आकलन के लिए अनुमति देता है. MEMAs अच्छी तरह से प्लेटों में तैयार कर रहे हैं, जो व्यक्तिगत ligands के अलावा सरणी extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन युक्त कुओं को अलग करने के लिए अनुमति देता है. प्रत्येक मुद्रित ECM के साथ घुलनशील लिगंड का संयोजन एक अद्वितीय संयोजन रूपों. एक ठेठ MEMA परख से अधिक शामिल 2,500 अद्वितीय combinatorial microenvironments कि कोशिकाओं को एक परख में उजागर कर रहे हैं. एक परीक्षण के मामले के रूप में, स्तन कैंसर सेल लाइन MCF7 MEMA मंच पर चढ़ाया गया था. इस परख के विश्लेषण कारकों की पहचान की है कि दोनों को बढ़ाने और वृद्धि और इन कोशिकाओं के प्रसार को बाधित. MEMA मंच अत्यधिक लचीला है और कैंसर अनुसंधान से परे अन्य जैविक सवालों के साथ उपयोग के लिए बढ़ाया जा सकता है.
Introduction
दो आयामी (2 डी) monolayers में प्लास्टिक पर कैंसर सेल लाइनों की Culturing कैंसर शोधकर्ताओं के लिए प्रमुख workhorses में से एक बनी हुई है. हालांकि, microenvironment तेजी से सेलुलर phenotypes को प्रभावित करने की क्षमता के लिए मान्यता प्राप्त किया जा रहा है. कैंसर में, ट्यूमर microenvironment कई सेलुलर व्यवहार को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, विकास सहित, अस्तित्व, आक्रमण, और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया1,2. पारंपरिक monolayer सेल संस्कृतियों आम तौर पर microenvironment प्रभावों की कमी है, जो अधिक जटिल तीन आयामी (3 डी) assays के विकास के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए नेतृत्व किया है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध तहखाने झिल्ली अर्क सहित. हालांकि, इन शुद्ध matrices आम तौर पर उपयोग करने के लिए जटिल हैं और बैच परिवर्तनशीलता3 और जटिल रचनाओं3के रूप में तकनीकी समस्याओं से ग्रस्त हैं. परिणामस्वरूप, विशिष्ट प्रोटीनों को फ़ंक्शन असाइन करना कठिन हो सकता है जो कोशिकीय फीनोटाइप्स3को प्रभावित कर सकता है।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने माइक्रोएमेंटेरेन माइक्रोरेरे (एमईएमए) तकनीक विकसित की है, जोमाइक्रोएमेंटेंस को अपचारी मैट्रिक्स (ईसीएम) और घुलनशील वृद्धि कारक प्रोटीन 4, 5 के सरल संयोजन ों तक कम कर देता है। . MEMA मंच प्रमुख microenvironmental कारकों है कि कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित की पहचान सक्षम बनाता है. एक सरणी प्रारूप का उपयोग करके, microenvironment कारकों के संयोजन के हजारों एक ही प्रयोग में परख किया जा सकता है. यहाँ वर्णित MEMA 2,500 विभिन्न अद्वितीय microenvironment शर्तों पूछताछ. ईसीएम प्रोटीन अच्छी तरह से प्लेटों में मुद्रित विकास पैड जिस पर कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जा सकता है फार्म. घुलनशील ligands व्यक्तिगत कुओं में जोड़ रहे हैं, प्रत्येक अलग जगह है जो कोशिकाओं को उजागर कर रहे हैं पर अद्वितीय combinatorial microenvironments (ECM + ligand) बनाने. कोशिकाओं को कई दिनों के लिए सुसंस्कृत कर रहे हैं, तो तय, दाग, और इन विशिष्ट microenvironment संयोजन के लिए जोखिम का एक परिणाम के रूप में सेलुलर phenotypes का आकलन करने के लिए छवि. चूंकि microenvironments सरल संयोजन कर रहे हैं, यह प्रोटीन है कि कोशिकाओं में प्रमुख phenotypic परिवर्तन ड्राइव की पहचान करने के लिए सीधा है. MEMAs सफलतापूर्वक कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि कई सेलुलर phenotypes को प्रभावित, उन है कि सेल भाग्य निर्णय ड्राइव और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया सहित4,5,6,7. इन प्रतिक्रियाओं को सरल 2 D प्रयोगों में मान्य किया जा सकता है और फिर उन परिस्थितियों में मूल्यांकन किया जा सकता है जो ट्यूमर माइक्रोएमेंम्पवायरन की जटिलता को फिर से दोहराते हैं। MEMA मंच अत्यधिक सेल प्रकार और समापन बिंदु की एक किस्म के लिए अनुकूल है, बशर्ते कि अच्छा phenotypic biomarkers उपलब्ध हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
“आयामीता” और संदर्भ के महत्व microenvironment11के साथ उनकी बातचीत के माध्यम से कैंसर की कोशिकाओं की विशेषता में उपकरण के रूप में इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों के विकास में एक प्रेरित कारक रहा है , और इन विट…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम नेटवर्क सेलुलर हस्ताक्षर (LINCS) अनुदान HG008100 (J.W.G., L.M.H., और J.E.K.) के NIH आम निधि पुस्तकालय द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
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