Summary
Здесь мы представляем чувствительный, быстрый и дискриминационный пост-гель окрашивая метод изображения РНК помечены РНК Манго aptamers I, II, III, или IV, используя либо родной или денатурирующий полиакриламид гель электрофорез (PAGE) гели. После запуска стандартных гелей PAGE, Манго помечены РНК может быть легко окрашены с TO1-Biotin, а затем проанализированы с помощью широко доступных читателей флуоресценции.
Abstract
Родные и денатурные гели полиакриламидов обычно используются для характеристики подвижности рибонуклеопротеина (РНП) и для измерения размера РНК, соответственно. Как и многие методы гель-изображения использовать неспецифические пятна или дорогие фторроновые зонды, чувствительные, дискриминационные, и экономичный гель-изображений методологии являются весьма желательными. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОсти ядра RNA Mango являются небольшими (19-22 nt) мотивами последовательности, которые, при закрытии произвольного стебля РНК, могут быть просто и недорого приложены к РНК интереса. Эти теги манго связываются с высокой близостью и специфичностью к тиазол-оранжевому флюорофору лиганду под названием TO1-Biotin, который становится в тысячи раз более флуоресцентным при связывании. Здесь мы показываем, что Манго I, II, III и IV могут быть использованы специально для изображения РНК в гели с высокой чувствительностью. Всего лишь 62,5 моль РНК в родных гелей и 125 моль РНК в денатурирующих гелей может быть обнаружена путем замачивания гелей в буфере изображения, содержащем калий и 20 нМ TO1-Биотина в течение 30 мин. Мы демонстрируем специфику манго-тегами системы путем визуализации манго помечены 6S бактериальной РНК в контексте сложной смеси общей бактериальной РНК.
Introduction
Манго представляет собой РНК пометки система, состоящая из набора из четырех небольших флуоресцентных РНК aptamers, которые связывают плотно (наномолярной связывания) к простым производным тиазол-оранжевый (TO1-Биотин, Рисунок 1A)1,2,3 . При связке флуоресценция этого лиганда увеличивается в 1000-4000 раз в зависимости от конкретного аптамера. Высокая яркость системы манго, которая для Манго III превышает уровень улучшенного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), в сочетании с наномолярной связывающей сродством аптамеров РНК Манго, позволяет использовать ее как при визуализации, так и в очищении РНК комплексы2,4.
Рентгеновские структуры МангоI5, II6и III7 были определены с высоким разрешением, и все три аптамеров использовать РНК четырехугольник, чтобы связать TO1-Biotin (Рисунок 1B-D). Компактные ядра всех трех аптамеров изолированы от внешней последовательности РНК с помощью компактных адаптеров. Манго I и II оба используют гибкий GNRA-как петля адаптер для подключения их ядер манго к произвольной РНК дуплекс(Рисунок 1B, C). В отличие от этого, Mango III использует жесткий мотив триплекса, чтобы соединить его ядро с произвольной спиралью РНК(рисунок 1D,фиолетовые остатки), в то время как структура Манго IV в настоящее время не известна. Как лиганд-связывающее ядро каждого из этих aptamers отделен от внешней последовательности РНК этими сугнительными адаптерами, кажется вероятным, что все они могут быть просто включены в различные РНК. Бактериальная 6S регулятивная РНК (Манго I), компоненты дрожжевой spliceosome (Манго I), и человека 5S РНК, U6 РНК, и C / D scaRNA (Манго II и IV) все были успешно помечены таким образом2,8, предполагая, что многие многие биологические РНК могут быть помечены с помощью системы РНК Манго aptamer.
Денатуринг и местные гели обычно используются для изучения РНК. Денатуринг гели часто используются для судить размер РНК или РНК обработки, но, как правило, в случае северной пятно, например, требуют нескольких медленных и последовательных шагов для того, чтобы создать изображение. В то время как другие РНК фторгенных аптамеров, таких как РНК шпинат и брокколи, были успешно использованы для геля изображения9, не фторгенной аптамера системы на сегодняшний день не обладает высокой яркостью и сродством системы манго, что делает его значительный интерес для изучения манго гель-изображения способностей. В этом исследовании мы задавались вопросом, может ли система RNA Mango быть просто расширена до геля, так как возбуждение и длина волн выбросов TO1-Biotin (510 нм и 535 нм, соответственно) подходят для визуализации в канале eGFP, обычном для большинства флуоресцентных гелевосканно-сканирующие приборы.
Пост-гель окрашивания протокол, представленный здесь обеспечивает быстрый способ конкретно обнаружить Манго помечены молекулРНЫ в родной и denaturing полиакриламид гель электрофорез (PAGE) гели. Этот метод окрашивания включает в себя замачивания гелей в буфере, содержащем калий и TO1-Biotin. РНК Манго aptamers являются G-четверки основе и калий требуется для стабилизации таких структур. Используя РНК, транскрибированные из минимальных мангокодирующих шаблонов ДНК (см. раздел протокола), мы можем просто обнаружить всего лишь 62,5 фмоль РНК в местных гелей и 125 фмоль РНК в денатурации гелей, используя простой протокол окринирования. В отличие от обычных неспецифических ядерных кислотных пятен (см. ТаблицаМатериалов, упомянутых в SG от hereon), мы можем четко определить Манго помечены РНК, даже если высокие концентрации общего untagged РНК присутствуют в образце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка реагентов
-
To1-Biotin постстогиврешение решение (гель окрашивающий раствор)
- Сделать 1 L 1 M фосфатного буфера на рН 7,2 на 25 градусов по Цельсию, добавив 342 мл 1 М Na2HPO4 и 158 мл 1 M2PO4. Отрегулируйте рН до 7,2 при 50 мМ, добавив соответствующий фосфатный раствор. Стерильный фильтр с помощью фильтра 0,2 мкм и храните раствор в пластичной посуде при комнатной температуре.
- Приготовьте 5x гель окрашивающий раствор (без TO1-Biotin) следующим образом. Составьте 1 л раствора, смешивая 247,5 мл ddH2O, 700 мл 1 M KCl, 50 мл 1 M фосфатного буфера (pH 7.2), и 2,5 мл Tween 20. Стерильный фильтр с помощью фильтра 0,2 мкм и храните раствор в пластичной посуде. Его можно хранить при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: MgCl2 может быть добавлен к этому решению, если требуется, поскольку это потенциально может стабилизировать комплексы РНК. Это будет иметь скромное влияние на флуоресцентный сигнал2. - Составьте раствор окрашивания геля 1x, используя раствор окрашивания 5x геля от шага 1.1.2 и, непосредственно перед использованием, дополните его фторофором TO1-Biotin (см. Таблицаматериалов) до конечной концентрации 20 нм. Например, добавьте 20 мл 5-х гельостого окрашивающего раствора в 80 мл деионизированной воды, чтобы сделать 100 мл раствора окрашивания геля 1x, и добавьте 2 мл 1 мМ TO1-Biotin (подготовленв в диметилформамиде).
ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент вымирания для красителя TO1-Biotin на 500 нм составляет 63 000 М-1см-1, измеренный в растворе окрашивания1.
-
Denaturing PAGE (2x denaturing гель погрузочный раствор и решения A, B, C, персульфат аммония, и тетраметилэтилениамин)
- Приготовьте 50 мл раствора загрузки геля 2x denaturing путем смешивания 40 мл формамида, 0,5 мл 0,5 М этиленденедиаминететраацетической кислоты (EDTA, pH 8.0) и 9,5 мл ddH2O. Раствор можно хранить при комнатной температуре. Загрузка красителей не добавляются к этому решению, так как это может скрыть флуоресцентную визуализацию.
- Подготовка 2x denaturing гель загрузки красителя следующим образом. При очистке РНК и ДНК-олигонуклеотидов добавьте 0,5 мл 2,5% (w/v) бромофенол синего (BB) и 0,5 мл 2,5% (w/v) цианола ксилена (XC) к раствору, описанного в шаге 1.2.1, и добавьте 8,5 мл ддГ2вместо 9,5 л. Раствор можно хранить при комнатной температуре.
- Приготовьте 100 мл раствора А, взвесив 200,2 г мочевины (вес формулы: 60,06 г/моль) и добавив его к 312,5 мл 40% 19:1 акриламид:N, N'-метиленебисацилимид. Перемешать его с магнитной панели перемешать на максимальной скорости до растворения (около 3 ч) и составить раствор до 500 мл с помощью ddH2O. Обратите внимание, что конечные концентрации 6,667 М мочевины и 25% 19:1 акриламид:N,N'-methylenebisacrylamide. Хранить при 4 градусах по цельсию в чистой пластмассовой посуде.
- Приготовьте 1 л раствора B, взвесив 400,4 г мочевины и составьте раствор до 1 л с ddH2O; перемешать, пока мочевина не растворится. Раствор B можно хранить при комнатной температуре.
- Подготовьте решение C (10x Tris-borate-EDTA) следующим образом. Приготовьте 4 л из 10x TBE, взвесив 432 г базы Tris и 220 г борной кислоты, добавив 160 мл 0,5 М EDTA с рН 8 (фильтрованным), и соизучив решение до 4 Л с ddH2O. Большой запас этого буфера производится, так как он также используется в качестве буфера для бега геля.
- Подготовка 10% аммония persulfate (APS) путем растворения 1 г APS в общий объем 10 мл ddH2O. Хранить при 4 кС.
- Держите тетраметилетилендиамин (TEMED) под рукой. Храните его при 4 градусах По Цельсию вместе с решением APS.
-
Родной PAGE (2x родной гель погрузки решение)
- Приготовьте 50 мл раствора загрузки 2x native gel, смешивая 25 мл 100% глицерола, 10 мл раствора окрашивания геля 5x и 15 мл ddH2O, чтобы составить раствор до 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в разделе денатурного геля, погрузочные красители могут быть добавлены к этому запасу, но их добавление может потенциально скрыть флуоресцентный сигнал в геле и, таким образом, следует избегать.
- Приготовьте 50 мл раствора загрузки 2x native gel, смешивая 25 мл 100% глицерола, 10 мл раствора окрашивания геля 5x и 15 мл ddH2O, чтобы составить раствор до 50 мл.
2. Приготовление и загрузка гелей для денатурирования
- Подготовка денатурный гель с соответствующим процентом, следуя таблице 1. Рассмотрим конкретную систему литья геля; 30 мл гели широко используются. Соответствующий процент геля можно оценить с помощью таблицы 2: выберите процент полиакриламидов, где красители BB и XC имеют подвижность быстрее и медленнее, соответственно, чем РНК интереса, чтобы обеспечить высокодиапазонное разделение в соответствующем размере Диапазон.
- Смешайте решения A, B и C в соответствии с таблицей 1 и добавьте APS и TEMED непосредственно перед заливкой геля. Хорошо смешайте растворы в чистой пластичной посуде.
- Налейте раствор геля в соответствующий гель литья аппарата, после обеспечения того, чтобы все компоненты скрупулезно чистыми. Поднимите одну сторону аппарата так, чтобы гель слегка наклонен при заливке, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в ловушку внутри самого геля.
- Вставьте нужный гребень и оставьте ее полимеризировать (примерно 30 мин). Обратите внимание на полимеризацию, внимательно глядя на изменение индекса преломления вокруг гель скважин. Составьте гель бак с помощью 1x раствор C (1x TBE) и тщательно удалить гребень. Используя шприц, аспирируйте скважины непосредственно перед загрузкой образца.
- Подготовьте образцы денатурирования следующим образом. Добавьте 2x денатурный гель погрузочный раствор в ОБРАЗЦы РНК интерес, чтобы сделать денатурный гель погрузки решение 1x и теплоденатуры при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут с помощью термоциклоза или водяной ванны.
- Перед загрузкой образцов, воздух охладить их несколько минут, пока они не остынет на ощупь. Загрузите образцы, накладывая их на дно каждой скважины, используя гель-загрузку советы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Круглые наконечники могут быть использованы для гелей толщиной 1 мм или более; использовать плоские советы для тонких гелей. - Запустите гели для денатурирования при комнатной температуре. Убедитесь, что мощность достаточно низкая, чтобы стеклянные пластины системы геля не трескаются.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории для этой цели было достаточно 28 Вт на 20 см х 16 см пластин.
3. Подготовка и загрузка отечественных гелей
- Подготовка родной гель с соответствующим процентом, ссылаясь на таблицу 3. Рассмотрим конкретную систему литья геля, но имейте в виду, что 30 мл гели обычно используются. Смешайте растворы 1x TBE, 40% 29:1 акриламид:N,N'-methylenebisacrylamide, и глицерол в соответствии с таблицей 3, и добавить APS и TEMED непосредственно перед заливкой гель. Продолжить, как описано в шагах 2.3 и 2.4.
- Подготовка местных образцов, добавив 2x родной гель погрузки решение ДЛЯ РНК образцов интерес, чтобы сделать решение 1x и позволить ему инкубировать при комнатной температуре в течение 100 минут до запуска геля для обеспечения полного сворачивания РНК.
- Запустите родной гель в холодной комнате 4 градуса, гарантируя, что мощность достаточно низкая, чтобы не нагревать гель.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории для этой цели было достаточно 14 Вт на 20 см х 16 см пластин.
4. Подготовка РНК путем транскрипции Стока T7
ПРИМЕЧАНИЕ: последовательности ДНК, используемые для стыковки10 конструкций РНК Манго были заказаны коммерчески. В этом методе, ДНК олигонуклеотиды, содержащие обратное дополнение (RC) как последовательность, которая будет транскрибирована и T7 промоутер гибридизированы в T7 промоутер верхней нити последовательности, а затем транскрибируется в пробирке. Ниже, для каждого олигонуклеотида, RC из манго основной последовательности показано жирным шрифтом и RC региона промоутер T7 показано курсивом. Остатки в обычном шрифте соответствуют произвольным дополнительным сечениям, необходимым для правильного сложения ядра манго.
Манго I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT CGT AGC TGC CTa TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Манго II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCT TCT CCT CGT AGC TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Манго III: GGC ACG TAC GAA TAT АКК АКА TAC CAA TCC TTC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
Манго IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC АКК АКСТ CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT GAG TCG TAT TAA AG
T7 Top Strand: CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G
- Препаративная гель очистка ДНК олигонуклеотидов
- Для синтеза ДНК в 0,2 моль-масштабе, resuspend deprotected ДНК олигонуклеотида в 100 л ddH2O и 100 л 2x денатурации погрузочной красителя (от шага 1.2.2). В этом случае предпочтительнее, в ключая гель-загрузку красителей в погрузочном растворе в той же концентрации, что и в шаге 1.2.2.
- Очистите ДНК олигонуклеотида с помощью 50 мл предварительной шкалы денатурации геля соответствующего процента полиакриламидов; использовать таблицу 2, чтобы выбрать процент геля. Например, используйте 8% гель для последовательности 50 nt. В идеале, бромофенол синий должен работать быстрее, чем олигонуклеотид, и цианол ксилена должен работать медленнее.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории такие гели были отлиты с использованием литья прокладки толщиной 1,5 мм и гель-загрузки гребень с колодцами, которые были 2-2,5 см в ширину. - Нагрузка 100 л ДНК олигонуклеотидов растворов, подготовленных в шаге 4.1.2 за preparative гель хорошо, как описано в шагах 2.4-2.7.
- Тщательно высушите внешнюю сторону геля, снимите стеклянные пластины и накройте обе стороны геля полиэтиленовой пленкой. Поместите его на флуоресцентный экран изображения (алюминиевые тонкослойные плиты хроматографии, пропитанные флюорофором, являются экономичным решением) и используйте коротковолжутную УФ-ручную лампу для визуализации полос ДНК с помощью УФ-тени.
- Хрустящая, четко определенная тень должна наблюдаться, если синтез ДНК имеет высокое качество. Отметьте полосы на полиэтиленовой пленке, используя перманентный маркер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите кожу и глаза от ультрафиолетового света и держите экспозицию короткой, чтобы избежать повреждения образца нуклеиновой кислоты. - Разместив гель на чистой стеклянной пластине, аккуратно вырежьте отмеченные полосы и поместите каждый гель фрагмент в 400 л 300 мм NaCl. Утилист ДНК на ночь, используя ротатор при комнатной температуре.
- Восстановить eluent в чистой центрифуге трубки и добавить 2,5 эквивалента этанола, чтобы осадок ДНК. Вихрь хорошо и поместите трубку на -20 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
- Пеллет образца в скамейке верхней центрифуги на 156000 х г в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия. Тщательно удалите супернатант и отдохните гранулы в ddH2O. Используйте спектрофотометр для точного определения концентрации олигонуклеотида ДНК. Храните образец в качестве запаса 10 мкм для удобства при -20 градусов по Цельсию.
- Стоковая транскрипция и очистка геля образцов РНК
- Подготовка 5x нуклеозидный трифосфат (NTP) запас путем смешивания жидких запасов NTP, состоящий из окончательной концентрации 40 мм гуанозин трифосфат (GTP, 11,400 M-1см-1), 25 мм цитидин трифосфат (CTP, 7600 М-1см-1), 25 мм аденозин трифосфат (АТФ, 5000 М-1см-1)и 10 мМ трифосфат аденозин (UTP, 10 000 М-1см-1); все коэффициенты вымирания на уровне 260 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы жидкости или порошка могут быть получены на коммерческой уровне. При приготовлении первичных запасов из порошка, тщательно настроить рН до окончательного рН 7,9, используя 1 M NaOH. Aliquot акции в 1,5 мл микроцентрифуговых труб и хранить его при -20 градусов по Цельсию. - Приготовьте 100 мл буферного запаса 10x T7, смешивая 25,6 мл 1 М Трис-HCl, 14,4 мл 1 M Tris базы, 26 мл 1 M MgCl2, 10 мл 10% Triton X-100, и 0,637 г спермидина. Составьте запас до окончательного объема 100 мл, добавив ddH2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный рН 7,9 из 1x решение должно быть подтверждено с помощью калиброванных рН метр. 10x должен быть стерильным фильтром и храниться при -20 градусов по Цельсию в подходящих размерах aliquots. - Выполните транскрипцию следующим образом.
- Добавьте следующие реагенты, чтобы составить окончательную концентрацию буфера транскрипции 1x T7, используя 10x T7 транскрипционный буферный запас и ddH2O (от шага 4.2.2), 1x NTPs, 10 mM дитиотрейтол (DTT), 1 мКМ T7 Верхняя последовательность нити (см. раздел 4 Примечание для последовательность), 1 мкм гель-очищенной последовательности ДНК манго (шаг 2.1), и T7 РНК-полимераза фермента (1 U / Зл).
- Вихрь, спина вниз, и инкубировать раствор при 37 градусов по Цельсию в течение 2 ч или пока он не станет облачным и белый осадок формы в нижней части трубки. Транскрипция 50 л должна привести к тому, что после очистки геля будет 50 qL РНК в размере 50 км. Добавьте равный объем 2x денатурации красителя и хранить его при -20 градусов до готовности для очистки геля.
- Гель очищает полученную РНК, как описано в разделе очистки геля ДНК олигонуклеотидов, следуя шагам 4.1.2.u20124.1.8, заменяя образец РНК на ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: РНК чрезвычайно чувствительна к деградации RNase, поэтому убедитесь, что во всех шагах, перчатки и чистый лабораторный слой носят в любое время. Убедитесь, что все образцы готовятся и хранятся в одноразовой пластмассовой посуде для защиты от загрязнения RNase, и мыть стеклянные пластины тщательно с горячим мылом и водой перед использованием, промыть их тщательно с ddH2O, и высушить стеклянную посуду с помощь этанола применяется из бутылки сжатия. - Используйте 1 кВ конечного образца РНК и, используя спектрофотометр на основе капель, определите абсорбцию на уровне 260 нм. Используя коэффициент вымирания, определяемый методом ближайшего соседа, вычислите концентрацию РНК и отрегулируйте концентрацию образца до 10 мкм с ddH2O для удобства. Храните образцы РНК при -20 градусов по Цельсию.
- Подготовка 5x нуклеозидный трифосфат (NTP) запас путем смешивания жидких запасов NTP, состоящий из окончательной концентрации 40 мм гуанозин трифосфат (GTP, 11,400 M-1см-1), 25 мм цитидин трифосфат (CTP, 7600 М-1см-1), 25 мм аденозин трифосфат (АТФ, 5000 М-1см-1)и 10 мМ трифосфат аденозин (UTP, 10 000 М-1см-1); все коэффициенты вымирания на уровне 260 нм.
- Эшеричия палочка полная добыча сырой нуклеиновой кислоты
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол является примером. Этот протокол использует эндогенно выраженный Манго I помечены 6S РНК от плазмиды в кишечной палочке, и индукции из этой плазмиды описывается в другом месте подробно4.- Для целей данного исследования, подготовить 500 мл индуцированных клеток для pEcoli-РНК Манго и pEcoli-T1 плазмиды (клетки индуцируются на OD600nm 1). Пеллет клетки и хранить их при -80 градусах Цельсия до использования.
- Выполните экстракцию РНК следующим образом.
- Возьмите 0,5 мл индуцированной плокольной клеточной гранулы и добавьте 500 л эквилибристого фенола. Затем, вихрь образца; раствор станет молочно-белым. Центрифуга на максимальной скорости в течение 2 мин, чтобы отделить слои.
- Извлеките верхний слой, который будет слегка желтым, и повторите шаг 4.3.2.1, добавив равный объем фенола, центрифугирования и извлечения в общей сложности 5x (или до тех пор, пока средний слой, который непрозрачный белый, уходит, и только два ясных слоя остаются).
- Добавьте фенол-извлеченный вакоозный объем в равный объем хлороформа, вихря, а затем центрифугу с максимальной скоростью в течение 2 мин.
- Извлеките свочный слой и добавьте NaCl к конечной концентрации 300 мМ. Осажгите полученную нуклеиловую кислоту добавлением 2,5 эквивалентов этанола, вихря, спин-дауна и осаждается при -20 градусов по Цельсию в течение не менее 30 мин.
- Пеллет в скамейке верхней центрифуги на 15,6 х 1000 х г при 4 кв кв в течение 30 мин. Тщательно удалить супернатант и resuspend гранулы в 100 зл от ddH2O.
- Добавить DNase I пищеварения шаг к этой процедуре, после ссылки протокол11, чтобы получить общую РНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вихрь энергично, пока гранулы полностью растворяется в ddH2O.
5. Пост-гель окрашивания
- Подготовка 1x гель окрашивая решение в соответствии с рецептом в шаге 1.1.3 и добавить его в чистый стеклянный контейнер, который достаточно широк, чтобы удобно соответствовать гель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Borosilicate стеклянные контейнеры с оснастки подходят крышки служат этой цели хорошо. - Добавьте в контейнер достаточно ежегельное окрашивающее раствор, чтобы гель был полностью покрыт раствором, а жидкие разгильдяи поверх геля помещались на орбитальный ротатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контейнер должен быть достаточно большим, чтобы соответствовать гель так, что он может передвигаться и иметь достаточно буфера в контейнере, чтобы полностью покрыть гель. - После того, как родной или денатурируя гель закончил работать (раздел 2 или 3, соответственно), снимите гель из аппарата и отрежьте его колодцы. Это может быть полезно, чтобы удалить угол геля для ориентации позже в анализе.
- Аккуратно перенесите гель на раствор окрашивания геля 1x, приготовленный в шаге 5.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гели хрупкие и склонны к нарушению так что будьте осторожны при передаче геля. Держите крышку на окрашивая контейнер во все времена, чтобы не загрязнять гель. - Поместите гель на орбитальный ротатор со скоростью 100 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что гель не складывается обратно на себя; в противном случае, РНК может рассеиваться из геля и так этикетке другой части геля.
6. Изображение Манго помечены РНК в гель
- Тщательно декантируйте буфер изображения. Промыть гель быстро с водой, обеспечивая достаточно жидкости остается держать гель слегка мобильным в контейнере.
- Аккуратно перенесите гель на изображение. Передача, тщательно поднимая стороны геля и поместив его на лоток изображения; в качестве альтернативы, гель можно медленно налить на лоток. Убедитесь, что под гелем нет пузырьков и нет лишней жидкости под гелем. Пипетка проката над гель может быть полезно, чтобы удалить излишки жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте бумажное полотенце, чтобы впитать лишнюю жидкость. - Возьмите изображение геля, наблюдая флуоресценцию между волной возбуждения 510 нм и длиной волны излучения 535 нм (например, зеленый свет при настройках флуоресценции длины волны 520 нм на изображении). Убедитесь, что настройки полностью оптимизированы на инструменте и тщательно следуйте инструкциям для используемого инструмента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Короткие Манго помечены РНК были подготовлены, как описано в разделе протокола. Предполагая, что флуоресценция в условиях денатурации будет наиболее трудно наблюдать из-за присутствия мочевины в гелях, мы впервые изучили устойчивость манго аптамеров к мочевину, которая действует как нуклеиновая кислота денатурант. Мы обнаружили, что Манго aptamers существенно устойчивы к денатурации до концентрации мочевины примерно 1 М (Рисунок 2A). До добавления гель окрашивая раствор для денатурирующего геля, окончательная концентрация мочевины в геле составляет 6 м. Добавление достаточного раствора окрашивания для уменьшения этой концентрации до 1 М было бы оптимальным для обеспечения полной флуоресценции манго для всех четырех аптамеров. На практике протокол окрашивания достиг меньше, чем этот полностью оптимальный результат, но это может быть просто исправлено, если это необходимо, используя более окрашивание решение или простоцелесообразно изменить решение один раз во время окрашивания.
После того, как Манго помечены РНК конструкции были запущены в денатурный гель, окрашивание время было оптимизировано для максимальной флуоресценции геля, загрузив три различных манго III суммы в 8% денатурирующих гель (Рисунок 2B). Время курс показал, что после 5 минут замачивания в гель окрашивая раствор, флуоресценция была хорошо видна. Максимальная флуоресценция конструкции Манго III была получена после 20-40 мин окрашивания, после чего небольшие РНК, используемые в этом исследовании, начали распространяться из геля, что привело к потере флуоресцентного сигнала(рисунок 2B). Следовательно, как родные, так и денатурные гели были окрашены в течение 30 минут каждый. Более длинние конструкции RNA смогли легко терпеть более длинние времена запятнанных по мере того как они были бы очень более менее правоподобны для того чтобы diffuse из геля.
Некоторые из РНК Манго aptamers сложить быстрее, чем другие. Каждый из атамеров Манго, используемых в этом исследовании, был инкубирован в гель-буфере, дополненном 1,5 М мочевины и 100 нм TO1-Biotin красителем и проанализирован с помощью флюорометра. Манго I, II и III были полностью сложены после 10 мин, в то время как Манго IV стал существенно сложен только после 40 мин(рисунок 3A). При отсутствии мочевины, складывание было гораздо быстрее, как ожидалось(рисунок 3B). Чтобы убедиться, что образцы родного геля были полностью сложены, мы предварительно подделали образцы в течение 100 минут до запуска их в местные гели. Практически, данные на рисунке 3 предполагает, что на этот раз может быть существенно сокращена в зависимости от Манго aptamer используется.
После того, как протокол был оптимизирован для обнаружения РНК Манго аптамер флуоресценции, чувствительность пост-стоидляния метод был определен для каждого из вариантов манго в обоих местных гелей. Одиночные полосы, соответствующие хорошо сложенным РНК, были отмечены для каждого из четырех манго в родных гелях(рисунок 4A). При последовательном разбавлении можно было наблюдать всего 62,5 моль Манго II, в то время как всего лишь 125 фмоль манго I, III и IV были легко визуализированы. Количественная оценка местных гелей была бревенчатой примерно на 1,5 порядка величины, при этом Манго I, II и IV ведут себя более линейно, чем Манго III(рисунок 4B).
Результаты денатурации гелей были немного менее чувствительны, чем местные гели, но были более линейными. Всего лишь 125 фмоль Манго II и III были легко обнаружены(рисунок 4C). Интересно, что количественная оценка(рисунок 4D) показала, что денатурация гелей была бревенчатой или двумя порядками величины. Мы предполагаем, что, в отличие от местных гелей, где РНК складки, возможно, подвергаются частичной денатурации во время процесса работы геля, наличие мочевины в денатурации гель может обеспечить более однородный способ сложить aptamers, как только они находятся в TO1-Biotin окрашивающий раствор.
Как и во всех методологиях окрашивания геля, если гель не тщательно передается в контейнер, или вращающаяся скорость слишком высока во время периода окрашивания, гель может сложить обратно на себя(Рисунок 5A). Это может привести к Манго помечены РНК образца распространения из одного места геля в другое, но можно легко избежать на практике. В родных гелей и, в частности, для Манго IV, мы заметили, что неполное складывание может проявляться в появлении нескольких полос предположительно соответствующих частично / неправильно РНК конформации (Рисунок 5B) в результате более короткого складного времени. Складной вопросы в родной гели можно избежать путем preincubating образцы РНК надлежащим образом, как описано ранее и путем запуска родной гелей в холодной комнате. В денатурирующих гелях, где РНК складывается на месте в гель, неправильное складывание не было существенной проблемой. Наконец, в отсутствие РНК, очень мало фоновой флуоресценции наблюдалось в любой желевой системы.
Далее, специфика ТЕГа RNA Mango была изучена путем переэкспрессирования 6S регулятивной РНК в бактериях. Эта РНК ранее помечены с помощью манго I (Рисунок 1E)4. Бактериальные клетки были преобразованы либо pEcoli-РНК манго плазмида (отныне М плазмида) или pEcoli-T1 плазмида в качестве отрицательного контроля (отсюда E плазмида). Преобразованные клетки были выращены в жидком лисогенном бульоне среды до OD600 из 1.0 был достигнут. Затем культуры были индуцированы с помощью 50 мкм изопропила -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) в течение 40 мин. Клетки были собраны с помощью центрифугации при 6000 х г в течение 15 мин. Общая РНК была извлечена с использованием фенол-фенол хлороформ из клеточных гранул12, как описано в разделе протокола. Общие образцы РНК были сосредоточены на осадках этанола, а затем обработаны DNase I, следуя протоколу, чтобы удалить ДНК11. Перед использованием РНК была сосредоточена на осадках в этаноле.
Общая бактериальная РНК была запущена в 8% денатурируя гели(рисунок6) и окрашены либо SG13 или TO1-Биотин. Для окрашивания SG, 10 юл 10000x SG был добавлен к 100 мл гелевого буфера; в противном случае протокол окрашивания был идентичен протоколу, используемому для TO1-Biotin. Как и ожидалось, сильное sG окрашивание наблюдалось для множества РНК, но наиболее заметно для рибосомных (rRNA) и передачи РНК (tRNA)(рисунок 6, левая панель). Хотя манго-зависимых окрашивания (M полосы) можно было увидеть в этих SG-окрашенных гелей, они не могут быть однозначно определены с учетом сложной картины окрашивания наблюдается с помощью этого универсального пятна. В отличие от этого, TO1-Biotin-окрашенные гели подчеркнулман-зависимых полос, как наиболее известных полос. Только рибосомные полосы РНК, как видно, в конкуренции с 6S Манго-зависимых полос. Можно было также наблюдать ряд неспецифических окрашенных полос. Тем не менее, манго-зависимые группы снова были доминирующими, имея только rRNA и tRNA полос, как слабо конкурирующих конкурентов(Рисунок 6, правая панель).
Рисунок 1: Манго aptamer системы. (A) TO1-Биотин фторофор. (B) Манго I. (C) Манго II. (D) Манго III. Панели B-D показывают вторичную структуру каждого аптамера. P1 является произвольным стеблем. GNRA-как ствол-петля (здесь GAAA) найти в Манго I и II показано в красном, тройной мотив Манго III показано в фиолетовый. (E) 6S нормативных РНК помечены Манго I. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Влияние мочевины на флуоресценцию Манго аптамер и оптимальное время окрашивания. (A) Титрация мочевины с использованием 50 нМ РНК Манго I (оранжевые круги), Манго II (зеленые круги), Манго III (фиолетовые круги) и Манго IV (синие круги), вместе с 100 нм TO1-Биотина красителя и в указанных концентрациях мочевины. Образцы были инкубированы в течение 40 минут, прежде чем флуоресценция была прочитана на волне возбуждения 510 нм и длина волны выбросов 535 нм. (B) Манго III РНК был загружен в 8% денатурируя гель и окрашенные с раствором геля, содержащим 20 нм окончательного TO1-Biotin красителя. Для каждого указанного момента времени, 0,064, 0,32, и 1,6 моль Манго III РНК был использован слева направо. Изображение геля было визуализировано с помощью флуоресценции с помощью лазера 520 нм и 10 мин экспозиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Складные времена Манго aptamers в присутствии и отсутствии мочевины. ()В присутствии 1,5 М мочевины и 100 нм TO1-Биотина, флуоресценция время курсы были выполнены с использованием 50 нм каждой конструкции МАНГо РНК (RNA Mango I: оранжевые точки, Манго II: зеленые точки, Манго III: фиолетовые точки, и манго IV: синие точки). (B) Идентичен панели А, за исключением отсутствия мочевины. Все временные курсы проводились при комнатной температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Флуоресцентные изображения родной и денатурирование PAGE с РНК манго конструкций. (A) 8% родной гель с последовательно разбавленной РНК манго конструкций. Переулки I, II, III и IV содержат 8 pmol окончательных количеств РНК Манго I, II, III и IV, соответственно. Правые панели представляют двухразовые серийные разбавления, содержащие 4 моль, 2 моль, 1 пмоль, 0,5 моль, 0,25 пм. моль, 0,125 рмоль и 0,0625 моль манго I, II, III или IV, как указано. Лейн 12 не содержит РНК. (B) Количественная оценка трех репликаций родного геля (стандартное отклонение среднего показанного для каждого из них). (C) 8% денатурируя гель с такими же образцами нагруженные как в панели A, за исключением факта что denaturing разрешение погрузки геля было использовано вместо родного разрешения нагрузки геля. (D) Три количественные реплики денатурного геля (стандартное отклонение среднего показанного для каждого). Все изображения геля были визуализированы гелевым изображением с лазером 520 нм и 10-минутной экспозицией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Неоптимальные гели и неполная складывание Манго IV в 8% родного геля. (A) Серийное разбавление рода показано на рисунке 4 для Манго II, но показывает эффект геля складывания во время окрашивания протокола. (B) Mango IV родной образец геля, которые не позволили сложить достаточно долго в родном буфере до гель загрузки экспонат двойных полос. В противном случае, эти результаты аналогичны результаты Манго IV показано на рисунке 4A. Все изображения геля были визуализированы с помощью геля изображения с 520 нм лазером и 10 мин экспозиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Манго помечены РНК могут быть обнаружены в присутствии общего РНК, используя TO1-Biotin окрашивания. 8% денатурнинг гели были загружены с 100 нг общей РНК и были запущены в течение 30 минут. Левый гель был окрашен SG и правая панель с TO1-Biotin. Для обеих панелей, полосы помечены E были загружены с 100 нг pEcoli-T1 (без манго тега) и полосы помечены M были загружены с 100 нг pEcoli-RNA Mango (6S РНК помечены манго I тег). Изображения геля, окрашенные в TO1-Biotin, были визуализированы с помощью изображения с лазером 520 нм и 10-минутной экспозицией. SG-окрашенные изображения геля были визуализированы с помощью геля изображения с помощью лазера 460 нм и 10 мин экспозиции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Процент | ОБЪЕМ ГЕЛЯ | |||
| 20 мл | 30 мл | 50 мл | ||
| 5% | A | 4 | 6 | 10 Лет |
| B | 14 Год | 21 год | 35 лет | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 6% | A | 4,8 | 7.2 | 12 Лет |
| B | 13.2 | 19.8 | 33 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 8% | A | 6.4 | 9.6 | 16 Год |
| B | 11.6 | 17.4 | 29 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 10% | A | 8 | 12 Лет | 20 |
| B | 10 Лет | 15 лет | 25 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 12% | A | 9.6 | 14.4 | 24 |
| B | 8.4 | 12.6 | 21 год | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 15% | A | 12 Лет | 18 лет | 30 год |
| B | 6 | 9 До 9 | 15 лет | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| 20% | A | 16 Год | 24 | 40 г. |
| B | 2 | 3 | 5 | |
| C | 2 | 3 | 5 | |
| APS (Зл) | 48 | 72 год | 120 г. | |
| TEMED (КЛ) | 20 | 30 год | 50 лет | |
Таблица 1: Денатурирование PAGE гель литья таблице. Решение A, B и решение B, C и решение C.
| Денатурный гель % | BB (мобильность nt) | XC (мобильность в nt) |
| 5 | 35 лет | 130 г. |
| 6 | 26 | 106 г. |
| 8 | 19 лет | 70-80 |
| 10 Лет | 12 Лет | 55 лет |
| 20 | 8 | 28 |
| 23 | 5-6 |
Таблица 2: Приблизительная гелевая мобилизация бромофенола синего (BB) и ксилена цианола (XC) гель загрузки красителей в полиакриламидде денатурации гелей.
| Процент | ОБЪЕМ ГЕЛЯ | |||
| 20 мл | 30 мл | 50 мл | ||
| 5% | 1X TBE | 16,5 | 24.75 | 41.25 Год |
| 40% 29:1 акриламид:N,N'-метиленебисакриламид | 2,5 | 3,75 | 6,25 | |
| Глицерин | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 6% | 1X TBE | 16 Год | 24 | 40 г. |
| 40% 29:1 акриламид:N,N'-метиленебисакриламид | 3 | 4,5 | 7,5 | |
| Глицерин | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 8% | 1X TBE | 15 лет | 22.5 | 37,5 |
| 40% 29:1 акриламид:N,N'-метиленебисакриламид | 4 | 6 | 10 Лет | |
| Глицерин | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 10% | 1X TBE | 14 Год | 21 год | 35 лет |
| 40% 29:1 акриламид:N,N'-метиленебисакриламид | 5 | 7,5 | 12.5 | |
| Глицерин | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 12% | 1X TBE | 13 Год | 19.5 | 32,5 |
| 40% 29:1 акриламид:N,N'-метиленебисакриламид | 6 | 9 До 9 | 15 лет | |
| Глицерин | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 15% | 1X TBE | 11.5 | 17.25 Для того, чтобы | 28.75 |
| 40% 29:1 акриламид:N,N'-метиленебисакриламид | 7,5 | 11.25 | 18.75 | |
| Глицерин | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| 20% | 1X TBE | 9 До 9 | 13,5 | 22.5 |
| 40% 29:1 акриламид:N,N'-метиленебисакриламид | 10 Лет | 15 лет | 25 | |
| Глицерин | 1 | 1,5 | 2,5 | |
| APS (Зл) | 48 | 72 год | 120 г. | |
| TEMED (КЛ) | 20 | 30 год | 50 лет | |
Таблица 3: Родные PAGE гель литья таблице.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существенным преимуществом флуоресцентного тега Mango является то, что один тег может быть использован несколькими способами. Высокая яркость и сродство этих aptamers сделать их полезными не только в визуализации клеток 2, но и для in vitro РНК или RNP очистки4. Таким образом, гель изображения расширяет универсальность тега Манго в простой способ. Манго гель изображения чувствительность немного меньше, чем у северной пятно14, но может легко обнаружить 60-120 фмоль образца РНК, без необходимости длительных и утомительных мембраны передачи и зондирования шаги. Это сопоставимо с гибридизации на основе зондирования эффективности, найденной ранее для небольших РНК в гель15. В то время как другие фторгенные методологии аптамер- в частности, РНК шпинат-имеют большую чувствительность и специфичность9, ни один в настоящее время одновременно высокой яркости и сродни манго aptamer системы, которая позволяет одной РНК-тег, чтобы быть используется для клеточной визуализации, очистки RNP, а теперь геля изображения.
Есть несколько важных шагов в этом гель окрашивания протокола. При работе с решениями РНК решения должны быть стерильными фильтруемыми, а одноразовая пластичная посуда должна использоваться. Catuion, работает родной гелей, как комплексы или РНК структур может быть легко денатурированы, если уровень мощности для геля слишком высоки и привести к гель отопления. Убедитесь, что любая использованная стеклянная посуда чиста и не загрязнена RNases. Кроме того, всегда будьте осторожны при передаче и собирание гелей, поскольку они хрупкие и могут быть склонны к поломке.
TO1-Biotin пятно проникает гели быстро, но данные, представленные здесь также показывают, что Манго IV складывания, в частности, может быть ограничение скорости(Рисунок 2 и Рисунок 3). Используя условия, указанные в разделе протокола, мы наблюдали бревенчатое линейное поведение для всех четырех аптамеров в течение двух порядков величины в денатурации гелей, что делает метод полезным для количественной оценки (Рисунок 4C,D). Так как небольшие аптамеры манго, используемые в этом исследовании, легко рассеялись из гелевой матрицы, мы ожидаем, что количественная оценка улучшится для более длинных конструкций РНК.
Манго теги гель визуализации методологии продемонстрировали здесь является надежным и, как ожидается, будет в состоянии быть просто расширена с точки зрения чувствительности и специфичности. Манго I, II и III складываются надежно, в то время как Манго IV нет. Хотя мы не исследовали протоколы дестабилизации, мы ожидаем, что такой подход может также просто улучшить конкретность. Хотя за рамки этой работы, флуоресценция и биотина тегприсированных Манго помечены РНК при использовании TO1-биотин фторофора, как представляется, весьма вероятно, дальнейшее рационализации анализа геля и очистки. Например, коммерчески доступные вторичные методы маркировки биотиновой маркировки обещают еще больше расширить пределы обнаружения этой простой системы маркировки РНК-манго. Кроме того, представляется вероятным, что родной Манго помечены РНК белковых комплексов могут быть eluted из геля и восстановлены с помощью стрептавидина магнитных бусин, с тем чтобы захватить eluted РНК комплекса. Это еще больше упростило бы рутинную очистку биологически важных РНК и РНК-комплексов, просто йустье добавления тега манго в интересуящееся РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
На фторгенной системе Манго находится на рассмотрении.
Acknowledgments
Авторы благодарят Развана Кожокару и Амира Абдолахзаде за техническую помощь и Лену Долгошеину за коррективную прочтение рукописи. Финансирование этого проекта было предоставлено Канадским советом по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) в рамках оперативного гранта P.J.U.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
