Summary
כאן אנו מציגים רגיש, מהיר, ומפלה שיטת להפלות מכתים את התמונה rnas מתויג עם ה-RNA מנגו aptamers I, II, III, או IV, באמצעות מקורי או באמצעות הרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. לאחר הפעלת ג'לים סטנדרטיים של דף, מנגו-מתויג RNA יכול להיות מוכתם בקלות עם TO1-Biotin ולאחר מכן ניתח באמצעות קוראי קרינה זמינים נפוץ.
Abstract
באופן שגרתי ובאמצעות ג'ל פוליאקרילמיד משמשים לאפיון מורכבות של ריבונאופלפרוטאין (RNP) ולמדידת גודל RNA, בהתאמה. כמו שיטות רבות של הדמיה ג'ל להשתמש כתמים לא ספציפיים או בדיקה fluorophore יקר, רגיש, להפלות, ומתודולוגיות הדמיה חסכונית-ג'ל הם רצויים מאוד. RNA רצפי הליבה של מנגו הם קטנים (19-22 nt) רצף מוטיבים כי, כאשר נסגר על ידי גזע שרירותי RNA, יכול להיות פשוט ובזול מצורף ל-RNA של עניין. אלה תגי מנגו לאגד עם אהדה גבוהה וספציפיות thiazole-כתום fluorophore ליגיום הנקרא TO1-Biotin, אשר הופך אלפי פעמים פלורסנט יותר על הכריכה. כאן אנו מראים כי מנגו I, II, III, ו IV יכול לשמש במיוחד בתמונה RNA ב ג'לים עם רגישות גבוהה. קצת כמו 62.5 fmol של RNA ב ג'לים מקומיים ו 125 fmol של RNA בג הרפתקאות ניתן להבחין על ידי ג'ל הטבילה במאגר דימות המכיל אשלגן ו 20 ננומטר TO1-Biotin עבור 30 דקות. אנו להדגים את הספציפיות של מנגו מערכת מתויגים על ידי דימות מנגו-שתייגת ה-RNA בקטריאלי של 6S בהקשר של תערובת מורכבת של רנ א חיידקי הכולל.
Introduction
מנגו הוא מערכת תיוג RNA המורכב מסדרה של ארבעה RNA פלורסנט קטנים aptamers לאגד בחוזקה (כריכת nanomolar) כדי נגזרות פשוטות של thiazole-כתום (TO1-Biotin, איור 1A)1,2,3 . עם הכריכה, הקרינה הפלואורסצנטית של זה הוא גדל 1,000-to 4,000-לקפל בהתאם לאפאלף המסוים. בהירות גבוהה של מערכת מנגו, אשר עבור מנגו III עולה על זה של חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP), בשילוב עם הזיקה של האיגוד nanomolar של ה-RNA מנגו aptamers, מאפשר לו לשמש הן הדמיה וטיהור של RNA תסביכים2,4.
רנטגן מבנים של מנגו אני5, השני6, ו III7 היו נחושים ברזולוציה גבוהה, וכל שלושת Aptamers לנצל את ה-RNA 4 מ א כדי לאגד TO1-biotin (איור 1b– D). הליבות הקומפקטיות של כל שלושת האפתמים מבודדים מרצף ה-RNA החיצוני באמצעות מוטיבים מתאם קומפקטיים. מנגו I ו-II לנצל מתאם גמישה GNRA כמו לולאה כדי לחבר את ליבות מנגו שלהם לדופלקס RNA שרירותי (איור 1B, C). לעומת זאת, מנגו השלישי משתמש מוטיב טריפלקס נוקשה לחבר את הליבה שלה סליל RNA שרירותי (איור 1D, שאריות סגולים), בעוד המבנה של מנגו IV אינו ידוע כעת. כמו הליבה ליגולי מחייב של כל אחד מהאפתמים האלה מופרד מרצף ה-RNA החיצוני על ידי המתאמים הללו, נראה כי הם יכולים להיות פשוט שולבו מגוון של RNAs. ה-rna התלת-ממדי של החיידק (מנגו i), הרכיבים של השמרים מלצונים (מנגו i), ו-rna 5s, U6 rna, ו-C/D scarna (מנגו II ו IV) כל היתה בהצלחה מתויג באופנה2,8, הרומז כי רבים RNAs ביולוגי יכול להיות מתויג באמצעות RNA מנגו מערכת aptamer.
הרפתקאות מקורי וג משמשים בדרך כלל כדי ללמוד RNAs. ג'לים משומשים משמשים לעתים קרובות כדי לשפוט את הגודל או העיבוד של RNA, אבל בדרך כלל, במקרה של כתם בצפון, למשל, דורשים מספר שלבים איטיים ורציפים כדי ליצור תמונה. בעוד כאשר ה-RNA fluorogenic אחרים, כמו תרד RNA וברוקולי, כבר נעשה שימוש בהצלחה עבור הדמיה ג'ל9, אין מערכת apers fluorogenic עד היום בעל בהירות גבוהה ואהדה של מערכת מנגו, מה שהופך אותו עניין רב לחקור יכולות הדמיה ג'ל של מנגו. במחקר זה, תהינו אם מערכת ה-RNA מנגו יכול להיות פשוט מורחב ג'ל הדמיה, כמו עירור אורכי גל פליטה של TO1-Biotin (510 nm ו 535 nm, בהתאמה) מתאימים הדמיה בערוץ eGFP משותף הפלורסנט ביותר מכשור סריקת ג'ל.
הפרוטוקול שלאחר ג'ל מכתים הציג כאן מספק דרך מהירה במיוחד לזהות מנגו מתויגות מולקולות RNA ב מקורי והרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. זו שיטת הצביעת כוללת ג'ל לטבילה במאגר המכיל אשלגן ו-TO1-Biotin. רנ א מנגו aptamers הם G-ארבעה מבוססי plex ו אשלגן נדרש כדי לייצב מבנים כאלה. באמצעות RNA ששועתק מ מינימלי קידוד מנגו תבניות DNA (לראות את מדור הפרוטוקול), אנחנו יכולים פשוט לזהות מעט ככל 62.5 fmol של RNA ב ג'לים מקומיים ו 125 fmol של RNA ב-הרפתקאות ג ' לים, באמצעות פרוטוקול מכתים ישירה. בניגוד לכתמי חומצות גרעין לא ספציפיות (ראה טבלת חומרים, המכונה SG מכאן), אנחנו יכולים לזהות בבירור מנגו-rna מתויג גם כאשר ריכוזים גבוהים של רנ א מתויג סך קיימים במדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הריאגנטים
-
TO1-ביוטין הפתרון החותמות (ג'ל צביעת פתרון)
- לעשות 1 L של 1 מטר מאגר פוספט ב-pH 7.2 בגובה 25 ° c על ידי הוספת 342 mL של 1 M של Na2hpo4 ו 158 ML של 1 m נה2PO4. להתאים את ה-pH ל 7.2 ב 50 mM על ידי הוספת פתרון פוספט מתאים. מסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר ואחסן את הפתרון בכלי הפלסטיק בטמפרטורת החדר.
- להכין פתרון 5x ג'ל מכתים (ללא TO1-Biotin) כדלקמן. לפצות על 1 L פתרון על ידי ערבוב 247.5 mL של ddH2O, 700 mL של 1 m kcl, 50 ml של 1 m פוספט מאגר (pH 7.2), ו 2.5 Ml של רצף 20. מסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר ואחסן את הפתרון בפלסטלינה. ניתן לאחסן אותו בטמפרטורת החדר.
הערה: MgCl2 ניתן להוסיף פתרון זה אם נדרש כפי שהוא יכול לייצב את מכלולי RNA. לזאת תהיה השפעה צנועה. על אות הפלורסצנט2 - הפוך את הפתרון 1x ג'ל כתמים באמצעות הפתרון 5x ג'ל מכתים משלב 1.1.2 ו, מיד לפני השימוש, מוסף אותו עם TO1-Biotin fluorophore (ראה טבלת חומרים) לריכוז הסופי של 20 ננומטר. לדוגמה, להוסיף 20 מ ל של הפתרון 5x ג'ל כתמים כדי 80 mL של מים מיועמים כדי להפוך 100 mL של 1 x ג'ל כתמים הפתרון, ולהוסיף 2 μL של 1 מ"מ TO1-Biotin מלאי (מוכן diמתילטופסמיד).
הערה: מקדם המחיקה עבור הצבע TO1-Biotin ב 500 nm הוא 63,000 M-1· ס"מ-1, נמדד בפתרון מכתים1.
-
עמוד הרפתקאות (2x הרפתקאות ג'ל טעינת פתרון ופתרונות A, B, C, אמוניום פרסולפט, ו טטרמתיליפילואמין)
- הכינו 50 מ ל של 2x העמסה ג'ל טעינת הפתרון על ידי ערבוב 40 מ ל של הטופס1, 0.5 מ ל של 0.5 החומצה האטילילאדיבאמאטאטואצטט (EDTA, pH 8.0), ו 9.5 mL ddH2O. ניתן לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר. הטענת צבעים אינה מתווספת לפתרון זה, כפי שהיא עשויה להסתיר הדמיה פלואורסצנטית.
- להכין 2x הרפתקאות ג'ל טוען לצבוע כדלקמן. כאשר טיהור RNA ו-DNA olig, להוסיף 0.5 mL של 2.5% (w/v) ברומאופנול כחול (BB) ו 0.5 mL של 2.5% (w/v) קסילן cyanol (XC) לפתרון המתואר בשלב 1.2.1, ולהוסיף 8.5 ml של ddh2O במקום 9.5 ml. ניתן לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
- להכין 100 mL של הפתרון על ידי שקילה החוצה 200.2 g של אוריאה (משקל הנוסחה: 60.06 g/מול) והוספת אותו ל 312.5 mL של 40% 19:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין. מערבבים את זה עם בר לערבב מגנטי במהירות מקסימלית עד הומס (כ 3 h) ולהפוך את הפתרון ל 500 mL באמצעות ddH2O. שים לב כי הריכוזים הסופיים הם 6.667 M אוריאה ו 25% 19:1 אקרילאמיד: N, n'-מתיונין אקרילי. אחסן ב-4 ° צ' בכלי פלסטיק נקיים.
- להכין 1 L של פתרון B על ידי שקילה 400.4 g של אוריאה ולפצות את הפתרון 1 L עם ddH2O; מערבבים עד אוריאה התפרקה. פתרון ב' ניתן לשמור בטמפרטורת החדר.
- להכין פתרון C (10x טריס-borate-EDTA [TBE]) כדלקמן. הכן 4 L של 10x tbe על ידי שקילה החוצה 432 g של בסיס Tris ו 220 g של חומצה חומצת, הוספת 160 mL של 0.5 M edta עם pH של 8 (מסוננים), וממציא את הפתרון ל 4 L עם ddh2O. מלאי גדול של מאגר זה נעשה כפי שהוא משמש גם ג'ל פועל מאגר.
- הכינו 10% אמוניום פרסולפט (aps) על ידי המסת 1 גרם של APS לתוך נפח כולל של 10 mL של ddh2O. Store ב 4 ° c.
- יש לשמור על הטטרמתילילאדיאמין (TEMED) שימושי. אחסן אותו ב-4 ° c ביחד עם פתרון APS.
-
דף מקורי (פתרון העמסה של 2x של ג'ל יליד)
- להכין 50 mL של 2x מקורית ג'ל טעינה פתרון על ידי ערבוב 25 מ ל של 100% גליצרול, 10 מ ל של הפתרון 5x ג'ל כתמים, ו 15 מ ל של ddH2O כדי להפוך את הפתרון ל 50 mL.
הערה: כמו בסעיף ג'ל הרפתקאות, ניתן להוסיף צבעים למניה הזאת, אבל התוספת שלהם יכולה לטשטש את אות הפלורסנט בג, ולכן יש להימנע מכך.
- להכין 50 mL של 2x מקורית ג'ל טעינה פתרון על ידי ערבוב 25 מ ל של 100% גליצרול, 10 מ ל של הפתרון 5x ג'ל כתמים, ו 15 מ ל של ddH2O כדי להפוך את הפתרון ל 50 mL.
2. הכנה וטעינה של ג'לים
- הכינו ג'ל הרפתקאות עם אחוז מתאים על-ידי ביצוע הטבלה 1. קחו בחשבון את השיטה הספציפית ליציקת ג'ל; 30 מ ג ג'ל משמשים בדרך כלל. אחוז הג המתאים יכול להיות מוערך על ידי שימוש בטבלה 2: לבחור את האחוז אלקטרופורזה שבו הצבעים BB ו-XC יש הרבה יותר מהר ואיטי, בהתאמה, מאשר RNA של ריבית, כדי להבטיח הפרדה גבוהה להקות בגודל הרלוונטי טווח.
- פתרונות מערבבים A, B ו-C לפי לוח 1 ולהוסיף APS ו-temed מיד לפני שפיכת ג'ל. מערבבים היטב את הפתרונות בפלסטלינה נקייה.
- יוצקים את התמיסה ג'ל לתוך מכשיר מתאים ליציקת ג'ל, לאחר שווידאת שכל הרכיבים נקיים בקפידה. הרם צד אחד של המנגנון כך ג'ל מוטה מעט כאשר מוזג, כדי למנוע כל בועות אוויר להיות לכודים בתוך הג עצמו.
- הכנס את המסרק הרצוי והשאר אותו לפולימלזציה (כ -30 דקות). שימו לב לפילמור על ידי התבוננות מקרוב לשינוי במדד השבירה סביב הבארות ג'ל. הפוך את הטנק ג'ל באמצעות 1x פתרון C (1x TBE) ובזהירות להסיר את המסרק. שימוש במזרק, מעמיס את הבארות. מיד לפני הטעינה לדגימה
- הכינו דוגמאות לדגימות כדלקמן. הוסף מעבד 2x העברת ג'ל טעינת פתרון לדגימות ה-RNA של עניין כדי להפוך את הג הרפתקאות הטעינה של פתרון 1x ו-החום בטמפרטורה 95 ° c עבור 5 דקות באמצעות הציקלניה או אמבט מים.
- לפני טעינת הדגימות, האוויר מצנן אותם כמה דקות עד שהם מגניבים למגע. טען את הדגימות על-ידי שכבות אותן בתחתית כל באר, באמצעות עצות טעינת ג'ל.
הערה: ניתן להשתמש בעצות עגולות עבור ג'לים בעובי של 1 מ"מ או יותר; להשתמש בטיפים שטוחים ג'לים דקים. - הפעל את ג'ל ההפעלה בטמפרטורת החדר. ודא כי המתח החשמלי הוא נמוך מספיק, כך שלוחות הזכוכית של מערכת הג לא נשברים.
הערה: במעבדה שלנו, 28 ואט עבור 20 ס מ x 16 ס"מ צלחות היה מספיק למטרה זו.
3. הכנה והעמסה של ג'לים מקומיים
- הכינו ג'ל יליד עם אחוז מתאים על-ידי פנייה לטבלה 3. קחו בחשבון את מערכת הליהוק ג'ל ספציפי, אבל זכור כי 30 מ"ל ג'ל משמשים בדרך כלל. מערבבים את הפתרונות של 1x TBE, 40% 29:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין לאמילאמיד, ו גליצרול על פי שולחן 3, ולהוסיף APS ו temed מיד לפני שפיכת ג'ל. המשך כמתואר בשלבים 2.3 ו-2.4.
- הכינו דגימות יליד על ידי הוספת 2x מקורי הפתרון המקורי ג'ל לדגימות RNA של עניין כדי להפוך את הפתרון 1x ולאפשר את זה כדי דגירה בטמפרטורת החדר עבור 100 דקות לפני הפעלת ג'ל כדי להבטיח קיפול RNA שלם.
- הפעל את הג המקורי בחדר קר 4 ° c, וודא שהספק נמוך מספיק כדי לא לחמם את הג.
הערה: במעבדה שלנו, 14 ואט עבור 20 ס מ x 16 ס"מ צלחות היה מספיק למטרה זו.
4. RNA הכנה על ידי הפעלת שעתוק T7
הערה: רצפי DNA המשמשים את שעתוק הריצה10 של RNA מנגו בנייה הזמינו מסחרית. בשיטה זו, ה-DNA oligT7 מכיל את ההשלמה הפוכה (RC) של שני הרצף להיות משועתק ואת היזם הם הוכלא רצף הגדיל T7 העליון המקדם ולאחר מכן משועתק בתוך מבחנה. להלן, עבור כל מחלת ה, RC של רצף הליבה של מנגו מוצג מודגש ו-RC של אזור היזם T7 מוצג נטוי. שאריות בגופן רגיל מתאימים לאזורים משלימים שרירותיים אחרת הנדרשים כדי לאפשר ליבת מנגו לקפל כראוי.
מנגו I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CGT CGT ACG TCC התגיתTA תג TCC GTC GTA טה AAG
מנגו II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC מCTC TCC מסדרת CGT C GT משחק C
מנגו III: GGC ACG TAC גה תאת ACC כללי הסוכנות TCC TTC CTT CGT ACG TCC C תגTA התגית TCC GTC GTA TTA AAG
מנגו הרביעי: GCA CGT ACT CGT CTC האווירית CTC ACC ACT CCC TCG GTA CGT מסיטי מחסום הפנים TAA AG
T7 העליון סטרנד: CTT TAA TAC GAC TCA CTT תג G
- ג'ל היטיבי לטיהור של דנ א
- עבור 0.2 μl לפני בקנה מידה סינתזה DNA, להשעות מחדש את ה-DNA הdeprotected olig, הגאות ב 100 Μi של ddH2O ו 100 μl של 2x הרפתקאות צבע הטעינה (משלב 1.2.2). במקרה זה, כולל ג'ל טעינת צבעים בפתרון הטעינה באותו ריכוז כמו בשלב 1.2.2 הוא המועדף.
- לטהר את ה-DNA olig, הגאות באמצעות 50 mL בקנה מידה התאמת היקף ג'ל של אחוז אלקטרופורזה המתאים; השתמש בטבלה 2 כדי לבחור את אחוז הג. לדוגמה, השתמש ב-8% ג'ל לרצף של 50 nt. באופן אידיאלי, ברומאופנול כחול צריך לרוץ מהר יותר מאשר מחלת האלכוהול, ו קסילן cyanol צריך לרוץ לאט יותר.
הערה: במעבדה שלנו, ג ' לים כאלה היו יצוק באמצעות מפרידי הליהוק כי היו 1.5 מ"מ עבה ומסרק ג'ל טעינת עם בארות שהיו 2 – 2.5 ס"מ רוחב. - טען 100 μL של ה-DNA פתרונות olig, הכין בשלב 4.1.2 לכל ג'ל הכנה היטב כמתואר בשלבים 2.4 – 2.7.
- יבש בזהירות את החלק החיצוני של הג, להסיר את צלחות הזכוכית, ולכסות את שני צידי הג באריזת פלסטיק. מניחים אותו על מסך הדמיה פלורסנט (אלומיניום מגובים דק לוחיות כרומטוגרפיה לוחות ספוג עם fluorophore הם פתרון חסכוני) ולהשתמש באור קצר באורך גל UV המנורה כדי להמחיש את להקות DNA על ידי הצללה UV.
- חדה, צל מוגדר היטב יש לציין אם סינתזה ה-DNA הוא באיכות גבוהה. סמנו את הרצועות על עטיפת הניילון, בעזרת סמן קבוע.
הערה: להגן על העור והעיניים מפני אור UV ולשמור על החשיפות קצר כדי למנוע פגיעה בדגימת חומצת גרעין. - הצבת ג'ל על צלחת זכוכית נקייה, בזהירות לגזור את הלהקות מסומנים ומקום כל קטע ג'ל ב 400 μL של 300 מ"מ הנאל. . בעזרת מסובבי בטמפרטורת החדר
- לשחזר את החומקת בצינור צנטריפוגה נקי להוסיף 2.5 המקבילה של אתנול כדי לזרז את ה-DNA. מערבולת היטב ומניחים את הצינור ב-20 ° c עבור 30 דקות.
- גלולה המדגם העליון הספסל צנטריפוגה ב 156,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° c. הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-ddH2O. השתמש בספקטרוסקופיה כדי לקבוע במדויק את הריכוז של דנ א. אחסן את המדגם כמניה 10 μM לנוחות ב-20 ° c.
- תמלול ושעתוק ג'ל לטיהור של דגימות RNA
- הכנת 5x נוקלאוטיד טריפוספט (NTP) מניות על ידי ערבוב מניות NTP נוזלי מורכב ריכוז סופי של 40 mM guanosine טריפוספט (gtp, 11,400 M-1· ס"מ-1), 25 מ"מ cytidine טריפוספט (ctp, 7,600 M-1· ס"מ-1), 25 מ"מ אדנוזין טריפוספט (ATP, 5,000 M-1· ס"מ-1), ו 10 מ"מ הטריפוספט (utp, 10,000 M-1· ס"מ-1); כל מקדמי ההשמדה ב 260 ננומטר.
הערה: מניות נוזלי או אבקה ניתן להשיג מסחרית. אם הכנת מניות ראשיות מאבקה, להתאים בקפידה את ה-pH ל-pH הסופי של 7.9, באמצעות 1 M NaOH. מחלקים את המניה בצינורות המיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ומאחסנים אותה ב-20 ° c. - להכין 100 mL של 10x T7 מאגר תמלול על ידי ערבוב 25.6 mL של 1 M טריס-HCl, 14.4 mL של 1 M טריס base, 26 מ ל של 1 M MgCl2, 10 מ ל 10% טריטון X-100, ו 0.637 g של spermidine. הפוך את המניה לנפח סופי של 100 mL על ידי הוספת ddH2O.
הערה: pH הסופי של 7.9 של הפתרון 1x צריך להיות מאושר באמצעות מד pH מכויל. 10x צריך להיות סטרילי-מסוננים ומאוחסן ב-20 ° c בגודל הראוי שבציטוטים. - בצע שעתוק כדלקמן.
- להוסיף את החומרים הבאים כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 x T7 תמלול מאגר באמצעות המניה 10x T7 מאגר שעתוק ו ddh2O (משלב 4.2.2), 1x ntps, 10 מ"מ של dithiothreitol (dtt), 1 μm העליון הגדיל רצף (ראה סעיף 4 הערה עבור ה רצף), 1 μM ג'ל-מטוהרים מנגו רצף DNA (שלב 2.1), ו T7 RNA פולימראז אנזים (1 U/μL).
- מערבולת, ספין למטה, והופך את הפתרון ב 37 ° c עבור 2 h או עד שהוא מעונן ומזרז לבן טפסים בתחתית הצינור. תמלול 50 μL צריך לגרום 50 μL של ~ 50 μM RNA לאחר טיהור ג'ל. הוסף כמות שווה של צבע המעיק על 2x ואחסן אותו ב-20 ° c עד שמוכן לטיהור ג'ל.
- ג'ל-לטהר את ה-RNA כתוצאה מכך שמתואר בסעיף הטיהור של דנ א של ה-DNA, על ידי השלבים הבאים 4.1.2 \ u 20124.1.8, החלפת דגימת RNA עבור ה-DNA.
הערה: RNA הוא רגיש מאוד לירידה RNase, כך להבטיח כי בכל השלבים, כפפות מעיל מעבדה נקי שחוקים כל הזמן. ודא שכל הדגימות מוכנות ומאוחסנות בפלסטלינה לשימוש יחיד כדי להגן מפני זיהום rnase, ולשטוף צלחות זכוכית בזהירות עם סבון חם ומים לפני השימוש, לשטוף אותם ביסודיות עם ddh2O, ויבש את כלי הזכוכית עם ה סיוע של אתנול להחיל מבקבוק לחיצה. - השתמש 1 μL של מדגם ה-RNA הסופי ובאמצעות ספקטרוסקופיה מבוססת droplet, לקבוע את ספיגת ב 260 nm. באמצעות מקדם הכחדה נקבע על ידי השיטה השכנה הקרובה, לחשב את הריכוז RNA ולהתאים את הריכוז לדוגמה 10 μM עם ddH2O לנוחות. יש לאחסן את דגימות ה-RNA ב-20 ° c.
- הכנת 5x נוקלאוטיד טריפוספט (NTP) מניות על ידי ערבוב מניות NTP נוזלי מורכב ריכוז סופי של 40 mM guanosine טריפוספט (gtp, 11,400 M-1· ס"מ-1), 25 מ"מ cytidine טריפוספט (ctp, 7,600 M-1· ס"מ-1), 25 מ"מ אדנוזין טריפוספט (ATP, 5,000 M-1· ס"מ-1), ו 10 מ"מ הטריפוספט (utp, 10,000 M-1· ס"מ-1); כל מקדמי ההשמדה ב 260 ננומטר.
- סדאנכיה קולי סך הכל חומצה גרעין גולמי החילוץ
הערה: הפרוטוקול הבא הוא דוגמה. פרוטוקול זה משתמש באופן מדוקדק הביע מנגו אני-tagged 6S RNA מתוך פלבאמצע E. coli, ו אינדוקציה מתוך זה פלמיד מתואר במקום אחר בפירוט4.- לצורך מחקר זה, להכין 500 mL של תאים המושרה הן מנגו פקולי-RNA ו-Poli-T1 הפלמידים (התאים הם המושרה על OD600nm של 1). מצנע את התאים ומאחסנים אותם ב-80 ° c לפני השימוש.
- לבצע חילוץ RNA כדלקמן.
- קח 0.5 מ ל של המושרה הנגרמת תא הגלולה ולהוסיף 500 μL של פנול שולית. ואז, מערבולת המדגם; הפתרון יהפוך לבן חלבי. צנטריפוגה במהירות מקסימלית עבור 2 דקות כדי להפריד את השכבות.
- לחלץ את השכבה העליונה, אשר יהיה מעט צהוב, ולחזור על שלב 4.3.2.1 על ידי הוספת נפח שווה של פנול, תפרידו, וחילוץ עבור סך של 5x (או עד השכבה האמצעית, שהיא אטומה לבנה, נעלם רק שתי שכבות ברורות נותרו).
- הוסף את הנפח המופק ממים פנול לנפח שווה של כלורופורם, מערבולת, ולאחר מכן, צנטריפוגה במהירות מקסימלית עבור 2 דקות.
- לחלץ את השכבה מימית ולהוסיף בריכוז הסופי של 300 מ"מ. מזרז את חומצת הגרעין שהתקבל על ידי תוספת של 2.5 שווי של אתנול, מערבולת, ספין למטה, ומזרז ב-20 ° c עבור לפחות 30 דקות.
- גלולה ב צנטריפוגה העליון ספסל ב 15.6 x 1,000 x g ב 4 ° c עבור 30 דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולהשעות את הגלולה ב 100 μl של ddh2O.
- הוסף את הטיפול בתהליך העיכול של DNase להליך זה, בעקבות הפרוטוקול המופנה11, כדי להשיג RNA כולל.
הערה: מערבולת במרץ עד הגלולה מומס לחלוטין ב-ddH2O.
5. הצביעת לאחר ג'ל
- הכינו 1 x ג'ל מכתים פתרון לפי המתכון בשלב 1.1.3 ולהוסיף אותו למיכל זכוכית נקייה כי הוא רחב מספיק כדי להתאים בנוחות את ג'ל.
הערה: בורוסיליקט מיכלי זכוכית עם עפעפיים מתאימים משמשים היטב למטרה זו. - הוסף מספיק 1x ג'ל מכתים את הפתרון המיכל כך ג'ל מכוסה לחלוטין עם הפתרון ואת הנוזל המרעס מעל החלק העליון של הג כאשר הוא ממוקם על המסלול הסובב.
הערה: הגורם המכיל חייב להיות גדול מספיק כדי להתאים את ג'ל כך שהוא יכול לנוע ויש לו מספיק מאגר במיכל כדי לכסות במלואו את הג. - לאחר ג ' ל או מהריצה ג'ל סיים ריצה (סעיף 2 או 3, בהתאמה), להסיר את ג'ל מן המנגנון ולנתק את הבארות שלה. זה יכול להיות שימושי כדי להסיר את הפינה של ג'ל לכיוון מאוחר יותר בניתוח.
- בזהירות להעביר את הג לפתרון 1x ג'ל צביעת מוכן בשלב 5.2.
הערה: הג הם שבריריים ונוטים לשבור כל כך להיזהר בעת העברת ג'ל. השאר את המכסה על המיכל כתמים כל הזמן כדי לא לזהם את הג. - מניחים את ג'ל על מסובבי מסלולית במהירות של 100 סל ד עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: ודא שהג'ל אינו מתקפל חזרה אל עצמו; אחרת, RNA עשוי לנטרל את הג ולכן התווית חלק אחר של הג.
6. הדמיה מנגו-מתויגים RNAs ב ג'ל
- הקפדה קפדנית על מאגר ההדמיה. שטפו את הג במהירות במים, והקפדה על שרידי נוזלים מספיק כדי לשמור על הג במקצת בתוך המיכל.
- העבר בזהירות את הג אל האימגר. העברה בזהירות להרים את צדי הג ולהניחה על מגש האימגר; לחילופין, הג ניתן לשפוך באיטיות על המגש. ודא כי אין בועות מתחת ג'ל וכי אין נוזל עודף מתחת ג'ל. פיפטה מגולגל על הג יכול להועיל להסרת כל נוזל עודף.
הערה: השתמש במגבת נייר כדי לספוג את עודפי הנוזלים. - קח תמונה ג'ל, התבוננות זריחה בין עירור גל 510 nm ופליטת אורך הגל 535 nm (למשל, אור ירוק ב 520 ננומטר הגדרות הזריחה על האימג'ר). ודא שההגדרות ממוטבות באופן מלא על הכלי ובצע בזהירות את ההוראות עבור הכלי המשמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קצר מנגו-tagged RNAs הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקול. בהנחה כי הזריחה בתנאים denaturing יהיה קשה ביותר להתבונן בשל הנוכחות של אוריאה ב ג'לים, אנו הראשונים לחקור את ההתנגדות של aptamers מנגו כדי אוריאה, אשר משמש חומצה גרעין denaturant. מצאנו aptamers מנגו עמידים באופן משמעותי כדי לגבות את ריכוז אוריאה של כ 1 M (איור 2A). לפני הוספת ג'ל מכתים הפתרון ג'ל הרפתקאות, הריכוז הסופי של אוריאה ב ג'ל הוא 6 M. הוספת פתרון מכתים מספיק כדי להקטין את הריכוז הזה ל 1 M היה, ולכן, להיות אופטימלי כדי להבטיח מנגו מלא הזריחה עבור כל ארבעת aptamers. בפועל, פרוטוקול מכתים השיגה פחות מאשר זו תוצאה אופטימלית לחלוטין, אבל זה יכול פשוט להיות תיקון במידת הצורך באמצעות פתרון כתמים יותר או על ידי היכולות הפשוטות של שינוי הפתרון פעם אחת במהלך הצביעת.
ברגע מנגו מתויג מבנים RNA היו לרוץ לתוך ג'ל הרפתקאות, את הזמן מכתים היה ממוטב עבור הזריחה ג'ל מקסימלית על ידי טעינת שלושה כמויות השלישי מנגו לתוך 8% denaturing רפתקאות ג'ל (איור 2B). קורס זמן גילה כי לאחר 5 דקות של הטבילה בתמיסה ג'ל מכתים, הזריחה היה גלוי בבירור. זריחה מקסימלית של המבנה השלישי מנגו הושגה לאחר 20 – 40 דקות של כתמים, לאחר מכן RNAs קטן בשימוש במחקר זה התחיל לפזר מתוך הג, וכתוצאה מכך אובדן של אות פלורסנט (איור 2B). כתוצאה מכך, גם ג'ל מקורי ומלא הרפתקאות מוכתם במשך 30 דקות. עוד בנייה RNA יכול בקלות לסבול פעמים מוכתם יותר כפי שהם היו הרבה פחות סביר לפזר מתוך ג'ל.
חלק של ה-RNA מנגו aptamers מקופל במהירות רבה יותר מאחרים. כל מנגו aptamers משמש במחקר זה היה מודחה במאגר ג'ל שיושלם עם 1.5 M אוריאה ו 100 ננומטר TO1-Biotin לצבוע וניתח באמצעות פלואורומטר. מנגו אני, II, ו III היו מקופלים לחלוטין לאחר 10 דקות, בעוד מנגו הרביעי הפכה באופן משמעותי רק לאחר 40 דקות (איור 3A). בהעדר אוריאה, קיפול היה הרבה יותר מהיר כפי שציפה (איור 3B). כדי להבטיח כי דגימות ג'ל יליד היו מקופלים במלואו, אנו מקדים דגימות עבור 100 דקות לפני הפעלת אותם ג'לים מקומיים. כמעט, את הנתונים באיור 3 מציע הפעם יכול להיות מופחת באופן משמעותי בהתאם לאפאלף מנגו בשימוש.
לאחר הפרוטוקול היה מותאם לזהות RNA מנגו aptamer הרגישות של שיטת הפוסטצביעת נקבע עבור כל אחד מהמשתנים מנגו בשני ג ' לים יליד. להקות יחיד המתאימות RNAs מקופל היטב נצפו עבור כל אחד מארבעת מנגו ג ' לים יליד (איור 4A). עם דילול סדרתי, מעט כמו 62.5 fmol של מנגו II יכול להיות נצפתה, בעוד מעט כמו 125 fmol של מנגו אני, III, ו IV היו בקלות דמיינו. הקוונפיקציה של ג'לים מקומיים היה יומן ליניארי מעל כ 1.5 הזמנות של סדר גודל, עם מנגו אני, II, ו IV להתנהג בצורה לינארית יותר מנגו השלישי (איור 4B).
התוצאות של ג ' לים הרפתקאות היו מעט פחות רגיש מאשר ג ' לים יליד אבל היו ליניאריים יותר. מעט כמו 125 fmol של מנגו II ו III זוהו בקלות (איור 4C). מעניין, כימות (איור 4D) הצביע על כך שהרכבי ג'ל היו מסומנים ביומן ליניארי או בשתי הזמנות של סדר גודל. אנחנו ההשערה כי, בניגוד ג'לים יליד שבו קפלי RNA היו כנראה נתון הדנטורציה חלקית במהלך התהליך ג'ל פועל, הנוכחות של אוריאה ב ג'ל הרפתקאות עשוי לספק דרך הומוגנית יותר לקפל את aptamers פעם הם ממוקמים ב פתרון הצביעת TO1-Biotin.
כמו עם כל מתודולוגיות ג'ל מכתים, אם ג'ל לא מועבר בזהירות לתוך המיכל, או מהירות מסתובבת גבוה מדי במהלך תקופת הצביעת, הג עשוי לקפל חזרה אל עצמו (איור 5A). זה יכול לגרום מנגו-מתויג מדגם RNA הפצת ממקום אחד של ג'ל למשנהו, אבל ניתן להימנע בקלות בפועל. ב ג'לים מקומיים, במיוחד, עבור מנגו IV, הבחנו כי קיפול שלם יכול להתבטא במראה של להקות מרובות ככל הנראה מתאים באופן חלקי/misfolded RNA (איור 5B) כתוצאה מזמני קיפול קצרים יותר. בעיות קיפול ג ' לים מקורי ניתן להימנע על ידי טרום הדגימה דגימות RNA כראוי כפי שתוארו בעבר ועל ידי הפעלת ג'לים מקומיים בחדר קר. ב הרפתקאות ג'לים, שבו RNA קפלי באתרו בתוך הג, מתקפלים לא היה בעיה משמעותית. לבסוף, בהעדר RNA, מעט מאוד זריחה הרקע נצפתה במערכת ג'ל או.
הבא, הספציפיות של תג ה-RNA מנגו נחקרו על ידי הבעת היתר של RNA הרגולציה של 6S בחיידקים. RNA זה היה מתויג בעבר באמצעות מנגו I (איור 1E)4. התאים החיידקיים השתנו עם הפיולי-RNA מנגו פלמיד (מעתה ואילך M פלמיד) או הפיולי-T1 פלמיד כפקד שלילי (מעתה ואילך E פלמיד). תאים שעברו שינוי גדלו בינונית מרק הקימוט הנוזלי עד600 OD של 1.0 הושגה. התרבויות המושרה אז עם 50 μM איזופרופיל β-D-1-thio, topyranoside (IPTG) עבור 40 דקות. התאים נקצרו 6,000 באמצעות צנטריפוגה x g עבור 15 דקות. סך RNA הופק באמצעות מיצוי פנול-פנול כלורופורם מפני כדוריות התאים12 כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול. כל הדגימות RNA התרכזו על ידי משקעים אתנול ולאחר מכן מטופלים עם DNase I, בעקבות הפרוטוקול, כדי להסיר את ה-DNA11. לפני השימוש, RNA היה מרוכז על ידי משקעים אתנול.
ה-RNA החיידקי הכולל הופעל לתוך 8% הרפתקאות ג'לים (איור 6) ו מוכתם עם או SG13 או TO1-biotin. עבור כתמים SG, 10 μL של 10, 000x SG התווסף 100 mL של ג'ל מאגר; אחרת, פרוטוקול ההכתמים היה זהה לזה ששימש עבור TO1-Biotin. כצפוי, כתמים חזקים של SG נצפתה עבור מגוון של RNAs, אבל בולט ביותר עבור ריבוזומיום (rRNA) והעברת RNAs (tRNA) (איור 6, פאנל שמאל). בעוד הכתמים תלוי מנגו (מסלולים M) ניתן לראות אלה ג ' ס ויטראז ', הם לא יכלו להיות מזוהה באופן ייחודי בהתחשב דפוס מורכב מכתים שנצפו באמצעות כתם אוניברסלי זה. לעומת זאת, ה-TO1-Biotin מוכתם בלהקות תלויות-מנגו כלהקות הבולטות ביותר. רק להקות ה-RNA הריבוזומראות מופיעות בתחרות עם הלהקות התלויות ב-6S. ניתן גם לצפות במספר להקות לא מוכתמות במיוחד. אף על פי כן, הלהקות התלויות במנגו היו שולטת שוב, בעוד שלהקות rRNA ו-tRNA הן מתחרים מתחרים באופן חלש (איור 6, פאנל ימני).
איור 1: מערכת אפאלף מנגו. (א) TO1-biotin פלואורופור. (ב) מנגו (ב) מנגו השני. (ד) מנגו השלישי. פאנלים B-D להראות את המבנה המשני של כל מאלף. P1 היא גזע שרירותי. GNRA כמו לולאה גבעול (כאן GAAA) נמצא מנגו I ו-II מוצג באדום, מוטיב טריפלקס של מנגו השלישי מוצג בסגול. (ה) ה-RNA הרגולטורי השישי מתויג עם מנגו I. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ההשפעה של אוריאה על מנגו הזריחה וזמני מכתים אופטימלי. (א) שתנן באמצעות 50 ננומטר מנגו האני (כתום עיגולים), מנגו II (עיגולים ירוקים), מנגו השלישי (עיגולים סגולים), ו מנגו IV (עיגולים כחולים), יחד עם 100 NM-TO1-biotin לצבוע ועל ריכוזי אוריאה שצוין. הדגימות היו מודבטים עבור 40 דקות לפני הזריחה נקראה באורך גל עירור של 510 ננומטר ו-אורך הגל של 535 nm. (ב) מנגו RNA השלישי נטען לתוך 8% הרפתקאות ג'ל ומוכתם עם פתרון ג'ל המכיל 20 הסופי nM TO1-biotin צבע. עבור כל נקודת זמן שצוין, 0.064, 0.32, ו 1.6 pmol של מנגו השלישי RNA שימש משמאל לימין. התמונה ג ' ל היה דמיינו עם צמידה הזריחה באמצעות 520 ננומטר לייזר ו 10 דקות חשיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הזמנים המתקפלים של אפטמרים מנגו בנוכחות והעדר אוריאה. (א) בנוכחות 1.5 M אוריאה ו 100 nm TO1-biotin, קורסי הזמן הפלואורסצנטית בוצעו באמצעות 50 ננומטר של כל מנגו RNA לבנות (Rna מנגו I: נקודות כתום, מנגו II: נקודות ירוקות, מנגו III: נקודות סגול, ו מנגו IV: נקודות כחולות). (ב) זהה פאנל A, למעט בהעדר אוריאה. כל קורסי הזמן בוצעו בטמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות פלורסנט של מקורי והרפתקאות הדף עם בונה RNA מנגו. (A) A8% ג'ל יליד עם מדולל באופן סדרתי RNA מנגו מבנים. נתיבים I, II, III, ו IV כל אחד מכילים 8 כמויות אחרונות של RNA מנגו אני, II, III, ו-IV, בהתאמה. לוחות הזכות הם כפולה מדלל סדרתי המכיל 4 pmol, 2 pmol, 1 pmol, 0.5 pmol, 0.25 pmol, 0.125 pmol, ו 0.0625 pmol של או מנגו אני, II, III, או IV, כפי שצוין. ליין 12 אינו מכיל RNA. (ב) כימות של שלושה משכפל של ג'ל יליד (סטיית התקן של הממוצע המוצג עבור כל). (ג) 8% הרפתקאות ג'ל עם דגימות זהה טעון כמו בלוח A, למעט העובדה כי המעיק פתרון הטעינה ג'ל שימש במקום פתרון הטעינה של ג'ל יליד. (ד) שלושה משכפל כימות של ג'ל הרפתקאות (סטיית תקן של הממוצע המוצג לכל אחד). כל התמונות ג'ל היו דמיינו מינגר ג'ל עם לייזר ננומטר 520 ו 10 דקות חשיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ג'לים תת-אופטימליים וקיפול לא שלם של מנגו הרביעי ב-8% ג'ל מקורי. (א) דילול סדרתי מהסוג המוצג באיור 4 עבור מנגו II אבל מראה את האפקט של קיפול ג'ל במהלך פרוטוקול הצביעת. (ב) מנגו הרביעי דגימות ג'ל יליד כי לא הורשו לקפל מספיק זמן במאגר יליד לפני ג'ל טעינת להקות כפולות התערוכה. אחרת, תוצאות אלה דומות לתוצאות מנגו הרביעי המוצג באיור 4A. כל התמונות ג'ל היו דמיינו באמצעות ג'ל צמידה עם לייזר 520 ננומטר ו 10 דקות חשיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מנגו-Tagged RNAs ניתן להבחין בנוכחות של RNA כולל, באמצעות כתמים TO1-Biotin. 8% הרפתקאות ג'ל נטענו עם 100 ng של RNA סה כ והופעל 30 דקות. הג השמאלי היה מוכתם ב-SG ובלוח הימני עם TO1-Biotin. עבור שני לוחות, נתיבים המסומנים E היו טעונים עם 100 ng של פקיולי-T1 (לא תג מנגו) ונתיבים המסומנים M נטענו עם 100 ng של מנגו-RNA (6S RNA עם תגית אני מנגו). TO1-ביוטין-ג'ל ויטראז ' היו דמיינו באמצעות צמידה עם לייזר nm 520 ו 10 דקות חשיפה. התמונות ג'ל ויטראז ' היו דמיינו באמצעות ג'ל צמידה באמצעות 460 ננומטר לייזר ו 10 דקות חשיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| אחוז | ג'ל לנפח | |||
| 20 מ ל | 30 מ ל | 50 מ ל | ||
| 5% | קצת | 4 | 6 | 10 |
| B | 14 | 21 | 35 | |
| C | 2 | 3 | מיכל 5 | |
| 6 | קצת | 4.8 | 7.2 | 12 |
| B | 13.2 | 19.8 | 33 | |
| C | 2 | 3 | מיכל 5 | |
| 8 | קצת | 6.4 | 9.6 | 16 |
| B | 11.6 | 17.4 | 29 | |
| C | 2 | 3 | מיכל 5 | |
| 10 | קצת | 8 | 12 | 20 |
| B | 10 | 15 | 25 | |
| C | 2 | 3 | מיכל 5 | |
| 12 | קצת | 9.6 | 14.4 | 24 |
| B | 8.4 | 12.6 | 21 | |
| C | 2 | 3 | מיכל 5 | |
| 15 | קצת | 12 | 18 | 30 |
| B | 6 | 9 | 15 | |
| C | 2 | 3 | מיכל 5 | |
| 20 | קצת | 16 | 24 | 40 |
| B | 2 | 3 | מיכל 5 | |
| C | 2 | 3 | מיכל 5 | |
| גישה (μL) | 48 | 72 | 120 | |
| TEMED (μL) | 20 | 30 | 50 | |
טבלה 1: שולחן הליהוק של ג'ל לעמודים. A = פתרון A, B = פתרון B, C = פתרון C.
| הרפתקאות ג'ל% | BB (~ מובינט) | XC (~ ניידות ב-nt) |
| מיכל 5 | 35 | 130 |
| 6 | 26 | 106 |
| 8 | 19 | 70-80 |
| 10 | 12 | 55 |
| 20 | 8 | 28 |
| 23 | 5-6 |
שולחן 2: ג'ל משוער mobilities של ברומאופנול כחול (BB) ו קסילן (XC) ג'ל טעינת צבעים ב-pvc הרפתקאות ג'לים.
| אחוז | ג'ל לנפח | |||
| 20 מ ל | 30 מ ל | 50 מ ל | ||
| 5% | 1X TBE | 16.5 | 24.75 | 41.25 |
| 40% 29:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין-אקרילאמיד | 2.5 | 3.75 | 6.25 | |
| גליצרול | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 6 | 1X TBE | 16 | 24 | 40 |
| 40% 29:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין-אקרילאמיד | 3 | 4.5 | 7.5 | |
| גליצרול | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 8 | 1X TBE | 15 | 22.5 | 37.5 |
| 40% 29:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין-אקרילאמיד | 4 | 6 | 10 | |
| גליצרול | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 10 | 1X TBE | 14 | 21 | 35 |
| 40% 29:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין-אקרילאמיד | מיכל 5 | 7.5 | 12.5 | |
| גליצרול | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 12 | 1X TBE | 13 | 19.5 | 32.5 |
| 40% 29:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין-אקרילאמיד | 6 | 9 | 15 | |
| גליצרול | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 15 | 1X TBE | 11.5 | 17.25 | 28.75 |
| 40% 29:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין-אקרילאמיד | 7.5 | 11.25 | 18.75 | |
| גליצרול | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| 20 | 1X TBE | 9 | 13.5 | 22.5 |
| 40% 29:1 אקרילאמיד: N, N'-מתיונין-אקרילאמיד | 10 | 15 | 25 | |
| גליצרול | 1 | 1.5 | 2.5 | |
| גישה (μL) | 48 | 72 | 120 | |
| TEMED (μL) | 20 | 30 | 50 | |
שולחן 3: שולחן ליציקת ג'ל מקורי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יתרון משמעותי של תג פלורסנט מנגו הוא תג אחד ניתן להשתמש בדרכים מרובות. בהירות גבוהה ואהדה של aptamers אלה להפוך אותם שימושיים לא רק עבור הדמיית תא2 אלא גם עבור מחוץ גופית RNA או rnp טיהור4. לכן, הדמיה ג'ל מרחיב את רב-תכליתיות תג מנגו בצורה פשוטה. רגישות מנגו ג'ל הדמיה היא מעט פחות מזה של הצפון כתמי14 אבל יכול בקלות לזהות 60 – 120 fmol מדגם RNA, מבלי להזדקק להעברת קרום ארוך ומייגע ושלבים חיטוט. זה דומה ליעילות החיטוט המבוססת על הכלאה שנמצאו בעבר RNAs קטנים ב ג'ל15. בעוד מתודולוגיות פלואורוגנטי אחרים-במיוחד, תרד RNA-יש רגישות יותר וספציפיות9, אין כרגע יש במקביל בהירות גבוהה ואהדה של מערכת Aptamer מנגו, אשר מאפשר תג RNA אחד להיות משמש לדימות תאי, RNP טיהור, ועכשיו ג'ל הדמיה.
יש כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול זה מכתים ג'ל. כאשר עובדים עם פתרונות RNA, הפתרונות צריכים להיות מסוננים ונקיים, ולהשתמש בפלסטלינה חד-שימוש. Catuion, פועל ג'לים מקומיים כמו מתחמי או RNA מבנים ניתן לדון בקלות אם רמות הכוח של הג הם גבוהים מדי ולגרום לחימום ג'ל. ודא כל כלי זכוכית משומשים נקי ולא מזוהם עם RNases בנוסף, תמיד להיות זהירים בעת העברת ולאסוף ג'לים כפי שהם שבירים יכול להיות נוטה שבירה.
הכתם TO1-Biotin חודר ג'ל במהירות, אבל הנתונים המוצגים כאן גם לציין כי קיפול מנגו הרביעי, בפרט, יכול להיות הגבלת קצב (איור 2 ואיור 3). באמצעות התנאים האמור בסעיף הפרוטוקול, הבחנו התנהגות לינארית לאורך כל ארבעת האפארים על שתי הזמנות של סדר גודל ב-הרפתקאות ג'ל, מה שהופך את השיטה שימושית עבור כימות (איור 4C, D). מאז aptamers קטן מנגו בשימוש במחקר זה מתפזרת בקלות מתוך מטריצת ג'ל, אנו מצפים כימות לשפר עבור מבנים RNA ארוך יותר.
תג מנגו ג'ל הדמיה מתודולוגיה הפגינו כאן הוא חזק והוא צפוי להיות מסוגל להיות פשוט מורחב מבחינת רגישות וספציפיות. מנגו אני, II, ו III קיפול אמין, בעוד מנגו IV לא. למרות שלא בחנו פרוטוקולים לביטול כתמים, אנו מצפים שגישה כזו תוכל גם לשפר את הספציפיות. בעוד מעבר לטווח של העבודה הזאת, התגית הפלואורסצנטית ו ביוטין העניקו למנגו-מתויג RNA כאשר משתמשים בTO1-ביוטין fluorophore מופיע בסבירות גבוהה יותר לייעל ניתוח ג'ל וטיהור. מסחרית זמינות משנית biotin שיטות תיוג, למשל, הבטחה לשפר עוד יותר את המגבלות זיהוי של מערכת זו פשוט RNA מנגו תיוג. כמו כן, זה נראה סביר כי יליד מנגו-מתויגים RNA מתחמי חלבון יכול להיות חומקת מן הג והתאושש באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin כדי ללכוד את מתחם RNA שחומק. זה יהיה עוד לפשט את הטיהור השגרתי של RNAs ומתחמי RNA חשובים ביולוגית על ידי התועלת הפשוטה של הוספת תג מנגו RNA של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
פטנט הוא בהמתנה על מערכת fluorogenic מנגו.
Acknowledgments
המחברים מודים לרזון קוג'ואו ואמיר אבדולאזדה על הסיוע הטכני שלהם ועל לנה דולגושינה על הגהה של כתב היד. המימון סופק עבור פרויקט זה על ידי מדעי הטבע הקנדי ומועצת המחקר ההנדסה (NSERC) מענק הפעלה P.J.U.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
