Summary
在这里,我们提出了一种敏感、快速和鉴别的凝胶后染色方法,使用原生或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶(PAGE)凝胶,将带有RNA芒果贴片I、II、III或IV标记的RNA成像。运行标准 PAGE 凝胶后,芒果标记的 RNA 可轻松与 TO1-Biotin 染色,然后使用常用的荧光读卡器进行分析。
Abstract
原生和变性聚丙烯酰胺凝胶通常分别用于表征核糖核蛋白(RNP)复杂流动性和测量RNA大小。由于许多凝胶成像技术使用非特异性污渍或昂贵的荧光探针,因此非常需要灵敏、鉴别和经济的凝胶成像方法。RNA芒果核心序列是小(19~22 nt)序列图案,当被任意RNA茎关闭时,可以简单而廉价地附着在感兴趣的RNA上。这些芒果标签与一种名为TO1-Biotin的硫磷-橙色荧光配体结合,具有高亲和力和特异性,结合后荧光会增加数千倍。在这里,我们表明芒果I,II,III和IV可用于在高灵敏度的凝胶中专门成像RNA。在原生凝胶中仅62.5 fmol和变性凝胶中125 fmol的RNA,可以通过在含有钾和20 nM TO1-Biotin的成像缓冲液中浸泡凝胶30分钟来检测。通过在总细菌RNA的复杂混合物中成像芒果标记的6S细菌RNA,我们证明了芒果标记系统的特异性。
Introduction
芒果是一个RNA标记系统,由一组四个小型荧光RNA贴合剂组成,与硫亚酮橙的简单衍生物(TO1-Biotin,图1A)1、2、3紧密结合( 纳米摩尔结合).结合后,这种配体的荧光会根据特定的贴合体增加1,000至4,000倍。芒果系统的高亮度,超过增强的绿色荧光蛋白(eGFP),结合RNA芒果贴合剂的纳米结合亲和力,使其可用于成像和RNA的纯化复合体 2,4。
芒果一号、第五号、二号、三号7的X射线结构已经确定为高分辨率,所有三个贴合体都利用RNA四联体结合TO1-Biotin(图1B+D)。所有三个贴实器的紧凑核心通过紧凑的适配器图案从外部RNA序列中分离出来。芒果I和II都利用灵活的GNRA环适配器将芒果芯连接到任意RNA双工(图1B,C)。相比之下,芒果III使用刚性三重体图案将其核心连接到任意RNA螺旋(图1D,紫色残留物),而芒果IV的结构目前尚不清楚。由于这些贴合剂的配体结合核心通过这些螺旋适配器从外部RNA序列中分离出来,因此它们似乎都可以简单地被合并到各种RNA中。细菌6S调节RNA(芒果I),酵母孢子菌(芒果I)的成分,以及人类5SRNA,U6RNA和C/D scaRNA(芒果II和IV)都成功地标记在这种方式2,8,这表明许多生物RNA可以使用RNA芒果贴切器系统进行标记。
变性和原生凝胶通常用于研究RNA。变性凝胶通常用于判断RNA大小或RNA处理,但通常,在北方斑点的情况下,需要几个缓慢和连续的步骤才能生成图像。虽然其他RNA致氟的贴合剂,如RNA菠菜和西兰花,已经成功地用于凝胶成像9,但迄今为止没有氟化贴合剂系统具有芒果系统的高亮度和亲和力,因此具有相当的兴趣调查芒果的凝胶成像能力在这项研究中,我们想知道RNA芒果系统是否可以简单地扩展到凝胶成像,因为TO1-Biotin的激发和发射波长(分别为510nm和535nm)适合在大多数荧光器常见的eGFP通道中成像凝胶扫描仪器。
此处介绍的凝胶后染色方案提供了一种快速方法,用于专门检测原生和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 凝胶中的芒果标记 RNA 分子。这种染色方法涉及在含有钾和TO1-生物的缓冲液中浸泡凝胶。RNA芒果贴切剂以G-四重体为基础,需要钾来稳定这种结构。使用从最小的芒果编码DNA模板转录的RNA(参见协议部分),我们可以使用简单的染色方案,在原生凝胶中检测至多62.5 fmol的RNA和125 fmol的RNA。与常见的非特异性核酸污渍(见材料表,本文中引用SG),我们可以清楚地识别芒果标记的RNA,即使样品中存在高浓度的未标记总RNA。
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Protocol
1. 试剂的制备
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TO1-生物染色后溶液(凝胶染色溶液)
- 在 25°C 下,在 pH 7.2 下,通过加入 342 mL 的 Na2HPO4和 158 mL 的 1 M NaH2PO4,在 pH 7.2 下制造 1 L 的 1 m 磷酸盐缓冲液。通过添加适当的磷酸盐溶液,在 50 mM 时将 pH 调节到 7.2。使用 0.2 μm 过滤器进行无菌过滤器,并在室温下将溶液储存在塑料制品中。
- 准备5x凝胶染色溶液(不含TO1-生物素),如下所示。通过混合 247.5 mL 的 ddH2O、700 mL 的 1 M KCl、50 mL 的 1 M 磷酸盐缓冲液 (pH 7.2) 和 2.5 mL 的补间 20,组成 1 L 溶液。使用 0.2 μm 过滤器进行无菌过滤器,并将溶液存储在塑料制品中。它可以在室温下储存。
注:如果需要,MgCl2可以添加到此溶液中,因为它可能稳定RNA复合物。这将对荧光信号2产生轻微影响。 - 使用步骤 1.1.2 中的 5x 凝胶染色溶液制作 1x 凝胶染色溶液,并在使用前立即将其与 TO1-Biotin 荧光荧光素(参见材料表)补充,最终浓度为 20 nM。例如,在 80 mL 的脱离子水中加入 20 mL 的 5x 凝胶染色溶液,以制作 100 mL 的 1x 凝胶染色溶液,并添加 2 μL 的 1 mM TO1-Biotin 库存(以二甲基甲酰胺制备)。
注:500nm处的TO1-Biotin染料的消光系数为63,000M-1+cm-1,以染色溶液1衡量。
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变性PAGE(2x变性凝胶加载溶液和溶液A、B、C、过硫酸铵和四甲基甲二胺)
- 通过混合 40 mL 的甲酰胺、0.5 m 的 0.5 M 乙烯二甲酸 (EDTA, pH 8.0) 和 9.5 mL ddH2O,制备 50 mL 的 2x 变性凝胶加载溶液。溶液可在室温下储存。加载染料不会添加到此解决方案中,因为它可能会遮盖荧光成像。
- 准备2x变性凝胶加载染料如下。当纯化RNA和DNA寡核苷酸时,在步骤1.2.1所述溶液中加入0.5 mL的2.5%(w/v)溴酚蓝(BB)和0.5 mL的2.5%(w/v)二甲二醇(XC),并加入8.5 mL的ddH2O,而不是9.5 mL。溶液可在室温下储存。
- 通过称出 200.2 g 尿素(配方重量:60.06 g/mol),并将其添加到 312.5 mL 的 40% 19:1 丙烯酰胺:N,N,N'-甲苯乙酰胺,制备 100 mL 溶液 A。以最大速度用磁搅拌棒搅拌,直至溶解(约3小时),并使用ddH2O将溶液制成500 mL。 请注意,最终浓度为6.667 M尿素和25%19:1丙烯酰胺:N,N'-乙酰乙酰氨酰胺。储存在4°C的清洁塑料制品中。
- 通过称出400.4克尿素,制备1L溶液B,用ddH2 O将溶液补至1L;搅拌,直到尿素溶解。溶液B可在室温下保存。
- 准备溶液C(10x三聚一体-EDTA [TBE]),如下所示。通过称出 432 g 的 Tris 底座和 220 g 硼酸,加入 160 mL 的 0.5 M EDTA,pH 为 8(过滤),并将溶液与 ddH2O 组成 4 L,制备 4 L 的 TBE。大量库存的这种缓冲液,因为它也被用作凝胶运行缓冲液。
- 通过将 1 克 APS 溶解成 10 mL 的 ddH2O O 总体积,在 4 °C 下储存,制备 10% 过硫酸铵 (APS)。
- 保持四甲基二胺 (TEMED) 方便。与 APS 解决方案一起将其储存在 4°C 下。
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原生 PAGE(2 倍原生凝胶加载解决方案)
- 通过混合 25 mL 的 100% 甘油、10 mL 的 5x 凝胶染色溶液和 15 mL 的 ddH2O,制备 50 mL 的 2x 原生凝胶加载溶液,以将溶液混入 50 mL。
注:与变性凝胶部分一样,装载染料可以添加到该库存中,但添加染料可能会遮盖凝胶中的荧光信号,因此应避免使用。
- 通过混合 25 mL 的 100% 甘油、10 mL 的 5x 凝胶染色溶液和 15 mL 的 ddH2O,制备 50 mL 的 2x 原生凝胶加载溶液,以将溶液混入 50 mL。
2. 变性凝胶的制备和装载
- 按照表1,用适当的百分比准备变性凝胶。考虑特定的凝胶铸造系统;30 mL 凝胶是常用的。通过使用表 2可以估计适当的凝胶百分比:选择BB和XC染料分别比感兴趣的RNA具有更快和更慢的聚丙烯酰胺百分比,以确保相关尺寸的高带分离范围。
- 根据表 1混合溶液 A、B 和 C,并在浇注凝胶前立即添加 APS 和 TEMED。将溶液很好地混合在干净的塑料制品中。
- 在确保所有部件都严格清洁后,将凝胶溶液倒入适当的凝胶铸造装置中。提起设备的一侧,使凝胶在浇注时稍微倾斜,以避免任何气泡卡在凝胶内。
- 插入所需的梳子,使其保持聚合(约 30 分钟)。通过仔细观察凝胶井周围折射率的变化来观察聚合。使用 1x 溶液 C (1x TBE) 制作凝胶罐,并小心地拆下梳子。使用注射器,在样品加载前立即吸出井。
- 准备变性样品,如下所示。在感兴趣的RNA样品中加入2倍变性凝胶加载溶液,使用热循环器或水浴,使变性凝胶加载溶液在95°C下达到1x,热变性为5分钟。
- 在加载样品之前,对样品进行空气冷却几分钟,直到它们冷却到触摸。使用凝胶加载尖端将样品分层到每口井的底部,从而加载样品。
注:圆形尖端可用于厚度为1毫米或以上的凝胶;使用扁平尖端稀释凝胶。 - 在室温下运行变性凝胶。确保功率足够低,以便凝胶系统的玻璃板不破裂。
注:在我们的实验室中,20 厘米 x 16 厘米板的 28 W 足以达到此目的。
3. 原生凝胶的制备和装载
- 参考表3,准备具有适当百分比的原生凝胶。考虑特定的凝胶铸造系统,但请记住,通常使用 30 mL 凝胶。根据表3将1x TBE、40%29:1丙烯酰胺:N、N'-甲酰胺和甘油溶液混合,并在浇注凝胶前加入APS和TEMED。按照步骤 2.3 和 2.4 中所述继续。
- 通过在感兴趣的RNA样品中加入2倍原生凝胶加载溶液来制备原生样品,使溶液1x,并允许它在室温下孵育100分钟,然后运行凝胶,以确保完整的RNA折叠。
- 在 4°C 的冷室中运行原生凝胶,确保功率足够低,不会加热凝胶。
注:在我们的实验室中,20 厘米 x 16 厘米板的 14 W 足以达到此目的。
4. 通过运行T7转录制备RNA
注:用于RNA芒果构造的分流转录10的DNA序列已进行商业订购。在这种方法中,含有要转录的序列和T7启动子的反向补体(RC)的DNA寡核苷酸被杂交到T7启动子顶部链序列,然后在体外转录。下面,对于每个寡核苷酸,芒果核心序列的 RC 以粗体显示,T7 启动子区域的 RC 以斜体显示。常规字体中的残留物对应于允许芒果芯正确折叠所需的任意互补螺旋区。
芒果一:GCA CGT ACT CTC CTC GCA CCG TCC CTT CGT ACG TGC TA TA TGA GTC GTA TA AAG
芒果II:GCA CGT ACT CTC TTC TTC TTC TTC TCT C T T TT T T T T T T T T TG TGC TA TA TGA GTA GTA TA AAG
芒果三:GGC ACG TAC GAA A ACC ACA TAC C TTC CTT TCG TCG TGC TA TGA GTA GTA TTA AAG
芒果四:GCA CGT ACT CGC CTC CTC ACC ACT CCC CG GTA GCC TAT AGT AGT TCG TAT TAA AG
T7 顶绞线:CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G
- DNA寡核苷酸的沉淀物纯化
- 对于 0.2 μmol 规模的 DNA 合成,在 100 μL ddH2O 和 100 μL 的 2x 变性加载染料(从步骤 1.2.2)中重新悬浮去污的 DNA 寡核苷酸。在这种情况下,最好在装载溶液中包括与步骤 1.2.2 相同的浓度的凝胶加载染料。
- 使用50 mL的保质规模变性凝胶,适当聚丙烯酰胺百分比,纯化DNA寡核苷酸;使用表 2选择凝胶百分比。例如,对 50 nt 序列使用 8% 凝胶。理想情况下,溴酚蓝的运行速度应高于寡核苷酸,二甲苯氰醇的运行速度应较慢。
注:在我们的实验室中,这种凝胶采用1.5毫米厚的铸造垫片和带2~2.5厘米宽的凝胶装线。 - 加载每个制备凝胶中制备的 DNA 寡核苷酸溶液的 100 μL,步骤 2.4_2.7 中所述。
- 小心地擦干凝胶的外侧,取出玻璃板,用塑料包装盖住凝胶的两侧。将其放在荧光成像屏幕上(铝支持的薄层色谱板浸渍荧光是一种经济的解决方案),并使用短波长 UV 手持灯通过紫外线阴影可视化 DNA 波段。
- 如果DNA合成是高质量的,应该观察到清晰、清晰的阴影。使用永久标记标记塑料包装上的带子。
注意:保护皮肤和眼睛免受紫外线照射,并短线曝光,以免损害核酸样品。 - 将凝胶放在干净的玻璃板上,仔细切掉标记的带子,并将每个凝胶片段放入 400 μL 的 300 mM NaCl 中。在室温下使用旋转器过夜,使DNA脱氧核糖核酸(
- 在干净的离心管中回收洗脱剂,并加入2.5个等价乙醇来沉淀DNA。涡旋井,将管置于-20°C下30分钟。
- 在4°C下以156,000 x g将样品在台式离心机中进行30分钟的颗粒。小心地去除上清液,并在ddH2O中重新悬浮颗粒。 使用分光光度计准确确定DNA寡核苷酸浓度。将样品储存在-20°C下,方便地储存在10μM库存中。
- RNA样品的脱流转录和凝胶纯化
- 通过混合由40 mM三磷酸基物最终浓度(GTP,11,400 M-1+cm -1)、25 mM 三磷酸环(CTP,7,600 M-1+1),25 mM三磷酸腺苷(ATP,5,000 M-1+cm-1) 和 10 mM 尿氨酸三磷酸(UTP, 10,000 M-1+cm-1);260 nm 处的所有消光系数。
注:液体或粉末状库存可以商业获得。如果从粉末中制备初级库存,请使用 1 M NaOH 小心将 pH 调整到 7.9 的最终 pH。将库存与 1.5 mL 微离心管中的库存进行比对,并将其储存在 -20°C。 - 通过混合 25.6 m L 的 1 M Tris-HCl、1M Tris 底座的 14.4 mL、26 mL 的 1 M MgCl2、10% Triton X-100 和 0.637 g 精氨酸,制备 100 mL 的 10x T7 转录缓冲液。通过添加 ddH2O,将库存组成到 100 mL 的最终体积。
注: 应使用经过校准的 pH 计确认 1x 溶液中 7.9 的最终 pH。10x 应无菌过滤,并储存在 -20°C 中,以适当大小的等分。 - 执行转录,如下所示。
- 使用 10x T7 转录缓冲液(从步骤 4.2.2 起)、1x NTPs、10 mM二硫硫醇 (DTT)、1 μM T7 顶链序列(参见第 4 节注释)添加以下试剂,以组成 1x T7 转录缓冲液的最终浓度。序列),1 μM凝胶纯化芒果DNA序列(步骤2.1)和T7RNA聚合酶(1U/μL)。
- 涡旋,向下旋转,并在37°C孵育溶液2小时,或直到它变成阴天和白色沉淀形成在管的底部。50 μL转录应在凝胶纯化后产生50μL的±50μMRNA。加入同等体积的2倍变性染料,并将其储存在-20°C,直到准备进行凝胶纯化。
- 凝胶-纯化产生的RNA,如DNA寡核苷酸凝胶纯化部分所述,按照步骤4.1.2\u20124.1.8,用RNA样本代替DNA。
注:RNA对RNase降解极为敏感,因此请确保在所有步骤中,始终佩戴手套和干净的实验室外衣。确保所有样品都准备并储存在一次性塑料器皿中,以防止RNase污染,并在使用前用热肥皂和水仔细清洗玻璃板,用ddH2O彻底冲洗,然后用从挤压瓶中应用乙醇的帮助。 - 使用最终RNA样品的1μL,并使用基于水滴的分光光度计确定260nm的吸光度。使用由最近邻法确定的消光系数,计算RNA浓度,并使用ddH2O将样品浓度调整到10μM,以方便使用。将RNA样品储存在-20°C。
- 通过混合由40 mM三磷酸基物最终浓度(GTP,11,400 M-1+cm -1)、25 mM 三磷酸环(CTP,7,600 M-1+1),25 mM三磷酸腺苷(ATP,5,000 M-1+cm-1) 和 10 mM 尿氨酸三磷酸(UTP, 10,000 M-1+cm-1);260 nm 处的所有消光系数。
- 大肠杆菌总粗核酸提取
注:以下协议是一个示例。该协议使用内生表达的芒果I标记6SRNA从大肠杆菌的质粒,并从这种质粒诱导被详细描述在其他地方4。- 为了本研究的目的,为pEcoli-RNA芒果和pEcoli-T1质粒制备500 mL的诱导细胞(这些细胞在OD600nm的1) 下诱导。在使用前,将细胞颗粒在-80°C下储存。
- 执行以下 RNA 提取。
- 取诱导的pEcoli细胞颗粒0.5 mL,加入500μL的均衡苯酚。然后,涡旋样品;溶液会变成乳白色。以最大速度离心 2 分钟以分离层。
- 提取顶层(将略为黄色),并通过添加相等体积的苯酚、离心和提取总计 5x(或直到中间层(不透明白色)消失,仅剩两个透明图层,重复步骤 4.3.2.1)。
- 将苯酚提取的水体积加入同等体积的氯仿、涡流中,然后以最大速度离心2分钟。
- 提取水层,并将 NaCl 添加到 300 mM 的最终浓度。通过加入2.5个等效的乙醇、涡旋、旋转并在-20°C下沉淀至少30分钟,沉淀产生的核酸。
- 台式离心机在4°C下以15.6 x 1,000 x g的颗粒进行30分钟。小心地去除上清液,并在100 μL ddH2O中重新悬浮颗粒。
- 按照参考协议11,在此过程中加入DNase I消化步骤,以获得总RNA。
注:涡旋剧烈,直到颗粒完全溶解在ddH2O中。
5. 凝胶后染色
- 根据步骤 1.1.3 中的配方准备 1x 凝胶染色溶液,并将其添加到足够宽、舒适贴合凝胶的清洁玻璃容器中。
注:带卡扣盖的硼硅酸盐玻璃容器很好地服务于这一目的。 - 向容器中加入足够的1x凝胶染色溶液,使凝胶完全覆盖在溶液中,当液体置于轨道旋转器上时,液体在凝胶顶部晃动。
注:容器必须足够大,以适合凝胶,以便它可以移动,并在容器中有足够的缓冲液,以完全覆盖凝胶。 - 原生或变性凝胶完成运行(分别为第 2 节或第 3 节),从设备中取出凝胶并切断其井。在分析的后面部分,取出凝胶的一角以进行方向分析会很有用。
- 小心地将凝胶转移到步骤 5.2 中制备的 1x 凝胶染色溶液中。
注意:凝胶易碎且容易破裂,因此在转移凝胶时要小心。时刻将盖子盖在染色容器上,以免污染凝胶。 - 在室温下,以 100 rpm 的速度将凝胶放在轨道旋转器上 30 分钟。
注:确保凝胶不会折叠到自身;否则,RNA可能会扩散出凝胶,从而标记凝胶的不同部分。
6. 在凝胶中成像芒果标记RNA
- 小心地将成像缓冲液分一个。用水快速冲洗凝胶,确保保持足够的液体,使凝胶在容器中保持轻微移动。
- 小心地将凝胶转移到成像器上。通过仔细拾取凝胶的两侧并将其放在成像器托盘上进行传输;或者,凝胶可以慢慢倒在托盘上。确保凝胶下方没有气泡,凝胶下没有多余的液体。滚过凝胶的移液器可用于去除多余的液体。
注意:使用纸巾吸收多余的液体。 - 以凝胶图像为例,观察激发波长 510 nm 和发射波长 535 nm 之间的荧光(例如,在成像器上波长为 520 nm 的荧光设置处的绿光)。确保仪器上的设置已完全优化,并仔细遵循所用仪器的说明。
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Representative Results
短芒果标记的RNA是编写在协议部分所述。假设由于凝胶中存在尿素,在变性条件下的荧光是最难观察到的,我们首先研究了芒果贴合剂对尿素的抗药性,尿素作为核酸变性剂。我们发现芒果贴合剂对变性具有实质性抗药性,尿素浓度约为1M(图2A)。在将凝胶染色溶液添加到变性凝胶之前,凝胶中尿素的最终浓度为6M。在实践中,染色协议达到的完全最佳结果要少,但如果需要,只需使用更多的染色溶液或简单的在染色过程中更改溶液一次的简单权宜之计即可纠正。
一旦芒果标记的RNA结构被运行到变性凝胶中,染色时间被优化为最大的凝胶荧光,通过加载三个不同的芒果III量到8%变性凝胶(图2B)。时间过程显示,在凝胶染色溶液中浸泡5分钟后,荧光清晰可见。芒果III构造的最大荧光是在染色20-40分钟后获得的,此后本研究中使用的小RNA开始扩散出凝胶,导致荧光信号损失(图2B)。因此,原生凝胶和变性凝胶分别染色30分钟。较长的RNA结构很容易容忍更长的染色时间,因为它们不太可能扩散出凝胶。
一些RNA芒果贴合剂的折叠速度比其他的要快。本研究中使用的每个芒果贴合剂在凝胶缓冲液中孵育,辅以1.5M尿素和100 nM TO1-Biotin染料,并使用荧光计进行分析。芒果一、二、三在10分钟后完全折叠,而芒果四号在40分钟后才完全折叠(图3A)。在没有尿素的情况下,折叠速度比预期快得多(图3B)。为了确保原生凝胶样品完全折叠,我们在将样品预育到原生凝胶之前,先孵化100分钟。实际上,图 3中的数据表明,根据所使用的芒果贴身器,这一次可能会大大减少。
一旦对协议进行了优化,以检测RNA芒果贴合荧光,就确定了两种原生凝胶中每种芒果变异的后染色方法的敏感性。在原生凝胶中的四个芒果中,每一个与折叠良好的RNA对应的单带被观察(图4A)。经连续稀释后,只需观察到芒果II的62.5 fmol,而芒果I、III和IV的125菲摩尔则很容易被想象。原生凝胶的定量是对数线性的,约为1.5个量级,芒果I、II和IV的行为方式比芒果III更线性(图4B)。
变性凝胶的结果比原生凝胶的灵敏度稍低,但更线性。芒果II和III的125个fmol很容易被检测到(图4C)。有趣的是,定量(图4D)表明变性凝胶是对数线性或两个数量级。我们假设,与原生凝胶相比,RNA褶皱在凝胶运行过程中可能遭受部分变性,变性凝胶中尿素的存在可能提供一种更均匀的方式,一旦它们被放入,就折叠了贴合剂。TO1-生物染色溶液。
与所有凝胶染色方法一样,如果凝胶未小心地转移到容器中,或在染色期间旋转速度过高,凝胶可能会折回自身(图5A)。这可能导致芒果标记的RNA样品从凝胶的一个地方扩散到另一个地方,但在实践中很容易避免。在原生凝胶中,特别是对于芒果IV,我们观察到不完全折叠可以表现在多个带的外观,大概对应于部分/错折叠的RNA合形(图5B),由于折叠时间较短。通过按前所述适当预孵化RNA样品,并在冷室中运行原生凝胶,可以避免原生凝胶中的折叠问题。在变性凝胶中,RNA在凝胶内原位折叠,错误折叠不是一个严重的问题。最后,在没有RNA的情况下,在任一凝胶系统中观察到的背景荧光非常少。
其次,通过过度表达细菌中的6S调控RNA,研究了RNA芒果标记的特异性。此RNA以前被标记使用芒果I (图1E)4。细菌细胞被转化与pEcoli-RNA芒果质粒(因此M质粒)或pEcoli-T1质粒作为阴性对照(因此E质粒)。转化的细胞在液体液化液合基溴培养基中生长,直到达到1.0的OD600。然后用50μM异丙基β-D-1-硫拉多拉诺苷(IPTG)诱导培养物40分钟。细胞在6000 x g离心下采集15分钟。总RNA是使用苯酚氯仿从细胞颗粒12中提取的,如协议部分所述。总RNA样本通过乙醇沉淀浓缩,然后用DNase I处理,按照协议去除DNA11。在使用之前,RNA通过乙醇沉淀浓缩。
总细菌RNA被运行到8%变性凝胶(图6),并沾染SG13或TO1-生物。对于SG染色,在100 mL的凝胶缓冲液中加入10μL的10,000x SG;否则,染色方案与用于 TO1-Biotin 的协议相同。不出所料,对大量RNA观察到强SG染色,但最突出的是核糖体(rRNA)和转移RNA(tRNA)(图6,左面板)。虽然芒果依赖染色(M通道)可以在这些SG染色凝胶中看到,但鉴于使用这种通用染色观察到的复杂染色模式,它们无法被唯一识别。相比之下,TO1-Biotin染色凝胶突出芒果依赖带作为最突出的带。只有核糖体RNA带被认为与6S芒果依赖带竞争。也可以观察到一些非特有染色的带子。然而,芒果依赖带再次占据主导地位,只有rRNA和tRNA带作为弱竞争的竞争对手(图6,右面板)。
图1:芒果贴身系统。(A) TO1-生物氟化物.(B) 芒果一(C) 芒果 II.(D) 芒果 III.面板B=D显示了每个贴切器的二级结构。P1 是任意词干。芒果I和II中发现的GNRA状茎环(此处为GAAA)以红色显示,芒果III的三重图案以紫色显示。(E) 标有芒果 I 标记的 6S 调节RNA.请点击此处查看此图的较大版本。
图2:尿素对芒果荧光和最佳染色时间的影响。(A) 使用 50 nM RNA 芒果 I(橙色圆圈)、芒果 II(绿色圆圈)、芒果 III(紫色圆圈)和芒果 IV(蓝色圆圈)的尿素滴定,以及 100 nM TO1-Biotin 染料和指示的尿素浓度。样品孵育40分钟,然后以510nm的激发波长和535nm的发射波长读取荧光。(B) 芒果 III RNA 被加载到 8% 变性凝胶中,并沾染含有 20 nM 最终 TO1-Biotin 染料的凝胶溶液。对于每个指示的时间点,从左到右使用芒果IIIRNA的0.064、0.32和1.6pmol。使用 520 nm 激光和 10 分钟曝光使用荧光成像器对凝胶图像进行可视化。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:芒果贴合剂在存在和没有尿素的情况下的折叠时间。(A) 在存在 1.5 M 尿素和 100 nM TO1-Biotin 的情况下,使用每个 RNA 芒果结构的 50 nM 进行荧光时间课程(RNA 芒果 I:橙点、芒果 II:绿点、芒果 III:紫色点和芒果 IV:蓝点)。(B)与A面板相同,但无尿素除外。所有课程都在室温下进行。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:使用RNA芒果构造的原生和变性PAGE的荧光图像。(A) 具有连续稀释的RNA芒果结构的8%原生凝胶。巷I、II、III和IV分别含有8个pmol最终量的RNA芒果I、II、III和IV。右侧面板是双倍连续稀释,包含 4 pmol、 2 pmol、 1 pmol、 0.5 pmol、 0.25 pmol、 0.125 pmol 和 0.0625 pmol 的芒果 I、II、III 或 IV,如所示。车道12不含RNA。(B) 原生凝胶的三个复制的定量(每个凝胶显示的均值的标准偏差)。(C) 8% 变性凝胶的样本与面板A中相同,但使用变性凝胶加载溶液代替原生凝胶加载溶液。(D) 变性凝胶的三个量化复制(每个均值的标准偏差)。所有凝胶图像均采用 520 nm 激光和 10 分钟曝光的凝胶成像仪进行可视化。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:8%原生凝胶中芒果IV的不完全折叠。(A) 芒果II图4所示的排序的序列稀释,但显示凝胶折叠在染色过程中的效果。(B) 芒果IV原生凝胶样品在凝胶加载前,在原生缓冲液中不能折叠足够长的时间,表现出双带。否则,这些结果与图 4A所示的芒果 IV 结果类似。所有凝胶图像均使用带有 520 nm 激光和 10 分钟曝光的凝胶成像仪进行可视化。请点击此处查看此图的较大版本。
图6:使用TO1-Biotin染色,在总RNA的存在下可以检测到芒果标记的RNA。8%变性凝胶含有总RNA的100纳克,运行30分钟。左凝胶上沾有SG,右侧面板上沾有TO1-Biotin。对于两个面板,标有 E 的通道都装有 100 ng 的 pEcoli-T1(无芒果标签),标有 M 的通道装载了 100 ng 的 pEcoli-RNA 芒果(6S RNA 标记有芒果 I 标记)。TO1-Biotin 染色凝胶图像使用 520 nm 激光和 10 分钟曝光的成像仪进行可视化。使用 460 nm 激光和 10 分钟曝光的凝胶成像仪可视化 SG 染色凝胶图像。请点击此处查看此图的较大版本。
| 百分比 | 凝胶体积 | |||
| 20 mL | 30 mL | 50 mL | ||
| 5% | A | 4 | 6 | 10 |
| B | 14 | 21 | 35 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 6% | A | 4.8 | 7.2 | 12 |
| B | 13.2 | 19.8 | 33 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 8% | A | 6.4 | 9.6 | 16 |
| B | 11.6 | 17.4 | 29 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 10% | A | 8 | 12 | 20 |
| B | 10 | 15 | 25 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 12% | A | 9.6 | 14.4 | 24 |
| B | 8.4 | 12.6 | 21 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 15% | A | 12 | 18 | 30 |
| B | 6 | 9 | 15 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 20% | A | 16 | 24 | 40 |
| B | 2 | 3 | 5 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| APS (μL) | 48 | 72 | 120 | |
| 泰姆德 (μL) | 20 | 30 | 50 | |
表1:变性PAGE凝胶铸造表。A = 解决方案 A、B = 解决方案 B、C = 解决方案 C。
| 变性凝胶 % | BB(+移动NT) | XC(\t) 移动性 |
| 5 | 35 | 130 |
| 6 | 26 | 106 |
| 8 | 19 | 70-80 |
| 10 | 12 | 55 |
| 20 | 8 | 28 |
| 23 | 5-6 |
表2:聚丙烯酰胺变性凝胶中溴酚蓝(BB)和二甲苯氰醇(XC)凝胶加载染料的近似凝胶动员。
| 百分比 | 凝胶体积 | |||
| 20 mL | 30 mL | 50 mL | ||
| 5% | 1X TBE | 16.5 | 24.75 | 41.25 |
| 40% 29:1 丙烯酰胺:N,N'-甲基苯丙烯酰胺 | 2.5 | 3.75 | 6.25 | |
| 甘油 | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 6% | 1X TBE | 16 | 24 | 40 |
| 40% 29:1 丙烯酰胺:N,N'-甲基苯丙烯酰胺 | 3 | 4.5 | 7.5 | |
| 甘油 | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 8% | 1X TBE | 15 | 22.5 | 37.5 |
| 40% 29:1 丙烯酰胺:N,N'-甲基苯丙烯酰胺 | 4 | 6 | 10 | |
| 甘油 | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 10% | 1X TBE | 14 | 21 | 35 |
| 40% 29:1 丙烯酰胺:N,N'-甲基苯丙烯酰胺 | 5 | 7.5 | 12.5 | |
| 甘油 | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 12% | 1X TBE | 13 | 19.5 | 32.5 |
| 40% 29:1 丙烯酰胺:N,N'-甲基苯丙烯酰胺 | 6 | 9 | 15 | |
| 甘油 | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 15% | 1X TBE | 11.5 | 17.25 | 28.75 |
| 40% 29:1 丙烯酰胺:N,N'-甲基苯丙烯酰胺 | 7.5 | 11.25 | 18.75 | |
| 甘油 | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 20% | 1X TBE | 9 | 13.5 | 22.5 |
| 40% 29:1 丙烯酰胺:N,N'-甲基苯丙烯酰胺 | 10 | 15 | 25 | |
| 甘油 | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| APS (μL) | 48 | 72 | 120 | |
| 泰姆德 (μL) | 20 | 30 | 50 | |
表3:原生PAGE凝胶铸造表。
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Discussion
芒果荧光标签的一个显著优点是单个标签可以多种方式使用。这些贴合剂的高亮度和亲和力使它们不仅可用于细胞可视化2,而且可用于体外RNA或RNP纯化4。因此,凝胶成像以简单明了的方式扩展了芒果标签的多功能性。芒果凝胶成像灵敏度略低于北方印贝14,但可以轻松检测60~120 fmol的RNA样品,无需冗长而繁琐的膜转移和探测步骤。这与之前在凝胶15中发现的基于杂交的探测效率相当。虽然其他含氟贴合剂方法(特别是RNA菠菜)具有更高的灵敏度和特异性9,但目前没有一种具有芒果贴合器系统的高亮度和亲和力,它允许单个RNA标记用于细胞成像、RNP 纯化,以及现在的凝胶成像。
此凝胶染色协议中有几个关键步骤。使用RNA溶液时,溶液应无菌过滤,并应使用一次性塑料器皿。如果凝胶的功率水平过高并导致凝胶加热,则将原生凝胶作为复合物或RNA结构运行,很容易变性。确保任何用过的玻璃器皿清洁且未受到 RNases 的污染。此外,在转移和拿起凝胶时,一定要小心,因为它们是脆弱的,容易破裂。
TO1-Biotin 染色迅速渗透到凝胶中,但此处提供的数据也表明,芒果 IV 折叠尤其可以限制速率(图 2和图 3)。利用协议部分中所述的条件,我们观察到了所有四个贴片在变性凝胶中超过两个数量级的对数线性行为,使该方法对定量有用(图4C,D)。由于本研究中使用的小芒果贴切剂很容易从凝胶基质扩散出来,我们期望定量能改善更长的RNA结构。
这里演示的芒果标签凝胶成像方法非常可靠,预计在灵敏度和特异性方面可以简单地扩展。芒果一、二、三折可靠,而芒果四号不折叠。虽然我们没有探讨去污协议,但我们预计这种方法也可以简单地提高特异性。虽然超出这项工作的范围,在使用TO1-Biotin荧光酸时,赋予芒果标记RNA的荧光和生物素标记似乎极有可能进一步简化凝胶分析和纯化。例如,市售的二次生物锡标签技术有望进一步增强这一简单RNA芒果标记系统的检测极限。同样,似乎有可能从凝胶中洗脱和利用链球蛋白磁珠来恢复原生芒果标记的RNA蛋白复合物,从而捕获洗脱的RNA复合物。这将进一步简化生物重要RNA和RNA复合物的常规纯化,通过在感兴趣的RNA中添加芒果标记的简单权宜之计。
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Disclosures
芒果氟化系统正在申请专利。
Acknowledgments
作者感谢拉兹万·科约卡鲁和阿米尔·阿卜杜拉赫扎德的技术援助,感谢莱娜·多尔戈舍纳对手稿进行校对。加拿大自然科学和工程研究理事会(NSERC)向P.J.U提供的业务赠款为该项目提供了资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
