पॉलीऐक्रिलमाइड जेल्स में एक पोस्टस्टेनिंग विधि के माध्यम से आम-टैग किए गए आरएनए का फ्लोरोसेंट विजुअलाइजेशन
Summary
यहाँ हम एक संवेदनशील, तेजी से प्रस्तुत करते हैं, और भेदभाव के बाद जेल धुंधला विधि आरएनए मैं Mango aptamers मैं, द्वितीय, III, या चतुर्थ के साथ टैग छवि के लिए, या तो देशी या denaturing polyacrylamide जेल electrophoresis (पेज) जैल का उपयोग कर. मानक पृष्ठ जैल चलाने के बाद, मैंगो-टैग आरएनए आसानी से TO1-बायोटिन के साथ दाग ासाकीय हो सकता है और फिर सामान्य रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट रीडर्स का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है.
Abstract
देशी और denaturing polyacrylamide जैल नियमित रूप से ribonucleoप्रोटीन (RNP) जटिल गतिशीलता की विशेषता के लिए और आरएनए आकार को मापने के लिए उपयोग किया जाता है, क्रमशः. के रूप में कई जेल-इमेजिंग तकनीक गैर विशिष्ट दाग या महंगी फ्लोरोफोर जांच का उपयोग करें, संवेदनशील, भेदभाव, और किफायती जेल-इमेजिंग तरीके अत्यधिक वांछनीय हैं. आरएनए मैंगो कोर अनुक्रम छोटे होते हैं (19-22 nt) अनुक्रम रूपांकनों कि, जब एक मनमाना आरएनए स्टेम द्वारा बंद कर दिया, बस और सस्ते ब्याज की एक आरएनए करने के लिए संलग्न किया जा सकता है. ये मैंगो टैग उच्च आत्मीयता और एक thiazole-नारंगी फ्लोरोफोर ligand TO1-बायोटिन कहा जाता है, जो बाध्यकारी पर अधिक फ्लोरोसेंट के हजारों हो जाता है करने के लिए विशिष्टता के साथ बाँध. यहाँ हम दिखाते हैं कि मैं, द्वितीय, तृतीय, और चतुर्थ विशेष रूप से उच्च संवेदनशीलता के साथ जैल में आरएनए छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. देशी जैल में आरएनए के 62.5 एफमोल और डेनिंग जैल में आरएनए के 125 एफमोल के रूप में एक इमेजिंग बफर में जैल भिगोने से पता लगाया जा सकता है जिसमें पोटेशियम और 20 एनएम TO1-बायोटिन 30 मिनट के लिए होता है। हम कुल जीवाणु आरएनए के एक जटिल मिश्रण के संदर्भ में एक आम टैग 6S जीवाणु आरएनए इमेजिंग द्वारा आम टैग प्रणाली की विशिष्टता का प्रदर्शन.
Introduction
मैंगो एक आरएनए टैगिंग प्रणाली है जिसमें चार छोटे फ्लोरोसेंट आरएनए एप्टीमर्स का एक सेट होता है जो थायाज़ोल-नारंगी (टीओ1-बायोटिन, चित्रा 1A)1,2,3 के सरल डेरिवेटिव ्स ्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स ्स्स्स ्स . बाइंडिंग पर, इस लिगन्ड का फ्लोरोसेंट विशिष्ट उपयुक्त पर निर्भर करते हुए 1,000 से 4,000 गुना बढ़ जाता है। मैंगो प्रणाली की उच्च चमक, जो मैंगो III के लिए बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) से अधिक है, आरएनए मैंगो aptamers के नैनोमोलर बंधन संबंध के साथ संयुक्त, यह दोनों इमेजिंग और आरएनए की शुद्धि में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है परिसर2,4.
मैंगो I,II6, और III7 की एक्स-रे संरचनाओं को उच्च संकल्प के लिए निर्धारित किया गया है, और सभी तीन aptamers एक आरएनए चौगुनी का उपयोग करने के लिए TO1-बायोटिन बाँध (चित्र 1B-D) . सभी तीन aptamers के कॉम्पैक्ट कोर कॉम्पैक्ट अनुकूलक रूपांकनों के माध्यम से बाहरी आरएनए अनुक्रम से अलग कर रहे हैं। मैं मैं और द्वितीय दोनों एक लचीला GNRA की तरह पाश अनुकूलक का उपयोग करने के लिए एक मनगो कोर एक मनकी आरएनए डुप्लेक्स से कनेक्ट (चित्र 1 बी,सी). इसके विपरीत, मैंगो III एक कठोर ट्रिपलेक्स आकृति का उपयोग करता है एक मनमाना आरएनए हेलिक्स के लिए अपने कोर कनेक्ट (चित्र 1 डी, बैंगनी अवशेषों), जबकि मैंगो चतुर्थ की संरचना वर्तमान में ज्ञात नहीं है. चूंकि इन aptamers में से प्रत्येक के लिगन्ड बाध्यकारी कोर इन कुंडलिनी एडेप्टर द्वारा बाहरी आरएनए अनुक्रम से अलग है, यह संभावना है कि वे सब बस आरएनए की एक किस्म में शामिल किया जा सकता है प्रकट होता है. बैक्टीरियल 6S नियामक आरएनए (मैंगो I), खमीर spliceosome के घटकों (मैंगो मैं), और मानव 5S आरएनए, U6 आरएनए,और एक सी / जैविक आरएनए को आरएनए मैंगो एप्टीमर सिस्टम का उपयोग करके टैग किया जा सकता है।
Denaturing और देशी जैल आमतौर पर आरएनए का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। Denaturing जैल अक्सर आरएनए आकार या आरएनए प्रसंस्करण न्यायाधीश के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन आम तौर पर, एक उत्तरी दाग के मामले में, उदाहरण के लिए, कई धीमी गति से और अनुक्रमिक कदम की आवश्यकता के लिए एक छवि उत्पन्न करने के लिए. जबकि अन्य आरएनए फ्लोरोजेनिक aptamers, जैसे आरएनए पालक और ब्रोकोली, जेल इमेजिंग9के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, कोई fluorogenic aptamer प्रणाली की तारीख करने के लिए उच्च चमक और आम प्रणाली की समानता के पास, यह काफी ब्याज की बना रही है मैंगो की जेल-इमेजिंग क्षमताओं की जांच करने के लिए। इस अध्ययन में, हमने सोचा कि अगर आरएनए मैंगो प्रणाली बस जेल इमेजिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है, के रूप में उत्तेजना और TO1-बायोटिन के उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (510 एनएम और 535 एनएम, क्रमशः) eGFP चैनल में इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं सबसे फ्लोरोसेंट के लिए आम जेल स्कैनिंग इंस्ट्रूमेंटेशन।
यहाँ प्रस्तुत पोस्ट जेल धुंधला प्रोटोकॉल विशेष रूप से देशी में मैंगो टैग आरएनए अणुओं का पता लगाने के लिए एक तेजी से तरीका प्रदान करता है और polyacrylamide जेल electrophoresis (पेज) जैल denaturing. इस धुंधला विधि पोटेशियम और TO1-बायोटिन युक्त एक बफर में जैल भिगोने शामिल है. आरएनए मैंगो एप्टीमर्स जी-क्वीवरेक्स आधारित हैं और ऐसी संरचनाओं को स्थिर करने के लिए पोटेशियम की आवश्यकता होती है। न्यूनतम मैंगो-एन्कोडिंग डीएनए टेम्पलेट्स से लिखित आरएनए का उपयोग करना (प्रोटोकॉल अनुभाग देखें), हम बस के रूप में कम के रूप में कम के रूप में पता लगा सकते हैं 62.5 देशी जैल में आरएनए के fmol और denaturing जैल में आरएनए के 125 fmol, एक सीधा धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग कर. आम nonspecific न्यूक्लिक एसिड दाग के विपरीत (सामग्री की तालिकादेखें, यहाँ से एसजी को भेजा), हम स्पष्ट रूप से मैंगो टैग आरएनए की पहचान कर सकते हैं यहां तक कि जब कुल untagged आरएनए की उच्च सांद्रता नमूने में मौजूद हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
मैंगो फ्लोरोसेंट टैग का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि एक एकल टैग कई मायनों में इस्तेमाल किया जा सकता है. इन एप्टीमरों की उच्च चमक और आत्मीयता उन्हें न केवल सेल दृश्य2 में बल्कि इन विट्रो आरएनए या आ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने अपनी तकनीकी सहायता के लिए रज़वान कोजोकारू और अमीर अबोलाहज़ादेह और लीना डोल्गोशेएना को पांडुलिपि के सबूत के लिए धन्यवाद दिया। इस परियोजना के लिए कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) द्वारा पी.जे.यू.
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
