Formålet med metoden som presenteres her er å vise hvordan mikromiljøet Microarrays (MEMA) kan være fabrikkert og brukes til å forhøre virkningen av tusenvis av enkle Kombinatorisk microenvironments på fenotype av kulturperler celler.
Forstå virkningen av mikromiljøet på fenotype av celler er et vanskelig problem på grunn av den komplekse blanding av både oppløselige vekstfaktorer og matrise-assosiert proteiner i mikromiljøet in vivo. Videre er lett tilgjengelige reagenser for modellering av microenvironments in vitro vanligvis bruk av komplekse blandinger av proteiner som er ufullstendig definert og lider fra parti til parti variasjon. Den mikromiljøet Microarray (MEMA) plattformen tillater vurdering av tusenvis av enkle kombinasjoner av mikromiljøet proteiner for deres innvirkning på mobilnettet fenotyper i en enkelt analysen. MEMAs er klargjort i brønn plater, som gjør det mulig å legge til individuelle ligander for å skille brønner som inneholder plassert ekstracellulære Matrix (ECM) proteiner. Kombinasjonen av løselig ligand med hver trykte ECM danner en unik kombinasjon. En typisk MEMA analysen inneholder større enn 2 500 unike Kombinatorisk microenvironments at cellene er eksponert for i en enkelt analysen. Som en test tilfellet var brystkreft cellelinjen MCF7 belagt på MEMA plattformen. Analyse av denne analysen identifiserte faktorer som både forsterke og hemme vekst og spredning av disse cellene. Den MEMA plattformen er svært fleksibel og kan utvides for bruk med andre biologiske spørsmål utover kreftforskning.
Dyrking av kreftcelle linjer på plast i to-dimensjonale (2D) monolagere er fortsatt en av de store arbeidshester for kreft forskere. Imidlertid er mikromiljøet i økende grad blir anerkjent for sin evne til å påvirke mobilnettet fenotyper. I kreft, tumor mikromiljøet er kjent for å påvirke flere cellulære atferd, inkludert vekst, overlevelse, invasjon, og respons på terapi1,2. Tradisjonell monolag cellekulturer vanligvis mangler mikromiljøet påvirkninger, noe som har ført til utvikling av mer komplekse tredimensjonale (3D) analyser for å dyrke celler, inkludert kommersielt tilgjengelige renset kjeller membran ekstrakter. Men disse renset matriser er vanligvis komplisert å bruke og lider av tekniske problemer som batch variasjon3 og komplekse komposisjoner3. Som et resultat, kan det være vanskelig å tildele funksjon til bestemte proteiner som kan påvirke cellulære fenotyper3.
For å løse disse begrensningene har vi utviklet mikromiljøet Microarray (MEMA)-teknologi, som reduserer mikromiljøet ned til enkle kombinasjoner av ekstracellulære Matrix (ECM) og løselig vekstfaktor proteiner4,5 . MEMA-plattformen muliggjør identifisering av dominerende microenvironmental faktorer som påvirker virkemåten til celler. Ved å bruke et array-format, kan tusenvis av kombinasjoner av mikromiljøet faktorer bli analyseres i et enkelt eksperiment. Den MEMA beskrevet her interrogates ~ 2 500 forskjellige unike mikromiljøet forhold. ECM proteiner trykt inn i brønn platene danner vekst pads på hvilke celler kan være kultivert. Oppløselige ligander legges til individuelle brønner, og skaper unike Kombinatorisk microenvironments (ECM + ligand) på hvert annet sted som cellene utsettes for. Celler er kultivert i flere dager, deretter fast, beiset, og avbildet å vurdere cellulære fenotyper som følge av eksponering for disse spesifikke mikromiljøet kombinasjoner. Siden microenvironments er enkle kombinasjoner, er det enkelt å identifisere proteiner som driver store fenotypiske endringer i cellene. MEMAs har blitt brukt med hell for å identifisere faktorer som påvirker flere cellulære fenotyper, inkludert de som driver celle skjebne beslutninger og respons på terapi4,5,6,7. Disse svarene kan valideres i enkle 2D eksperimenter og kan deretter vurderes under forhold som mer fullstendig recapitulate kompleksiteten i tumor mikromiljøet. MEMA-plattformen er svært tilpasningsdyktig til en rekke celletyper og endepunkter, forutsatt at gode fenotypiske biomarkører er tilgjengelige.
Betydningen av “dimensionality” og kontekst har vært en motiverende faktor i utviklingen av in vitro kultur systemer som verktøy i karakterisering av kreftceller gjennom deres interaksjon med mikromiljøet11, og evnen til in vitro kultur systemer for å etterligne in vivo-miljøet er en drivkraft bak jakten på å forbedre disse kultur systemene. In vitro-systemer, derimot, er fortsatt betydelige verktøy for kreftforskning nettopp på grunn av deres evne til å brenne den komplekse in vivo situ…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH Fellesfondet bibliotek av nettverk Cellular signaturer (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H., og J. K).
Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Triton X100 | Sigma | T9284 | |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
BSA | Fisher | BP-1600 | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |