Summary

マイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調知る

Published: May 21, 2019
doi:

Summary

ここで提示される方法の目的は、マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)を作製し、培養細胞の表現型に対する何千もの単純な組み合わせ微小環境の影響を調べるために使用する方法を示すことです。

Abstract

細胞の表現型に対する微小環境の影響を理解することは、生体内の微小環境における可溶性成長因子とマトリックス関連タンパク質の両方の複雑な混合物による困難な問題である。さらに、インビトロでの微小環境のモデリングに容易に利用可能な試薬は、通常、不完全に定義され、バッチからバッチの変動に苦しむタンパク質の複雑な混合物を利用します。マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)プラットフォームは、単一のアッセイにおける細胞表現型への影響について、マイクロ環境タンパク質の数千もの単純な組み合わせの評価を可能にします。MEMAはウェルプレートで調製され、個々のリガンドをアレイされた細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を含むウェルを分離することができます。各印刷されたECMとの可溶性リガンドの組み合わせは、ユニークな組み合わせを形成します。典型的なMEMAアッセイには、細胞が単一のアッセイでさらされている2,500を超えるユニークな組み合わせ微小環境が含まれています。試験ケースとして、乳癌細胞株MCF7をMEMAプラットフォーム上でメッキした。このアッセイの分析は、これらの細胞の増殖および増殖を増強および阻害する因子を同定した。MEMAのプラットホームは非常に適用範囲が広く、癌の研究を超えて他の生物学的質問と使用するために拡張することができる。

Introduction

2次元(2D)単層におけるプラスチック上の癌細胞株の培養は、がん研究者にとって依然として主要な主力の1つである。しかし、微小環境は、細胞の型示しに影響を与える能力のためにますます認識されています。癌において、腫瘍微小環境は、成長、生存、侵侵入、および治療1、2への応答を含む複数の細胞行動に影響を与える知られている。従来の単層細胞培養は、通常、微小環境の影響を欠き、市販の精製基膜抽出物を含む細胞を成長させるより複雑な3次元(3D)アッセイの開発につながっている。しかし、これらの精製行列は、通常、使用が複雑であり、バッチ変動3や複雑な組成3などの技術的な問題に苦しむ。その結果、細胞表現型3に影響を与える可能性のある特定のタンパク質に機能を割り当てるのは困難な場合があります。

これらの限界に対処するため、微小環境マイクロアレイ(MEMA)技術を開発し、微小環境を細胞外マトリックス(ECM)と可溶性成長因子タンパク質単純な組み合わせにまで削減する4,5.MEMAプラットフォームは、細胞の挙動に影響を与える主要な微小環境因子の同定を可能にします。配列形式を使用することで、何千もの微小環境因子の組み合わせを1回の実験でアッセイすることができます。ここで説明するMEMAは、約2,500の異なるユニークな微小環境条件を尋問する。ウェルプレートに印刷されたECMタンパク質は、細胞を培養できる成長パッドを形成します。可溶性リガンドは個々のウェルに添加され、細胞が露出する各異なるスポットにユニークな組み合わせ微小環境(ECM +リガンド)を作成します。細胞は数日間培養され、次いで固定され、染色され、これらの特定の微小環境の組み合わせへの曝露の結果として細胞表現型を評価するために画像化される。微小環境は単純な組み合わせであるため、細胞の主要な現象的変化を駆動するタンパク質を特定するのは簡単です。MEMAは、細胞の運命決定と治療4、5、6、7への応答を駆動するものを含む、複数の細胞表現型に影響を与える因子を同定するために正常に使用されている。これらの応答は、単純な2D実験で検証することができ、腫瘍微小環境の複雑さをより完全に要約する条件下で評価することができます。MEMAプラットフォームは、良好なプノチピックバイオマーカーが利用可能である場合、様々な細胞タイプおよびエンドポイントに非常に適応可能です。

Protocol

注:MEMA プロセス全体の概要 (推定時間を含む) は、図 1に示すフロー図に概説されています。このプロトコルは、8ウェルプレートにおけるMEMAの製造について詳しく述べています。プロトコルは、他のプレートまたはスライドに適合してもよい。 1. タンパク質、希釈剤、染色バッファーの調製 EPM、リガンド、サイトカインのバイ?…

Representative Results

細胞増殖および増殖に対する微小環境影響を簡素化し、細胞増殖および増殖を促進または阻害する条件を同定するために、乳癌細胞株MCF7は、プロトコルに記載されている8ウェルMEMAのセットに播種した。このアッセイは、合計2736の組み合わせ微小環境条件のために、48の異なるEPMと57の異なるリガンドに細胞を曝露しました。培養71時間後、細胞をEdUでパルスし、固定、透過化、DAPI、EdU検出?…

Discussion

「次元性」と文脈の重要性は、微小環境11との相互作用を通じて癌細胞の特性評価のツールとしてのインビトロ培養システムの開発の動機付け要因となっている11、およびインビトロの能力インビボ環境を模倣する文化システムは、これらの文化システムを改善するための探求の原動力です。しかし、インビトロシステムは、単純化されたモデル12にインビ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIHコモン・ファンド・ライブラリー・オブ・ネットワーク・セルラー・シグネチャー(LINCS)助成金HG008100(J.W.G.、L.M.H.、J.E.K)によって支援されました。

Materials

Aushon 2470 Aushon BioSystems Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA Nikon High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler BioTek liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution Sigma T2069
EDTA Invitrogen 15575-038
Glycerol Sigma G5516
Triton X100 Sigma T9284
Tween 20 Sigma P7949
Kolliphor P338 BASF 50424591
384-well microarray plate, cylindrical well Thermo Fisher ab1055
Nunc 8 well dish Thermo Fisher 267062
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Science 15710
BSA Fisher BP-1600
Sodium Azide Sigma S2002
Cell Mask Molecular Probes H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor Molecular Probes C10357
DAPI Promo Kine PK-CA70740043
ALCAM R & D Systems 656-AL ECM
Cadherin-20 (CDH20) R & D Systems 5604-CA ECM
Cadherin-6 (CDH6) R & D Systems 2715-CA ECM
Cadherin-8 (CDH8) R & D Systems 188-C8 ECM
CD44 R & D Systems 3660-CD ECM
CEACAM6 R & D Systems 3934-CM ECM
Collagen I Cultrex 3442-050-01 ECM
Collagen Type II Millipore CC052 ECM
Collagen Type III Millipore CC054 ECM
Collagen Type IV Sigma C5533 ECM
Collagen Type V Millipore CC077 ECM
COL23A1 R & D Systems 4165-CL ECM
Desmoglein 2 R & D Systems 947-DM ECM
E-cadherin (CDH1) R & D Systems 648-EC ECM
ECM1 R & D Systems 3937-EC ECM
Fibronectin R & D Systems 1918-FN ECM
GAP43 Abcam ab114188 ECM
HyA-500K R & D Systems GLR002 ECM
HyA-50K R & D Systems GLR001 ECM
ICAM-1 R & D Systems 720-IC ECM
Laminin Sigma L6274 ECM
Laminin-5 Abcam ab42326 ECM
Lumican R & D Systems 2846-LU ECM
M-Cad (CDH15) R & D Systems 4096-MC ECM
Nidogen-1 R & D Systems 2570-ND ECM
Osteoadherin/OSAD R & D Systems 2884-AD ECM
Osteopontin (SPP) R & D Systems 1433-OP ECM
P-Cadherin (CDH3) R & D Systems 861-PC ECM
PECAM1 R & D Systems ADP6 ECM
Tenascin C R & D Systems 3358-TC ECM
VCAM1 R & D Systems ADP5 ECM
vitronectin R & D Systems 2308-VN ECM
Biglycan R & D Systems 2667-CM ECM
Decorin R & D Systems 143-DE ECM
Periostin R & D Systems 3548-F2 ECM
SPARC/osteonectin R & D Systems 941-SP ECM
Thrombospondin-1/2 R & D Systems 3074-TH ECM
Brevican R & D Systems 4009-BC ECM
Elastin BioMatrix 5052 ECM
Fibrillin Lynn Sakai Lab OHSU N/A ECM
ANGPT2 RnD_Systems_Own 623-AN-025 Ligand
IL1B RnD_Systems_Own 201-LB-005 Ligand
CXCL8 RnD_Systems_Own 208-IL-010 Ligand
IGF1 RnD_Systems_Own 291-G1-200 Ligand
TNFRSF11B RnD_Systems_Own 185-OS Ligand
BMP6 RnD_Systems_Own 507-BP-020 Ligand
FLT3LG RnD_Systems_Own 308-FK-005 Ligand
CXCL1 RnD_Systems_Own 275-GR-010 Ligand
DLL4 RnD_Systems_Own 1506-D4-050 Ligand
HGF RnD_Systems_Own 294-HGN-005 Ligand
Wnt5a RnD_Systems_Own 645-WN-010 Ligand
CTGF Life_Technologies_Own PHG0286 Ligand
LEP RnD_Systems_Own 398-LP-01M Ligand
FGF2 Sigma_Aldrich_Own SRP4037-50UG Ligand
FGF6 RnD_Systems_Own 238-F6 Ligand
IL7 RnD_Systems_Own 207-IL-005 Ligand
TGFB1 RnD_Systems_Own 246-LP-025 Ligand
PDGFB RnD_Systems_Own 220-BB-010 Ligand
WNT10A Genemed_Own 90009 Ligand
PTN RnD_Systems_Own 252-PL-050 Ligand
BMP3 RnD_Systems_Own 113-BP-100 Ligand
BMP4 RnD_Systems_Own 314-BP-010 Ligand
TNFSF11 RnD_Systems_Own 390-TN-010 Ligand
CSF2 RnD_Systems_Own 215-GM-010 Ligand
BMP5 RnD_Systems_Own 615-BMC-020 Ligand
DLL1 RnD_Systems_Own 1818-DL-050 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 296-HR-050 Ligand
KNG1 RnD_Systems_Own 1569-PI-010 Ligand
GPNMB RnD_Systems_Own 2550-AC-050 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 350-NS-010 Ligand
IL15 RnD_Systems_Own 247-ILB-005 Ligand
TNF RnD_Systems_Own 210-TA-020 Ligand
IGFBP3 RnD_Systems_Own 675-B3-025 Ligand
WNT3A RnD_Systems_Own 5036-WNP-010 Ligand
PDGFAB RnD_Systems_Own 222-AB Ligand
AREG RnD_Systems_Own 262-AR-100 Ligand
JAG1 RnD_Systems_Own 1277-JG-050 Ligand
BMP7 RnD_Systems_Own 354-BP-010 Ligand
TGFB2 RnD_Systems_Own 302-B2-010 Ligand
VEGFA RnD_Systems_Own 293-VE-010 Ligand
IL6 RnD_Systems_Own 206-IL-010 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 351-FS-010 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 378-SM Ligand
IGFBP2 RnD_Systems_Own 674-B2-025 Ligand
SHH RnD_Systems_Own 1314-SH-025 Ligand
FASLG RnD_Systems_Own 126-FL-010 Ligand

References

  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  3. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  4. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
  5. Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
  6. Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
  7. Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  8. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  9. Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , (2013).
  10. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
  11. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  12. Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a “normal” cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
  13. Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
  14. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
  15. Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
  16. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).

Play Video

Cite This Article
Smith, R., Devlin, K., Kilburn, D., Gross, S., Sudar, D., Bucher, E., Nederlof, M., Dane, M., Gray, J. W., Heiser, L., Korkola, J. E. Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer. J. Vis. Exp. (147), e58957, doi:10.3791/58957 (2019).

View Video