Fluorescerande visualisering av mango-Tagged RNA i polyakrylamidgeler via en Efterfärgnings metod
Summary
Här presenterar vi en känslig, snabb och diskriminerande post-gel färgning metod för att bilden RNAs märkta med RNA mango aptamers I, II, III, eller IV, med antingen infödda eller denaturering polyakrylamid gel elektrofores (PAGE) geler. Efter att ha kört standard PAGE gels, kan mango-taggade RNA lätt färgas med TM-biotin och sedan analyseras med vanligt förekommande fluorescensläsare.
Abstract
Native och denaturering polyakrylamidgeler används rutinmässigt för att karakterisera ribonukleoprotein (RNP) komplex rörlighet och för att mäta RNA-storlek, respektive. Eftersom många gel-Imaging tekniker använder ospecifik fläckar eller dyra fluorophore sonder, känsliga, diskriminerande, och ekonomiska gel-Imaging metoder är mycket önskvärt. RNA mango kärnsekvenser är små (19-22 NT) sekvens motiv som, när de stängs av en godtycklig RNA-stam, kan enkelt och billigt bifogas ett RNA av intresse. Dessa mango Taggar binda med hög affinitet och specificitet till en tiazol-orange fluorophore ligand kallas TM-biotin, som blir tusentals gånger mer fluorescerande på bindning. Här visar vi att mango I, II, III, och IV kan användas för att specifikt bild-RNA i geler med hög känslighet. Så lite som 62,5 fmol av RNA i infödda geler och 125 fmol av RNA i denatureringen geler kan upptäckas genom blöt läggning geler i en avbildning buffert som innehåller kalium och 20 nM-TM-biotin för 30 min. Vi demonstrerar särdragen hos mango-märkta systemet genom att avbilda en mango-Tagged 6S bakterie-RNA i samband med en komplex blandning av totalt bakteriellt RNA.
Introduction
Mango är ett RNA märknings system som består av en uppsättning av fyra små fluorescerande RNA aptamers som binder tätt (nanomolar bindning) till enkla derivat av thiazol-orange (1-biotin, figur 1a)1,2,3 . Vid bindning ökas fluorescensen av denna ligand 1 000-till 4 000-faldigt beroende på den specifika aptameren. Den höga ljus styrkan hos mango systemet, som för mango III överstiger den av förstärkt grönt fluorescerande protein (egfp), kombinerat med HDAC vid nanomolära bindande affinitet av RNA mango aptamers, gör det möjligt att användas både i Imaging och rening av RNA komplex2,4.
Röntgen strukturerna av mango I5, II 6, och III7 har fastställts till hög upplösning, och alla tre aptamers utnyttja ett RNA FYRPLEX till bind TM1-biotin (figur 1b-D). De kompakta kärnorna av alla tre aptamers isoleras från den externa RNA-sekvensen via kompakta adaptermotiv. Mango I och II båda använder en flexibel GNRA-like loop adapter för att ansluta sina mango kärnor till en godtycklig RNA duplex (figur 1b, C). Däremot använder mango III en styv Triplex motiv för att ansluta sin kärna till en godtycklig RNA Helix (figur 1d, lila rester), medan strukturen av mango IV är för närvarande inte känd. Eftersom den ligand-bindande kärnan i var och en av dessa aptamers är skild från den externa RNA-sekvensen av dessa spiralformade adaptrar, verkar det troligt att de alla kan helt enkelt införlivas i en mängd olika RNAs. Den bakteriella 6s regulatoriska RNA (mango i), komponenter i jäst spliceosome (mango i), och den mänskliga 5s RNA, U6 RNA, och en C/D scarna (mango II och IV) har alla framgångs rikt märkts på detta sätt2,8, vilket tyder på att många biologiska RNAs kan märkas med hjälp av RNA mango Aptamer systemet.
Denaturering och Native gels används ofta för att studera RNAs. Denaturering geler används ofta för att bedöma RNA-storlek eller RNA-bearbetning, men typiskt, i fallet med en nordlig blot, till exempel, kräver flera långsamma och sekventiella steg för att generera en bild. Medan andra RNA fluorogena aptamers, såsom RNA spenat och broccoli, har använts framgångs rikt för gel Imaging9, ingen fluorgenic Aptamer system hittills besitter hög ljus styrka och affinitet av mango systemet, vilket gör det av stort intresse att undersöka mango ‘ s gel-Imaging förmågor. I denna studie, undrade vi om RNA mango systemet helt enkelt kan utvidgas till gel Imaging, eftersom excitation och utsläpp våg längder av TM-biotin (510 nm och 535 nm, respektive) är lämpliga för avbildning i eGFP-kanalen som är gemensam för de flesta fluorescerande instrument för gel skanning.
Den post-gel färgning protokoll som presenteras här ger ett snabbt sätt att specifikt upptäcka mango-märkta RNA molekyler i infödda och denaturering polyakrylamid gel elektrofores (PAGE) geler. Denna färgning metod innebär blöt läggning geler i en buffert som innehåller kalium och TM-biotin. RNA mango aptamers är G-fyrplex baserat och kalium krävs för att stabilisera sådana strukturer. Använda RNA transkriberas från minimal mango-kodning DNA-mallar (se protokollet avsnitt), kan vi helt enkelt upptäcka så lite så lite som 62,5 fmol av RNA i infödda geler och 125 fmol av RNA i denaturering geler, med hjälp av en enkel färgning protokoll. I motsats till vanliga ospecifika nukleinsyra fläckar (se tabell över material, hänvisas till SG från Hereon), kan vi tydligt identifiera mango-märkta RNA även när höga koncentrationer av totalt omärkta RNA är närvarande i provet.
Protocol
Representative Results
Discussion
En betydande fördel med mango fluorescerande taggen är att en enda tagg kan användas på flera sätt. Den höga ljus styrka och affinitet av dessa aptamers göra dem användbara inte bara för i cell visualisering2 men också för in vitro-RNA eller RNP rening4. Därför, gel Imaging utökar mångsidigheten hos mango taggen på ett enkelt sätt. Mango gel Imaging känslighet är något mindre än en nordlig blot14 men kan lätt upptäcka 60-120 fm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Razvan Cojocaru och Amir Abdolahzadeh för deras tekniska hjälp och Lena Dolgosheina för korrektur läsning av manuskriptet. Finansiering tillhandahölls för detta projekt av ett kanadensiskt naturvetenskapligt och ingenjörs vetenskapligt forsknings råd (NSERC) drifts bidrag till P.J.U.
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
