Summary
Her præsenterer vi en følsom, hurtig og diskriminerende post-gel farvning metode til billede RNAs mærket med RNA mango aptamers I, II, III, eller IV, ved hjælp af enten indfødte eller denaturerende polyacrylamid gel elektroforese (PAGE) gels. Efter at have kørt standard side gels, mango-Tagged RNA kan let farves med TIL1-biotin og derefter analyseres ved hjælp af almindeligt tilgængelige fluorescens læsere.
Abstract
Native-og Denaturerings-polyacrylamidgeler anvendes rutinemæssigt til at karakterisere den komplekse mobilitet af ribonucleoprotein (RNP) og til at måle RNA-størrelsen. Da mange gel-Imaging teknikker bruger uspecifikke pletter eller dyre fluorophore sonder, følsomme, diskriminerende, og økonomiske gel-Imaging metoder er meget ønskværdigt. RNA mango Core sekvenser er små (19 – 22 NT) sekvens motiver, der, når de lukkes af en vilkårlig RNA-stamme, kan være ganske enkelt og billigt knyttet til et RNA af interesse. Disse mango Tags binde med høj affinitet og specificitet til en thiazol-orange fluorophore ligand kaldet TIL1-biotin, som bliver tusinder af gange mere fluorescerende på binding. Her viser vi, at mango I, II, III, og IV kan bruges til specifikt billede RNA i geler med høj følsomhed. Så lidt som 62,5 fmol af RNA i native geler og 125 fmol af RNA i Denaturerings geler kan påvises ved iblødsætning geler i en billedbehandlings buffer indeholdende kalium og 20 Nm til1-biotin i 30 min. Vi demonstrerer specificiteten af mango-mærkede system ved at afbilde en mango-Tagged 6S bakteriel RNA i forbindelse med en kompleks blanding af total bakteriel RNA.
Introduction
Mango er et RNA-mærkningssystem bestående af et sæt af fire små fluorescerende RNA-aptamatorer, der binder stramt (nanomolær binding) til simple derivater af thiazol-orange (1,2,3, figur 1a) . Ved binding, fluorescens af denne ligand er øget 1.000-til 4.000-fold afhængigt af den specifikke aptamer. Den høje lysstyrke af mango-systemet, som for mango III overstiger, at den forstærkede grønne fluorescerende protein (eGFP), kombineret med den nanomolære bindende affinitet af RNA mango aptamers, gør det muligt at blive brugt både i billeddannelse og rensning af RNA komplekser2,4.
Røntgen strukturen af mango I5, II6og III7 er blevet fastlagt til høj opløsning, og alle tre aptamers udnytter et RNA Firplex til bind 1-biotin (figur 1b– D). De kompakte kerner af alle tre aptamers isoleres fra den eksterne RNA-sekvens via kompakte adapter motiver. Mango I og II udnytter begge en fleksibel GNRA-lignende loop-adapter til at forbinde deres mango kerner med en vilkårlig RNA-dupleks (figur 1b, C). I modsætning hertil bruger mango III en stiv Triplex motiv til at forbinde sin kerne til en vilkårlig RNA Helix (figur 1d, lilla rester), mens strukturen af mango IV er ikke i øjeblikket kendt. Da den ligand-bindende kerne af hver af disse aptamers er adskilt fra den eksterne RNA sekvens af disse spiralformede adaptere, det forekommer sandsynligt, at de alle kan blot indarbejdes i en række RNAs. Bakterien 6s regulerende RNA (mango i), komponenter af gær spliceosome (mango i), og human 5s RNA, U6 RNA, og en C/D scarna (mango II og IV) er alle blevet mærket på denne måde2,8, hvilket tyder på, at mange biologiske RNA'er kan mærkes ved hjælp af RNA mango aptamer systemet.
Denaturering og indfødte geler er almindeligt anvendt til at studere RNAs. Denaturerings geler bruges ofte til at bedømme RNA-størrelse eller RNA-behandling, men typisk, i tilfælde af en nordlige blot, for eksempel, kræver flere langsomme og sekventielle trin for at generere et billede. Mens andre RNA-fluorogene aptamatorer, såsom RNA spinach og broccoli, har været anvendt med succes for gel Imaging9, ingen fluorogen aptamer system til dato besidder den høje lysstyrke og affinitet af mango-systemet, hvilket gør det af betydelig interesse at undersøge Mango's gel-Imaging evner. I denne undersøgelse, vi spekulerede på, om RNA mango system kunne simpelthen udvides til gel billeddannelse, som excitation og emission bølgelængder af 1-biotin (510 nm og 535 nm, henholdsvis) er passende for billeddannelse i eGFP kanal fælles for de fleste fluorescerende af gel-scannings instrumentering.
Post-gel farvning protokol præsenteret her giver en hurtig måde at specifikt detektere mango-mærkede RNA molekyler i native og denaturering polyacrylamid gel elektroforese (PAGE) geler. Denne farvning metode involverer iblødsætning geler i en buffer, der indeholder kalium og til1-biotin. RNA mango aptamers er G-firplex baseret og kalium er nødvendig for at stabilisere sådanne strukturer. Ved hjælp af RNA transkriberet fra minimal mango-kodning DNA-skabeloner (Se protokol afsnittet), kan vi simpelthen opdage så lidt som 62,5 fmol af RNA i native geler og 125 fmol af RNA i Denaturerings geler, ved hjælp af en ligetil farvning protokol. I modsætning til almindelige uspecifikke nukleinsyre pletter (Se tabel over materialer, henvist til SG fra hereon), kan vi tydeligt identificere mango-mærkede RNA, selv når høje koncentrationer af total ukodet RNA er til stede i prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af reagenserne
-
1-biotin-postfarvnings opløsning (gel-farvnings opløsning)
- 1 L af 1 M fosfatbuffer ved pH 7,2 ved 25 °C tilføjes 342 mL af 1 M na2HPO4 og 158 ml 1 m Nah2po4. PH justeres til 7,2 ved 50 mM ved tilsætning af den relevante fosfat opløsning. Steril filter ved hjælp af et 0,2 μm filter og opbevar opløsningen i plasticware ved stuetemperatur.
- Klargør 5x gel-Farvningsopløsningen (uden 1-biotin) som følger. En 1 L opløsning blandes ved at blande 247,5 mL ddH2O, 700 ml 1 m kcl, 50 ml 1 m fosfatbuffer (pH 7,2) og 2,5 ml Tween 20. Steril filter ved hjælp af et 0,2 μm filter og opbevar opløsningen i plasticware. Det kan opbevares ved stuetemperatur.
Bemærk: MgCl2 kan tilsættes til denne løsning, hvis det er nødvendigt, da det potentielt kan stabilisere RNA-komplekser. Dette vil have en beskeden indvirkning på det fluorescerende signal2. - Der gøres en 1x gel farvnings opløsning ved hjælp af 5x gel Farvningsopløsningen fra trin 1.1.2 og, umiddelbart før brug, supplere den med 1-biotin fluorophore (Se tabel over materialer) til en endelig koncentration på 20 Nm. For eksempel tilsættes 20 mL 5x gel farvnings opløsning til 80 mL afioniseret vand for at gøre 100 mL 1x gel farvnings opløsning, og tilsæt 2 μL 1 mM TIL1-Biotinbestand (fremstillet i dimethylformamid).
Bemærk: udløsnings koefficienten for farvestoffet 1-biotin ved 500 nm er 63.000 M-1· cm-1, målt i farvnings opløsning1.
-
Denaturerings side (2x Denaturerings gel-opløsning og opløsninger A, B, C, ammoniumpersulfat og tetramethylethylendiamin)
- Der tilberedes 50 mL 2x Denaturerings gel-opløsning ved at blande 40 mL formamid, 0,5 mL 0,5 M ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA, pH 8,0) og 9,5 mL ddH2O. Opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur. Loading farvestoffer er ikke føjet til denne løsning, da det kan sløre fluorescerende Imaging.
- Forbered 2x Denaturerings gel-belastnings farve som følger. Ved rensning af RNA og DNA-oligonukleotider tilsættes 0,5 mL 2,5% (w/v) bromophenolblåt (BB) og 0,5 mL 2,5% (w/v) xylen cyanol (XC) til den opløsning, der er beskrevet i trin 1.2.1, og der tilsættes 8,5 mL ddH2O i stedet for 9,5 ml. Opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur.
- Der tilberedes 100 mL opløsning A ved vejning 200,2 g urinstof (formel vægt: 60,06 g/mol) og tilsætning af det til 312,5 mL 40% 19:1 acrylamid: N, N'-methylenebisacrylamid. Rør den med en magnetisk omrører ved maksimal hastighed, indtil den opløses (ca. 3 timer) og udgør opløsningen til 500 mL ved hjælp af ddH2O. Bemærk, at de endelige koncentrationer er 6,667 M urea og 25% 19:1 acrylamid: N, N'-methylenebisacrylamid. Opbevares ved 4 °C i rent plasticware.
- 1 L af opløsning B tilberedes ved vejning af 400,4 g urinstof, og opløsningen til 1 L fremstilles med ddH2O; rør, indtil urinstoffet er opløst. Løsning B kan opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered opløsning C (10x Tris-borate-EDTA [TBE]) på følgende måde. Der fremstilles 4 L af 10x TBE ved vejning af 432 g Tris-base og 220 g borsyre, hvorved der tilføjes 160 mL 0,5 M EDTA med en pH-værdi på 8 (filtreret), og opløsningen op til 4 L med ddH2O. En stor bestand af denne buffer er lavet, da det også bruges som gel kører buffer.
- Der tilberedes 10% ammoniumpersulfat (APS) ved at opløse 1 g APS i et samlet rumfang på 10 mL ddH2O. opbevares ved 4 °c.
- Hold tetramethylethylenediamin (TEMED) handy. Opbevar den ved 4 °C sammen med APS-opløsningen.
-
Native PAGE (2x Native gel loading løsning)
- Der fremstilles 50 mL 2x Native gel-belastnings opløsning ved at blande 25 mL 100% glycerol, 10 mL 5x gel-farvnings opløsning og 15 mL ddH2O for at opgøre opløsningen til 50 ml.
Bemærk: som i Denaturerings gel sektionen, kan lastning farvestoffer tilsættes til denne bestand, men deres tilsætning kan potentielt sløre fluorescerende signal i gel og derfor bør undgås.
- Der fremstilles 50 mL 2x Native gel-belastnings opløsning ved at blande 25 mL 100% glycerol, 10 mL 5x gel-farvnings opløsning og 15 mL ddH2O for at opgøre opløsningen til 50 ml.
2. klargøring og lastning af Denaturerings geléer
- Der tilberedes en Denaturerings gel med en passende procentsats ved at følge tabel 1. Overvej det specifikke gel støbning system; 30 ml geler er almindeligt anvendt. Den passende gel-procent kan estimeres ved hjælp af tabel 2: Vælg den polyacrylamidprocent, hvor BB-og XC-farvestofferne har motiliteter, henholdsvis hurtigere og langsommere end det RNA, der er af interesse, for at sikre High-band separation i den relevante størrelse Vifte.
- Bland opløsninger A, B og C i henhold til tabel 1 , og Tilføj ApS og TEMED umiddelbart før gelen hældes. Bland løsningerne godt i rent plasticware.
- Gelopløsningen hældes i et passende gel-støbe apparat, efter at det er sikret, at alle komponenter er omhyggeligt rene. Løft den ene side af apparatet, så gelen vippes lidt, når der hældes, for at undgå, at luftbobler bliver fanget i selve gelen.
- Indsæt den ønskede kam og lad den polymerisere (ca. 30 min.). Overhold Polymeriseringen ved at se nøje efter en ændring i indekset for refraktion omkring gelbrøndene. Der tages en gel tank med 1x opløsning C (1x TBE), og kammen fjernes forsigtigt. Ved hjælp af en sprøjte Aspirer brøndene umiddelbart før indlæsningen af prøven.
- Tilbered Denaturerings prøver på følgende måde. Tilsæt 2x Denaturerings gel-belastnings opløsning til RNA-prøverne af interesse for at gøre Denaturerings gelen til belastnings opløsning 1x og varme-denatur ved 95 °C i 5 minutter ved hjælp af en termo cycler eller et vandbad.
- Før du indlæser prøverne, luft-afkøles dem flere minutter, indtil de er cool at røre ved. Indlæs prøverne ved at lægge dem på bunden af hver brønd, ved hjælp af gel-loading tips.
Bemærk: runde spidser kan bruges til geler af 1 mm tykkelse eller mere; Brug flade spidser til tyndere gels. - Kør Denaturerings geler ved stuetemperatur. Sørg for, at watt-effekt er tilstrækkelig lav til, at glaspladerne på gel-systemet ikke revner.
Bemærk: i vores laboratorium, 28 W for 20 cm x 16 cm plader var tilstrækkeligt til dette formål.
3. klargøring og lastning af indfødte geler
- Forbered en indfødt gel med en passende procentdel ved at referere til tabel 3. Overvej den specifikke gel støbning system, men husk på, at 30 ml geler er almindeligt anvendt. Bland opløsningerne af 1x TBE, 40% 29:1 acrylamid: N, N'-methylenebisacrylamid og glycerol i henhold til tabel 3, og tilsæt ApS og TEMED umiddelbart før hælde gel. Fortsæt som beskrevet i trin 2,3 og 2,4.
- Forbered indfødte prøver ved at tilføje 2x Native gel lastning løsning til RNA prøver af interesse at gøre opløsningen 1x og lad den inkuberere ved stuetemperatur i 100 min før du kører gel for at sikre komplet RNA foldning.
- Kør den oprindelige gel i et koldt rum med 4 °C for at sikre, at watt-effekt er tilstrækkelig lav til ikke at opvarme gelen.
Bemærk: i vores laboratorium, 14 W for 20 cm x 16 cm plader var tilstrækkeligt til dette formål.
4. RNA-forberedelse ved afkørsel T7 transskription
Bemærk: DNA-sekvenser brugt til afløbet transskription10 af RNA mango konstruktioner blev bestilt kommercielt. I denne metode er DNA-oligonukleotider, der indeholder det omvendte komplement (RC) af både den sekvens, der skal transskriberes, og T7-promotoren hybridiseret til en T7-promotor-toplinje sekvens og derefter transskriberet in vitro. For hvert oligonukleotid er RC i Mango's hoved sekvens vist med fed skrift, og RC i T7-promotoren vises med kursiv. Rester i almindelig skrifttype svarer til ellers vilkårlige supplerende spiralformede områder, der kræves for at gøre det muligt for mango kerne at folde korrekt.
Mango I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT cgt ACG TGC Cta Tag TGA GTC GTA TTA AAG
Mango II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCC TCT CCT cgt ACG TGC Cta Tag TGA GTC GTA TTA AAG
Mango III: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC cTT CGT ACG TGC Cta Tag TGA GTC GTA TTA AAG
Mango IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC Act CCC TCG GTA CGT GCC TAT agt gag TCG TAT TAA AG
T7 top strand: CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G
- Præparativ gel rensning af DNA-oligonukleotider
- For en 0,2 μmol-skala DNA-syntese, resuspender det debeskyttede DNA-oligonukleotid i 100 μL af ddH2O og 100 μl af 2x Denaturerings indladnings farve (fra trin 1.2.2). I dette tilfælde foretrækkes det at inkludere gelindladnings farvestoffer i belastnings opløsningen i samme koncentration som i trin 1.2.2.
- DNA-oligonukleotid renses ved hjælp af en 50 mL præparativ skala Denaturerings gel af den relevante polyacrylamidprocent. Brug tabel 2 til at vælge gelprocenten. For eksempel, brug en 8% gel til en 50 NT sekvens. Ideelt set bør bromphenolblåt blå køre hurtigere end oligonukleotid, og xylen cyanol bør køre langsommere.
Bemærk: i vores laboratorium blev sådanne geler støbt ved hjælp af Casting Spacers, der var 1,5 mm tyk og en gel-loading kam med brønde, der var 2 – 2,5 cm bred. - 100 μL af de DNA-oligonukleotidopløsninger, der er fremstillet i trin 4.1.2 pr. præparativ gel, som beskrevet i trin 2.4 – 2.7, indlæses.
- Tør forsigtigt ydersiden af gelen, Fjern glaspladerne, og dæk begge sider af gelen i plastikfolie. Placer det på en fluorescerende billedskærm (aluminium-backed tynde lag kromatografi plader imprægneret med fluorophore er en økonomisk løsning) og bruge en kort bølgelængde UV håndholdt lampe til at visualisere DNA-bands ved UV shadowing.
- En skarp, veldefineret skygge skal observeres, hvis DNA-syntesen er af høj kvalitet. Marker båndene på plastik wrap ved hjælp af en permanent markør.
Bemærk: Beskyt hud og øjne mod UV-lys og hold eksponeringen korte for at undgå at beskadige nukleinsyre prøven. - Anbring gelen på en ren glasplade, skær forsigtigt de markerede bånd ud, og Placer hvert gelfragment i 400 μL 300 mM NaCl. Elute DNA natten over, ved hjælp af en rotator ved stuetemperatur.
- Eluatet opsamles i et rent centrifugeglas, og der tilsættes 2,5 ækvivalenter ethanol for at udfælde DNA. Vortex godt og Anbring røret ved-20 °C i 30 min.
- Prøven pillen i en bænk centrifuge på 156.000 x g i 30 min ved 4 °c. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspender pellet i ddH2O. Brug et spektrofotometer til nøjagtigt at bestemme DNA-oligonukleotidkoncentrationen. Prøven opbevares som en 10 μM-bestand for nemheds skyld ved-20 °C.
- Afkørsels transskription og gel rensning af RNA-prøver
- Forbered 5x nukleosid triphosphat (NTP) lager ved at blande flydende NTP bestande, der består af en endelig koncentration af 40 mM guanosin trifosfat (GTP, 11.400 M-1· cm-1), 25 mm cytidine TRIPHOSPHAT (CTP, 7.600 M-1· cm-1), 25 mm adenosintriphosphat (ATP, 5.000 M-1· cm-1) og 10 mm uridin TRIPHOSPHAT (UTP, 10.000 M-1· cm-1); alle ekstinktions koefficienter ved 260 nm.
Bemærk: flydende eller pulveriserede lagre kan fås kommercielt. Hvis der forberedes primær lagre fra pulver, justeres pH forsigtigt til en endelig pH-værdi på 7,9 ved hjælp af 1 M NaOH. Alikvot bestanden i 1,5 mL mikrocentrifugerings glas og opbevares ved-20 °C. - Forbered 100 mL 10x T7 transkriptionslager ved at blande 25,6 mL 1 M Tris-HCl, 14,4 mL 1 M Tris base, 26 mL 1 M MgCl2, 10 ml 10% Triton X-100 og 0,637 g spermidin. Opfør massen til et endeligt volumen på 100 mL ved at tilsætte ddH2O.
Bemærk: en endelig pH-værdi på 7,9 af 1x opløsningen skal bekræftes ved hjælp af et kalibreret pH-meter. 10x skal steril filtreres og opbevares ved-20 °C i passende størrelses aliquoter. - Udfør transskription som følger.
- Tilsæt følgende reagenser for at gøre en endelig koncentration af 1x T7 transkription-buffer ved hjælp af 10x T7 transkription-stødpudelageret og ddH2O (fra trin 4.2.2), 1X ntps, 10 mm dithiothreitol (DTT), 1 μM T7 top strand sekvens (se punkt 4 note for sekvens), 1 μM gel-renset mango DNA sekvens (trin 2,1) og T7 RNA polymeraseenzym (1 U/μL).
- Vortex, spin ned, og inkube opløsningen ved 37 °C i 2 timer eller indtil den bliver uklar og et hvidt bundfald dannes i bunden af røret. En 50 μL transkription bør resultere i 50 μL af ~ 50 μM RNA efter gel rensning. Tilsæt et tilsvarende rumfang af 2x Denaturerings farvestof og opbevar det ved-20 °C, indtil det er klar til gel rensning.
- Gel-renser det resulterende RNA som beskrevet i DNA-oligonukleotides gel-rense sektionen ved at følge trin 4.1.2 \ u 20124.1.8, hvilket erstatter RNA-prøven for DNA.
Bemærk: RNA er ekstremt følsom over for RNase nedbrydning, så sørg for, at i alle trin, handsker og en ren Lab frakke er slidt på alle tidspunkter. Sørg for, at alle prøver tilberedes og opbevares i engangs plasticware for at beskytte mod RNase-kontaminering, og vask glaspladerne omhyggeligt med varmt sæbe og vand inden brug, skyl dem grundigt med ddH2O, og tør glasset med hjælp af ethanol, der anvendes fra en klemme flaske. - Der anvendes 1 μL af den endelige RNA-prøve, og ved hjælp af et dråbe baseret Spektrofotometer bestemmes absorbansen ved 260 nm. Ved hjælp af en ekstinktionskoefficient, der bestemmes af den nærmeste nabo metode, beregnes RNA-koncentrationen, og prøve koncentrationen justeres til 10 μM med ddH2O for nemheds skyld. Opbevar RNA-prøverne ved-20 °C.
- Forbered 5x nukleosid triphosphat (NTP) lager ved at blande flydende NTP bestande, der består af en endelig koncentration af 40 mM guanosin trifosfat (GTP, 11.400 M-1· cm-1), 25 mm cytidine TRIPHOSPHAT (CTP, 7.600 M-1· cm-1), 25 mm adenosintriphosphat (ATP, 5.000 M-1· cm-1) og 10 mm uridin TRIPHOSPHAT (UTP, 10.000 M-1· cm-1); alle ekstinktions koefficienter ved 260 nm.
- Af Escherichia coli udvinding af rå nukleinsyre i alt
Bemærk: følgende protokol er et eksempel. Denne protokol bruger endogent udtrykte mango i-Tagged 6S RNA fra en plasmid i E. coli, og induktion fra denne plasmid er beskrevet andetsteds i detaljer4.- I forbindelse med denne undersøgelse forberedes 500 mL inducerede celler til både pEcoli-RNA mango og pEcoli-T1-plasmiderne (cellerne induceres ved en OD600Nm af 1). Pellet cellerne og opbevar dem ved-80 °C før brug.
- Udfør RNA-ekstraktion på følgende måde.
- Tag 0,5 mL af den inducerede pEcoli-celle pellet, og tilsæt 500 μL ækvilibreret phenol. Derefter vortex prøven; opløsningen bliver mælkeagtig hvid. Der centrifugeres ved maksimal hastighed i 2 minutter for at adskille lagene.
- Uddrag det øverste lag, som vil være lidt gul, og Gentag trin 4.3.2.1 ved at tilføje en tilsvarende mængde phenol, centrifugering, og udvinding for i alt 5x (eller indtil det midterste lag, som er uigennemsigtig hvid, går væk og kun to klare lag er tilbage).
- Tilsæt fenol-ekstraheret vandig volumen til en tilsvarende mængde chloroform, hvirvel, og derefter centrifugeres ved maksimal hastighed i 2 min.
- Udpak det vandige lag og tilsæt NaCl til en endelig koncentration på 300 mM. Den resulterende nukleinsyre udfælder ved tilsætning af 2,5 ækvivalenter ethanol, vortex, spin ned og bundfald ved-20 °C i mindst 30 min.
- Pellet i en bænk centrifuge på 15,6 x 1.000 x g ved 4 °c i 30 min. forsigtigt fjerne supernatanten og gensuspendere pellet i 100 ΜL af DDH2O.
- Tilføj en DNase I fordøjelsestrin til denne procedure, efter den refererede protokol11, for at opnå total RNA.
Bemærk: vortex kraftigt indtil pellet er helt opløst i ddH2O.
5. efter-gel farvning
- Forbered 1x gel farvnings opløsning som pr opskriften i trin 1.1.3 og føje den til en ren glasbeholder, der er bred nok til at behageligt passer til gelen.
Bemærk: Borosilicat glasbeholdere med snap fit låg tjener dette formål godt. - Tilsæt nok 1x gel farvnings opløsning til beholderen, så gelen er helt dækket med opløsningen og de flydende skvulper over toppen af gelen, når den er placeret på orbital rotator.
Bemærk: beholderen skal være stor nok til at passe til gelen, så den kan bevæge sig rundt og have nok buffer i beholderen til at dække gelen fuldt ud. - Når den oprindelige eller Denaturerings gelen er færdig med at køre (henholdsvis punkt 2 eller 3), fjernes gelen fra apparatet, og brøndene afskårne. Det kan være nyttigt at fjerne et hjørne af gelen til orientering senere i analysen.
- Overfør forsigtigt gelen til 1x gel-Farvningsopløsningen, der er fremstillet i trin 5,2.
Bemærk: gelerne er skrøbelige og tilbøjelige til at bryde så vær forsigtig, når du overfører gelen. Opbevar altid låget på farvnings beholderen, så gelen ikke forureres. - Gelen anbringes på en orbitalrotator med en hastighed på 100 rpm i 30 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: Sørg for, at gelen ikke foldes tilbage på sig selv; ellers kan RNA sprede sig ud af gelen og dermed mærke en anden del af gelen.
6. Imaging mango-mærkede RNAs i gel
- Forsigtigt dekanteres billedbufferen. Skyl gelen hurtigt med vand, og sørg for, at der er nok væske tilbage til at holde gelen lidt mobil i beholderen.
- Overfør forsigtigt gelen over på Imager. Overfør ved forsigtigt at afhente gelen og anbringe den på Imager bakken; Alternativt kan gelen langsomt hældes på bakken. Sørg for, at der ikke er bobler under gelen, og at der ikke er overskydende væske under gelen. En pipette, der rulles over gelen, kan være nyttig til at fjerne overskydende væske.
Bemærk: Brug et papirhåndklæde til at opsuge den overskydende væske. - Tag en gel billede, observere fluorescens mellem excitation bølgelængde 510 nm og emission bølgelængde 535 nm (for eksempel grønt lys ved 520 nm bølgelængde fluorescens indstillinger på Imager). Sørg for, at indstillingerne er fuldt optimeret på instrumentet, og følg omhyggeligt anvisningerne for det anvendte instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korte mango-mærkede RNAs blev udarbejdet som beskrevet i protokol afsnittet. Antages det, at fluorescens i Denaturerings betingelser ville være mest vanskeligt at observere på grund af tilstedeværelsen af urinstof i geler, vi først undersøgt modstanden af mango aptamerer til urinstof, der fungerer som en nukleinsyre denaturerende. Vi fandt, at mango aptamers er væsentligt modstandsdygtige over for denaturering op til en urea koncentration på ca. 1 M (figur 2a). Før tilsætning af gelfarvning til en Denaturerings gel er den endelige koncentration af urinstof i gelen 6 M. tilsætning af tilstrækkelig farvnings opløsning til at reducere denne koncentration til 1 M ville derfor være optimal for at sikre fuld mango fluorescens for alle fire aptamatorer. I praksis har farvnings protokollen opnået mindre end dette fuldt optimale resultat, men dette kunne simpelthen afhjælpes, hvis det er nødvendigt ved hjælp af mere farvnings løsning eller ved den enkle mulighed for at ændre opløsningen én gang under farvning.
Når mango-mærkede RNA-konstruktioner blev kørt ind i en Denaturerings gel, blev farvnings tiden optimeret til maksimal gel-fluorescens ved at læsse tre forskellige mango III-mængder ind i en 8% Denaturerings gel (figur 2b). En tid kursus afslørede, at efter 5 min af iblødsætning i gel farvning opløsning, fluorescens var klart synlig. Maksimal fluorescens af mango III-konstruktionen blev opnået efter 20 – 40 min farvning, hvorefter de små RNA'er, der blev anvendt i dette studie, begyndte at sprede sig ud af gelen, hvilket resulterede i et tab af fluorescerende signal (figur 2b). Derfor blev både indfødte og Denaturerings geler plettet i 30 min. hver. Længere RNA-konstruktioner kunne let tåle længere bejdsede tider, da de ville være langt mindre tilbøjelige til at sprede sig ud af gelen.
Nogle af de RNA mango aptamers foldet hurtigere end andre. Hver af de mango aptamatorer, der anvendes i denne undersøgelse blev inkueret i en gel buffer suppleret med 1,5 M urea og 100 nM TIL1-biotin farvestof og analyseret ved hjælp af et fluorometer. Mango I, II, og III blev fuldt foldet efter 10 min, hvorimod mango IV blev væsentligt foldet først efter 40 min (figur 3a). I mangel af urinstof var foldning langt hurtigere som forventet (figur 3b). For at sikre, at de indfødte gel prøver var fuldt foldet, vi forinkuerede prøver for 100 min før du kører dem i native gels. Praktisk, data i figur 3 antyder denne gang kunne reduceres væsentligt afhængigt af mango aptamer anvendes.
Når protokollen var optimeret til at detektere RNA mango aptamer fluorescens, blev følsomheden af post-farvning metode bestemt for hver af de mango varianter i begge indfødte gels. Der blev observeret enkelte bånd svarende til velfoldede RNA'er for hver af de fire Mangos i native geler (figur 4a). Ved seriel fortynding, så lidt som 62,5 fmol af mango II kunne observeres, mens så lidt som 125 fmol af mango I, III, og IV var let visualiseret. Kvantificeringen af indfødte geler var log-lineær over omkring 1,5 størrelsesordener, med mango i, II, og IV opfører sig på en mere lineær måde end mango III (figur 4b).
Resultaterne af Denaturerings geler var lidt mindre følsomme end de indfødte geler, men var mere lineære. Så lidt som 125 fmol af mango II og III blev let opdaget (figur 4c). Det er interessant, at kvantificeringen (figur 4d) tydede på, at Denaturerings geler var loglineære eller to størrelsesordener. Vi antager, at tilstedeværelsen af urinstof i Denaturerings gelen kan være en mere homogen måde at folde aptamerne på, når de er anbragt i en form, der i modsætning til de indfødte geler, hvor RNA-folderne måske blev udsat for delvis denaturering under gel-processen. med en opløsning af en TIL1-Biotinfarvning.
Som ved alle gel farvningsmetoder, hvis gelen ikke overføres omhyggeligt til beholderen, eller hvis den roterende hastighed er for høj i farvnings perioden, kan gelen folde sig tilbage på den selv (figur 5a). Dette kan resultere i mango-mærkede RNA prøve sprede fra ét sted af gel til en anden, men kan let undgås i praksis. I native geler og, især, for mango IV, bemærkede vi, at ufuldstændig folde kan manifestere sig i udseendet af flere bands formentlig svarer til delvist/misfoldede RNA-konformationer (figur 5b) som følge af kortere folde tider. Folde problemer i native geler kan undgås ved at forinkuere RNA-prøver korrekt som tidligere beskrevet og ved at køre indfødte geler i et koldt rum. I Denaturerings gels, hvor RNA folder in situ inden for gel, er det ikke et væsentligt problem at folde sig ud. Endelig, i fravær af RNA, meget lidt baggrunds fluorescens blev observeret i enten gel-system.
Dernæst blev specificiteten af RNA mango-mærket undersøgt ved at over udtrykke de 6S-regulerende RNA i bakterier. Dette RNA blev tidligere tagget med mango I (figur 1E)4. Bakterielle celler blev omdannet med enten pEcoli-RNA mango plasmid (fremover M plasmid) eller pEcoli-T1 plasmid som en negativ kontrol (herefter E plasmid). Transformerede celler blev dyrket i flydende lysogeny bouillon medium indtil en OD600 af 1,0 blev nået. Kulturerne blev derefter induceret med 50 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) i 40 min. Cellerne blev høstet via centrifugering ved 6.000 x g i 15 min. total RNA blev ekstraheret ved hjælp af phenol-phenol chloroform ekstraktion fra celle pellets12 som beskrevet i protokol afsnittet. De totale RNA-prøver blev koncentreret ved ethanoludfældning og blev derefter behandlet med DNase I efter protokollen for at fjerne DNA11. Før brug blev RNA koncentreret ved ethanoludfældning.
Totalt bakterielt RNA blev kørt ind i 8% Denaturerings geler (figur 6) og farves med enten SG13 eller 1-biotin. For SG-farvning blev 10 μL 10 000x SG føjet til 100 mL gel buffer; i modsat fald var farvnings protokollen identisk med den, der blev anvendt i forbindelse med TIL1-biotin. Som forventet, stærk SG farvning blev observeret for en lang række RNAs, men mest fremtrædende for ribosomal (rRNA) og overføre RNAs (tRNA) (figur 6, venstre panel). Mens den mango-afhængige farvning (M baner) kunne ses i disse SG-farvede geler, kunne de ikke identificeres entydigt givet det komplekse farvnings mønster observeret ved hjælp af denne universelle plet. I modsætning hertil fremhævede de til1-biotinfarvede geler, at mango-afhængige bands var de mest fremtrædende bands. Kun ribosomal RNA-båndene ses at konkurrere med de 6S mango-afhængige bands. Der kunne også observeres en række ikke-specifikt farvede bånd. Ikke desto mindre var de mango-afhængige bands igen dominerende, idet de kun havde rRNA-og tRNA-bands som svagt konkurrerende konkurrenter (figur 6, højre panel).
Figur 1: mango aptamer system. A) 1-biotinfluorophore. (B) mango I. (c) mango II. D) mango III. Paneler B-D viser den sekundære struktur af hver aptamer. P1 er en vilkårlig stamme. Den GNRA-lignende stængel sløjfe (her GAAA) fundet i mango i og II er vist i rødt, Triplex motiv af mango III er vist i lilla. (E) 6s Regulatory RNA mærket med mango i. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: effekten af urinstof på mango aptamer fluorescens og optimale farvnings tider. (A) en urinstof titrering med 50 nm RNA mango I (orange cirkler), mango II (grønne cirkler), mango III (lilla cirkler) og mango IV (blå cirkler), sammen med 100 nm 1-biotin farvestof og ved de angivne urinstof koncentrationer. Prøverne blev inkueret i 40 minutter før fluorescens blev læst ved en excitation bølgelængde på 510 nm og en emission bølgelængde på 535 nm. (B) mango III RNA blev lastet i en 8% Denaturerings gel og farves med en gel opløsning, der indeholder 20 Nm endelig 1-biotin farve. For hvert angivet tidspunkt, 0,064, 0,32 og 1,6 pmol af mango III RNA blev brugt fra venstre mod højre. Gel billedet blev visualiseret med en fluorescens Imager ved hjælp af en 520 nm laser og en 10 min eksponering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: folde tider af mango aptamere i tilstedeværelse og fravær af urinstof. (A) ved tilstedeværelse af 1,5 M urea og 100 nm 1-biotin blev der udført fluorescens tidsforløb ved hjælp af 50 nm for hver RNA mango-konstruktion (RNA mango i: orange prikker, mango II: grønne prikker, mango III: lilla prikker og mango IV: blå prikker). B) identisk med panel A, undtagen i mangel af urinstof. Alle tidsforløb blev udført ved stuetemperatur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: fluorescerende billeder af indfødte og Denaturerings side med RNA mango konstruktioner. (A) en 8% indfødt gel med serielt fortyndet RNA mango konstruktioner. Lanes I, II, III og IV indeholder hver især 8 pmol-mængder af RNA mango I, II, III og IV. De højre paneler er to serielle fortyndinger, der indeholder 4 pmol, 2 pmol, 1 pmol, 0,5 pmol, 0,25 pmol, 0,125 pmol og 0,0625 pmol af enten mango I, II, III eller IV, som angivet. Lane 12 indeholder ingen RNA. B) kvantificering af tre replikater af den oprindelige gel (standardafvigelsen for den viste middelværdi for hver). C) en 8% Denaturerings gel med de samme prøver lastet som i panel A, bortset fra det forhold, at der blev anvendt Denaturerings gel-opløsning i stedet for den oprindelige gel-belastnings opløsning. D) tre kvantificerede replikater af Denaturerings gel (standardafvigelsen for den viste middelværdi for hver enkelt). Alle gel billeder blev visualiseret en gel Imager med en 520 nm laser og en 10 min eksponering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: suboptimale geler og ufuldstændig foldning af mango IV i en 8% Native gel. A) en seriel fortynding af den type, der er vist i figur 4 for mango II, men som viser virkningen af gel foldning under farvnings protokollen. (B) mango IV Native gel prøver, der ikke fik lov til at folde længe nok i native buffer før gel lastning udstille dobbelt bands. Ellers er disse resultater svarer til mango IV resultater vist i figur 4a. Alle gel billeder blev visualiseret ved hjælp af en gel Imager med en 520 nm laser og en 10 min eksponering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: mango-mærkede RNA'er kan detekteres ved tilstedeværelse af total-RNA ved brug af til1-biotin farvning. 8% Denaturerings geler blev lastet med 100 ng af total RNA og blev kørt i 30 min. Den venstre gel blev plettet med SG og det højre panel med TIL1-biotin. For begge paneler, baner mærket E blev lastet med 100 ng af pEcoli-T1 (ingen mango tag) og baner mærket M blev lastet med 100 ng af pEcoli-RNA mango (6S RNA mærket med en mango jeg tag). Der blev visualiseret med en Imager med en 520 nm-laser og en eksponering på 10 min. SG-farvede gel billeder blev visualiseret ved hjælp af en gel Imager ved hjælp af en 460 nm laser og en 10 min eksponering. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Procentdel | GEL VOLUMEN | |||
| 20 mL af | 30 mL af | 50 mL | ||
| 5 | A | 4 | 6 | 10 |
| B | 14 | 21 | 35 af | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 6 | A | 4,8 af | 7,2 af | 12 |
| B | 13,2 af | 19,8 af | 33 af | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 8 | A | 6,4 af | 9,6 af | 16 |
| B | 11,6 af | 17,4 af | 29 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 10 | A | 8 | 12 | 20 |
| B | 10 | 15 | 25 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 12 | A | 9,6 af | 14,4 af | 24 |
| B | 8,4 af | 12,6 af | 21 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 15 | A | 12 | 18 | 30 |
| B | 6 | 9 | 15 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 20 | A | 16 | 24 | 40 af |
| B | 2 | 3 | 5 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| APS (μL) | 48 af | 72 af | 120 af | |
| TEMED (μL) | 20 | 30 | 50 af | |
Tabel 1: denaturering side gel støbning tabel. A = løsning A, B = løsning B, C = løsning C.
| Denaturerings gel% | BB (~ mobilitet NT) | XC (~ mobilitet i NT) |
| 5 | 35 af | 130 af |
| 6 | 26 | 106 af |
| 8 | 19 | 70-80 af |
| 10 | 12 | 55 af |
| 20 | 8 | 28 |
| 23 | 5-6 af |
Tabel 2: omtrentlig gel-mobilitet af bromophenolblåt (BB) og xylen cyanol (XC)-gel, der indlæser farvestoffer i polyacrylamiddenaturerings gels.
| Procentdel | GEL VOLUMEN | |||
| 20 mL af | 30 mL af | 50 mL | ||
| 5 | 1X TBE | 16,5 af | 24,75 af | 41,25 af |
| 40% 29:1 acrylamid: N, N'-methylenebisacrylamid | 2,5 af | 3,75 af | 6,25 af | |
| Glycerol | 1 | 1,5 af | 2,5 af | |
| 6 | 1X TBE | 16 | 24 | 40 af |
| 40% 29:1 acrylamid: N, N'-methylenebisacrylamid | 3 | 4,5 af | 7,5 af | |
| Glycerol | 1 | 1,5 af | 2,5 af | |
| 8 | 1X TBE | 15 | 22,5 af | 37,5 af |
| 40% 29:1 acrylamid: N, N'-methylenebisacrylamid | 4 | 6 | 10 | |
| Glycerol | 1 | 1,5 af | 2,5 af | |
| 10 | 1X TBE | 14 | 21 | 35 af |
| 40% 29:1 acrylamid: N, N'-methylenebisacrylamid | 5 | 7,5 af | 12,5 af | |
| Glycerol | 1 | 1,5 af | 2,5 af | |
| 12 | 1X TBE | 13 | 19,5 af | 32,5 af |
| 40% 29:1 acrylamid: N, N'-methylenebisacrylamid | 6 | 9 | 15 | |
| Glycerol | 1 | 1,5 af | 2,5 af | |
| 15 | 1X TBE | 11,5 af | 17,25 af | 28,75 af |
| 40% 29:1 acrylamid: N, N'-methylenebisacrylamid | 7,5 af | 11,25 af | 18,75 af | |
| Glycerol | 1 | 1,5 af | 2,5 af | |
| 20 | 1X TBE | 9 | 13,5 af | 22,5 af |
| 40% 29:1 acrylamid: N, N'-methylenebisacrylamid | 10 | 15 | 25 | |
| Glycerol | 1 | 1,5 af | 2,5 af | |
| APS (μL) | 48 af | 72 af | 120 af | |
| TEMED (μL) | 20 | 30 | 50 af | |
Tabel 3: indbygget side gel støbning tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En væsentlig fordel ved mango fluorescerende tag er, at et enkelt tag kan bruges på flere måder. Den høje lysstyrke og affinitet af disse aptamers gør dem nyttige ikke kun for i celle visualisering2 , men også for in vitro-RNA eller RNP rensning4. Derfor, gel Imaging udvider alsidigheden af mango tag på en enkel måde. Følsomhed for mango gel-billeddiagnostik er lidt mindre end en nordlige blot14 , men kan nemt detektere 60 – 120 fmol af RNA-prøven uden at behøve langvarig og kedelig membran overførsel og sondering trin. Dette kan sammenlignes med den hybridiserings baserede probings effektivitet, der tidligere blev fundet for små RNA'er i gel15. Mens andre fluorogene aptamer metoder-især, RNA spinach-har større følsomhed og specificitet9, ingen i øjeblikket har samtidig den høje lysstyrke og affinitet af mango aptamer system, som tillader en enkelt RNA tag at være anvendes til cellulær billeddannelse, RNP-rensning og nu gel-billedbehandling.
Der er et par kritiske trin i denne gel farvning protokol. Når du arbejder med RNA-opløsninger, skal løsningerne steril filtreres, og der bør anvendes engangs plasticware. Catuion, der kører indfødte geler som komplekser eller RNA strukturer kan let denatureres, hvis effektniveauer for gelen er for høj og resultere i gel opvarmning. Sørg for, at brugt glas er rent og ikke forurenet med Rnaser. Derudover skal du altid være forsigtig, når du overfører og picking up geler, da de er skrøbelige og kan være tilbøjelige til at bryde.
Den 1-Biotinpletten trænger hurtigt ind i geler, men de data, der præsenteres her, indikerer også, at mango IV-foldning især kan være hastighedsbegrænsende (figur 2 og figur 3). Ved hjælp af de betingelser, der er angivet i protokol afsnittet, observerede vi loglineær opførsel for alle fire aptamerer over to størrelsesordener i Denaturerings gels, hvilket gør metoden anvendelig til kvantificering (figur 4c, D). Da de små mango aptamere, der anvendes i denne undersøgelse let spredes ud af gel matrix, vi forventer, at kvantificeringen til at forbedre for længere RNA konstruktioner.
Den mango tag gel Imaging metode demonstreret her er robust og forventes at være i stand til at blive simpelthen forlænget med hensyn til følsomhed og specificitet. Mango I, II, og III fold pålideligt, mens mango IV ikke. Selv om vi ikke har undersøgt affarvning af protokoller, forventer vi, at en sådan fremgangsmåde også blot kan forbedre specificiteten. Selv om det er uden for dette arbejdes anvendelsesområde, forekommer fluorescens og biotin-mærket, der er tildelt mango-mærkede RNA, når der anvendes TIL1-biotin-fluorophore, med stor sandsynlighed yderligere at strømline gel-analyse og rensning. Kommercielt tilgængelige sekundære biotin-mærkning teknikker, for eksempel, lover at yderligere at øge detektionsgrænserne for dette enkle RNA mango-tagging system. Ligeledes, det forekommer sandsynligt, at indfødte mango-mærkede RNA-protein komplekser kan elueret fra en gel og genvundet ved hjælp af streptavidin magnetiske perler for at fange elueret RNA kompleks. Dette ville yderligere forenkle den rutinemæssige rensning af biologisk vigtige RNAs og RNA-komplekser ved den simple udvej at tilføje en mango tag til RNA af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Et patent er verserende på mango fluorogen system.
Acknowledgments
Forfatterne takker Razvan Cojocaru og Amir Abdolahzadeh for deres tekniske assistance og Lena Dolgosheina for korrekturlæsning af manuskriptet. Der blev ydet støtte til dette projekt af et canadisk naturvidenskabs-og ingeniør Forskningsråd (NSERC), der operer med tilskud til P.J.U.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
