Summary

Fluorescerende visualisatie van mango-Tagged RNA in Polyacrylamide gels via een Poststaining methode

Published: June 21, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een gevoelige, snelle en discriminerende post-gel kleuring methode om image-ASE Tagged met RNA mango aptameren I, II, III, of IV, met behulp van een native of denaturerende Polyacrylamide gel elektroforese (pagina) gels. Na het runnen van standaard pagina gels, mango-gecodeerde RNA kan gemakkelijk worden gekleurd met TOT1-Biotine en vervolgens geanalyseerd met behulp van de meest beschikbare fluorescentie lezers.

Abstract

Native en denaturerende Polyacrylamide gels worden routinematig gebruikt om ribonucleoproteã (RNP) complexe mobiliteit te karakteriseren en de grootte van RNA te meten, respectievelijk. Zoals veel gel-Imaging technieken gebruiken niet-specifieke vlekken of dure fluorophore sondes, gevoelige, discriminerende, en economische gel-Imaging methodologieën zijn zeer wenselijk. De de kern opeenvolgingen van RNA mango zijn kleine (19-22 NT) opeenvolgings motieven die, wanneer gesloten door een willekeurige Steel van RNA, eenvoudig en goedkoop aan een RNA van belang kunnen worden toegevoegd. Deze mango Tags binden met een hoge affiniteit en specificiteit van een Thiazole-Orange fluorophore ligand genaamd TOT1-biotine, die wordt duizenden malen meer fluorescerende op bindend. Hier laten we zien dat mango I, II, III, en IV kan worden gebruikt om specifiek beeld RNA in gels met een hoge gevoeligheid. Zo weinig zoals 62,5 fmol van RNA in inheemse gels en 125 fmol van RNA in het denatureren gels kan worden ontdekt door het weken gels in een beeldvormings buffer die kalium en 20 nM TOT1-Biotine voor 30 min bevat. We tonen de specificiteit van de mango-Tagged systeem door Imaging een mango-gecodeerde 6S bacteriële RNA in de context van een complex mengsel van totale bacteriële RNA.

Introduction

Mango is een RNA-tagging systeem bestaande uit een set van vier kleine fluorescerende RNA aptameren die stevig binden (nanomolar binding) aan eenvoudige derivaten van de Thiazole-Orange (TOT1-biotine, Figuur 1a)1,2,3 . Bij het binden wordt de fluorescentie van dit ligand verhoogd 1.000-naar 4.000-voudig afhankelijk van de specifieke aptamer. De hoge helderheid van het mango systeem, dat voor Mango III dat van verbeterde groene fluorescente proteïne (eGFP) overschrijdt, combineerde met de nanomolar bindende affiniteit van de mango aptameren van RNA, laat het toe om zowel in de beeldvorming als de reiniging van RNA worden gebruikt complexen2,4.

De X-Ray structuren van mango I5, II6, en III7 zijn bepaald aan hoge resolutie, en alle drie APTAMEREN gebruiken een RNA quadruplex om tot1-Biotine (Figuur 1b– D) te binden. De compacte kernen van alle drie de aptameren zijn geïsoleerd van de externe RNA sequentie via compacte adapter motieven. Mango I en II maken beide gebruik van een flexibele GNRA-achtige lus adapter om hun mango kernen aan te sluiten op een willekeurige RNA duplex (Figuur 1b, C). In tegenstelling, mango III maakt gebruik van een rigide triplex motief om de kern te verbinden met een willekeurige Helix (figuur 1d, paarse residuen), terwijl de structuur van de mango IV is momenteel niet bekend. Aangezien de ligand-bindende kern van elk van deze aptameren van de externe opeenvolging van RNA door deze spiraalvormige adapters wordt gescheiden, schijnt het waarschijnlijk dat zij allen eenvoudig in een verscheidenheid van ASE kunnen worden opgenomen. De bacteriële 6s Regulatory RNA (Mango i), componenten van de gist spliceosoom (Mango i), en de menselijke 5s RNA, U6 RNA, en een C/D scaRNA (Mango II en IV) zijn allemaal met succes gecodeerd in deze mode2,8, wat suggereert dat veel biologische ASE kan worden gelabeld met behulp van de RNA mango aptamer systeem.

Het denatureren en de inheemse gels worden algemeen gebruikt om ASE te bestuderen. Het denatureren gels worden vaak gebruikt om de grootte van RNA of de verwerking van RNA te beoordelen, maar typisch, in het geval van een noordelijke vlek, bijvoorbeeld, vereis verscheidene langzame en opeenvolgende stappen om een beeld te produceren. Terwijl andere RNA fluorogenic aptameren, zoals RNA spinazie en broccoli, zijn met succes gebruikt voor gel Imaging9, geen fluorogenic aptamer systeem tot op heden beschikt over de hoge helderheid en affiniteit van de mango-systeem, waardoor het van aanzienlijk belang om te onderzoeken mango gel-Imaging capaciteiten. In deze studie, vroegen we ons af of de RNA mango systeem kan eenvoudig worden uitgebreid tot gel beeldvorming, zoals de excitatie en emissie golflengten van TOT1-Biotine (510 Nm en 535 nm, respectievelijk) zijn geschikt voorbeeld vorming in de eGFP kanaal gemeenschappelijke voor de meeste fluorescerende gel-Scanning instrumentatie.

De post-gel kleuring protocol hier gepresenteerd biedt een snelle manier om specifiek te detecteren mango-gecodeerde RNA-moleculen in native en denaturerende Polyacrylamide gel elektroforese (pagina) gels. Deze kleuring methode omvat weken gels in een buffer met kalium en TOT1-biotine. RNA mango aptameren zijn G-quadruplex gebaseerd en kalium is nodig om dergelijke structuren te stabiliseren. Gebruikend RNA dat van minimale mango-codeert de malplaatjes van DNA wordt getranscribeerd (Zie de sectie van het Protocol), kunnen wij eenvoudig zo weinig zo weinig zoals 62,5 fmol van RNA in inheemse gels en 125 fmol van RNA in het denatureren gels ontdekken, gebruikend een ongecompliceerd Protocol van de kleuring. In tegenstelling tot gemeenschappelijke niet-specifieke Nucleic zure vlekken (Zie lijst van materialen, die naar SG van hierop wordt verwezen), kunnen wij mango-geëtiketteerde RNA duidelijk identificeren zelfs wanneer de hoge concentraties van totaal untagged RNA in de steekproef aanwezig zijn.

Protocol

1. voorbereiding van de reagentia TOT1-Biotine poststaining oplossing (gel kleuring oplossing) Maak 1 L van 1 M fosfaatbuffer bij pH 7,2 bij 25 °C door 342 mL van 1 M na2HPO4 en 158 ml van 1 m Nah2po4toe te voegen. Pas pH aan 7,2 bij 50 mM aan door de aangewezen fosfaat oplossing toe te voegen. Steriel-filter met behulp van een 0,2 µm filter en bewaar de oplossing in plasticware bij kamertemperatuur. Bereid 5x gel kleuring oplo…

Representative Results

Korte mango-Tagged ASE werden voorbereid zoals beschreven in het protocol sectie. Ervan uitgaande dat de fluorescentie in de denaturering omstandigheden het meest moeilijk te observeren als gevolg van de aanwezigheid van ureum in de gels, we eerst bestudeerde de weerstand van de mango aptameren aan ureum, die fungeert als een nucleïnezuur denaturaat. We vonden dat mango aptameren aanzienlijk resistent zijn tegen denaturatie tot een ureum concentratie van ongeveer 1 M (Figuur 2a</…

Discussion

Een belangrijk voordeel van de mango fluorescerende tag is dat een enkele tag kan worden gebruikt op meerdere manieren. De hoge helderheid en de affiniteit van deze aptameren maken hen nuttig niet alleen voor in cel visualisatie2 maar ook voor in vitro RNA of RNP zuivering4. Daarom, gel Imaging breidt de veelzijdigheid van de mango-tag op een eenvoudige manier. Mango gel Imaging gevoeligheid is iets minder dan die van een noordelijke vlek14 , maar ka…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Razvan Jelliii en Amir Abdolahzadeh voor hun technische bijstand en Lena Dolgosheina voor het proeflezen van het manuscript. De financiering werd verstrekt voor dit project door een Canadese natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad (NSERC) exploitatiesubsidie aan P.J.U.

Materials

0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels LabRepCo 11956042
101-1000 µL  tips Fisher 02-707-511
20-200 µL low retention  tips Fisher Scientific 02-717-143
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) Bioreagents BP1406-1 Acute toxicity
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) Fisher BP1408-1 Acute toxicity
Agar Anachemia 02116-380
Aluminium backed TLC plate Sigma-Aldrich 1164840001
Amersham Imager 600 GE Healthcare Lifesciences 29083461
Ammonium Persulfate Biorad 161-0700 Harmful
BL21 cells NEB C2527H
Boric Acid ACP B-2940
Bromophenol Blue sodium salt Sigma B8026-25G
Chloloform ACP C3300
Dithiothreitol Sigma Aldrich Alcohols D0632-5G
DNase I ThermoFisher EN0525
EDTA Disodium Salt ACP E-4320
Ethanol Commerial  P016EAAN
Flat Gel Loading tips Costar CS004854
Formamide 99% Alfa Aesar A11076
Gel apparatus set with spacers and combs LabRepCo 41077017
Glass Dish with Plastic lid Pyrex 1122963 Should be large enough to fit your gel piece
Glycerol Anachemia 43567-540
HCl Anachemia 464140468
ImageQuanTL GE Healthcare Lifesciences 29000605
IPTG Invitrogen 15529-019
KCl ACP P-2940
MgCl2 Caledron 4903-01
MgSO4 Sigma-Aldrich M3409
NaCl ACP S-2830
NaOH BDH BDH9292
Orbital Rotator Lab-Line
Phenol Invitrogen 15513-039
Round Gel Loading tips Costar CS004853
Sodium Phosphate dibasic Caledron 8120-1
Sodium Phosphate monobasic Caledron 8180-01
SYBRGold ThermoFisher S11494
T7 RNA Polymerase ABM E041
TEMED Sigma-Aldrich T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin Fluorophore ABM G955
Tris Base Fisher BP152-500
Tryptone Fisher BP1421-500
Tween-20 Sigma P9496-100
Urea Fisher U15-3
Xylene Cyanol Sigma X4126-10G
Yeast Extract Bioshop YEX401.500

References

  1. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
  9. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  11. A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
  15. Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).

Play Video

Cite This Article
Yaseen, I. M., Ang, Q. R., Unrau, P. J. Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method. J. Vis. Exp. (148), e59112, doi:10.3791/59112 (2019).

View Video