Summary
هنا نقدم طريقة لإعداد أورجانوتيبيك الثقافات شريحة من المخيخ الماوس وغمد المايلين تلطيخ من إيمونوهيستوتشيميستري مناسبة للتحقيق في آليات مييلينيشن وريميلينيشن في الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
في الجهاز العصبي، هو المايلين بنية غشاء معقدة التي تم إنشاؤها بواسطة ميليناتينج الدبقية الخلايا، هي محاور عصبية انشياثيس وتسهل التوصيل الكهربي السريع. لقد ثبت تحوير المايلين تحدث في الأمراض العصبية المختلفة، حيث أنها مرتبطة بعجز وظيفي. وهنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للسابقين فيفو النموذجي يتكون من شرائح الدماغ أورجانوتيبيك الماوس، التي يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة لعدة أسابيع وكذلك يكون المسمى لتصور المايلين.
Introduction
الخلايا العصبية هي الخلايا عالية الاستقطاب، التي تتكون من حجرة الدهليزي الجذعية التي تتلقى مدخلات من بيئتها، ومحور عصبي يضمن توليد ونشر للنبضات الكهربائية إلى خلايا أخرى. الانتشار السريع، والتسليم في الوقت المناسب للمعلومات أمر أساسي للأداء السليم للجهاز العصبي. في الفقاريات، فإنه يسر مييلينيشن، الذي يتيح زيادة سرعة التوصيل محواري1. المايلين بنية متخصصة التي شكلتها طبقات المضغوطة من غشاء البلازما المتولدة عن إطلاق ميليناتينج، إلا وهي أوليجوديندروسيتيس في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وخلايا شوان في الجهاز العصبي المحيطي (PNS). في كل من الجهاز العصبي المركزي والسندات الإذنية، التفاعلات أكسوجليال محرك تشكيل المجالات محواري المتخصصة: رانفييه للعقد وتلك المحيطة بها المجالات، وبارانوديس، وجوكستابارانوديس2. شرائح محواري المعزولة من المايلين، أو إينتيرنوديس، بديل مع رانفييه للعقد، التي تتوافق مع المجالات أونميليناتيد صغيرة أثرت في القنوات عن طريق بوابة الجهد الصوديوم (Naالخامس). بتركيز عال والتنشيط السريع للقنواتت نا في رانفييه للعقد يسمح تجديد إمكانات العمل، وجنبا إلى جنب مع خصائص العزل من اﻷغماد المايلين، وضمان التوصيل الفعال والسريع سالتاتوري العصب دفعة على طول محور عصبي3.
بالإضافة إلى دورها في التعجيل بسرعة التوصيل دافع العصبية، يوفر إطلاق ميليناتينج الدعم الأيضية لمحور عصبي، الحفاظ على سلامتها طويلة الأجل والمشاركة في4،بقاء5. وعلاوة على ذلك، أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن المايلين هو التضمين بشكل حيوي في جميع مراحل الحياة، وبالتالي يفترض أن يشارك في التنظيم واللدونه لمختلف وظائف الجهاز العصبي. وهكذا قد تمثل تسويات للتوزيع، وعدد وطول، وسمك اﻷغماد المايلين على طول محاور عصبية طريقة جديدة لضبط دقة مختلف شبكات6،،من78. ولذلك اقتناء التطوري المايلين عملية رئيسية للوظائف الحسية والحركية والمعرفية واضطراب التفاعل بين محاور عصبية وإطلاق يتزايد اعتبار المساهمة الإنمائية أو المكتسبة عصبية 9من الأمراض.
وقد اتسمت تشكيل المايلين، مع ميزة معينة على نسبة عالية من الدهون (70%) مقارنة بالبروتينات (30%) وعلى النقيض من الأغشية الخلوية الأخرى10. ومع ذلك، خلافا للدهون المايلين، معظم البروتينات المايلين محددة إلى المايلين، بما في ذلك البروتين الأساسية المايلين (MBP)، بروتيوليبيد البروتين (حزب العمال التقدمي)، 2 '، 3' دوري النوكليوتيدات 3 '-فوسفوديستريس (CNP)، المرتبطة المايلين بروتين سكري (ماج)، بروتين سكري oligodendrocyte المايلين (موج)، بمب-22 و P010. توجد أساليب نسيجية مختلفة وصمة عار المايلين استناداً إلى تكوين الدهن، مثل لوكسول السريع الأزرق11، "السودان الأسود ب"12، بيكر هيماتين حمض أسلوب13، فضلا عن الفضة تلطيخ14. ومع ذلك، هذه النهج لا تسمح دائماً للتباين كافية والقرار لتصور الألياف الفردية. نهج بديل للكشف عن المايلين من خلال إيمونوهيستوتشيميستري الموجهة ضد بروتينات المايلين. مختلف الأجسام المضادة استهداف المستضدات المايلين على حدة مع خصوصية عالية ويمكن استخدامها بشكل روتيني للكشف عن الهياكل ميليناتيد. يمكن كشف تفاعل مستضد الضد كذلك استخدام جسم ثانوية بالإضافة إلى فلوروفوري الموجهة ضد جسم الأولية وتصور مع الفحص المجهري fluorescence كافية. وهنا يصف لنا بروتوكولا عن وصمة عار المايلين على السابقين فيفو شرائح الدماغ، نموذج الذي يسمح المحافظة على حسن هندسة النسيج العصبي. وباﻹضافة إلى ذلك، المنظمة وحجم خلايا بوركنجي (العصبية myelinated الوحيد من المخيخ) جعلها نموذجا كلاسيكي للدراسات الكهربية والمثل مثالية لإجراء دراسات ثابتة أو تصوير العيش.
يتم إنشاء الشرائح الدماغ من الفئران P9 P10، وقت المقابلة إلى بداية مبكرة لخلايا بوركنجي myelination، عملية التي يتحقق معظمها خلال أسبوع واحد السابقين فيفو (6-7 أيام في المختبر، DIV)15. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج تكييف للتحقيق في اضطرابات دملينتينغ مثل التصلب المتعدد (MS)، كما يمكن الناجمين عن demyelination واسعة في الدماغ الشرائح باستخدام مركب ليسوفوسفاتيديلتشوليني ميلينوتوكسيك (أو ليسوليسيثين، LPC)، التي يتبعها16،ريميليناتيون عفوية17. تأخذ مكان من يومين بعد إزالة LPC من المتوسط الثقافة ريميليناتيون الذاتية وهو إكمال علاج بعد أسبوع تقريبا.
الانتهاء من هذا البروتوكول يأخذ أبروكسيماتيفيلي 3 أسابيع، بما في ذلك نصف يوم لإعداد الثقافات شريحة الدماغ وأسبوع للحصول على شرائح myelinated تماما، يليه يومان تصل إلى ذروة demyelination وأسبوع آخر للكاملة ريميليناتيون. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إكمال إيمونوهيستوتشيميستري في 2 يوما. البروتوكول الموصوفة هنا هو يتكيف مع القمامة العادية من 6 الفئران الجراء ويحتاج إلى تكييف فيما يتعلق بعدد الحيوانات التي استخدمت في التجربة المزمعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأعمال التي تنطوي على الحيوانات الامتثال للسياسات المؤسسية والمبادئ التوجيهية التي وضعتها UPMC و INSERM والفرنسية وتوجيه مجلس الجماعة الأوروبية 86/609/EEC.
1-إعداد متوسطة الثقافة والثقافة بإدراج (التدريب العملي على الوقت ≈ 10 – 15 دقيقة)
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء ثقافة تدفق تحت ظروف معقمة
- إعداد 40 مل من الثقافة المتوسطة، التي تتألف من 50% BME, متوازن الملح الحل 25% هانك (س 1)، 25% معطل الحرارة الحصان المصل، تستكمل مع مشتقات الجلوتامين 2 مم، 100 وحدة دولية/مل البنسلين-ستربتوميسين و 4.5 ملغ/مل د-الجلوكوز. قم بضبط ال pH إلى 7.4.
- عامل التصفية-تعقيم المتوسطة من خلال عامل تصفية ميكرومترات 0.22 تكييفها في حقنه بلاستيكية 50 مل.
ملاحظة: ويمكن تخزين الثقافة المتوسطة عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوع على الأقل. - للقمامة قياسية من الجراء 6، واستخدام اثنين من لوحات 6-جيدا العقيمة. لكل لوحة، قم بإزالة الغطاء وأضف 1 مل متوسطة الثقافة الواحدة وكذلك.
- مكان إدراج ثقافة واحدة في كل بئر الفردية بالضغط على حافة البلاستيك مع الملقط العقيمة. وضع الغطاء مرة أخرى على اللوحة.
ملاحظة: يمكن إرسالها شرائح الدماغ التي تم جمعها من ألجرو واحد (6-8) في الأغشية اثنين (3-4 شرائح الدماغ كل إدراج الغشاء).
2-إعداد متوسطة تشريح (التدريب العملي على الوقت ≈ 5 دقيقة)
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء ثقافة تدفق تحت ظروف معقمة
- تحضير 100 مل من تشريح المتوسطة، التي تتألف من "موازنة الحل" جي الملح تستكمل مع 4.5 ملغ/مل د-الجلوكوز و 1 x البنسلين – ستربتوميسين (100 وحدة دولية/مل كل).
- عامل التصفية-تعقيم المتوسطة من خلال وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: يمكن تخزين متوسطة تسلخ في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد على الأقل. - إضافة 5 مل من تشريح الباردة المتوسطة إلى 60 مم خلية ثقافة الأطباق. تحضير طبق ثقافة الخلية 60 ملم واحد لكل ألجرو أن تشريح.
- تبقى الأطباق تشريح على الجليد حتى الاستخدام.
3-إعداد مواد التشريح (≈ "وقت التدريب العملي على" 15 دقيقة)
- تنظيف مقاعد البدلاء مع الإيثانول 100%.
- تعقيم جميع أدوات التشريح، وشفرة حلاقة ومنصة للمروحية الأنسجة البلاستيك مع الإيثانول 100%.
- حل شفرة حلاقة ومنصة بلاستيكية على المروحية الأنسجة وضبط سمك القطع إلى 300 ميكرون.
- تأكد من أن كافة الإيثانول قد تبخرت قبل البدء التشريح.
4-سيريبيلومديسيكشن وإعداد أقسام (≈ "وقت التدريب العملي على" 15 – 20 دقيقة للحيوان الواحد)
- ضع واحداً من الأطباق الثقافة خلية 60 ملم تحتوي على المتوسط تشريح المثلج تحت مجهر وإزالة اللوحة العلوية.
- مسحه الرأس الفراء مع الإيثانول 70% (بعناية تجنب لمس العينين الحيوان) وقطع رأس الحيوان باستخدام مقص حاد كبير، وفقا للإجراءات المعتمدة.
ملاحظة: يتم إنشاء الشرائح الدماغ من الفئران P9 P10 دون أي جنس معين أو سلالة التحيز. - استخدام مقص صغير لقص الجلد على طول خط الوسط رئيس بدءاً من الرقبة والصعود إلى كمامة الماوس.
- عقد الرئيس وفضح الجمجمة، إضعاف الجلد بطنيا تحت الرأس إلى الوراء، وقرصة طيتين من الجلد بين الأصابع.
- إدراج المقص الصغيرة بلطف ماغنوم ثقبة وقطع الجمجمة بجعل أحد شق نحو الجانب الوحشي وقطع ثم جميع أنحاء جمجمة الرأس. تبقى غيض المقص بالتوازي وبالقرب من الجمجمة ممكن بينما قطع، لتجنب إتلاف أنسجة المخ.
- استرداد الجزء الظهرية الجمجمة باستخدام الملقط غرامة على التوالي. حين رفع الجزء الظهرية الجمجمة بعناية، قص السحايا المنضمة (غشاء المروية الشفافة المحيطة بأنسجة المخ) إذا لزم الأمر مع مقص صغير لتجنب إتلاف أنسجة المخ.
- الأخذ بعناية بالملقط غرامة على التوالي (أو بدلاً من ذلك استخدام ملعقة) بين الجمجمة البطني والدماغ، بلطف الوجه الدماغ وقص الألياف البصرية والأعصاب trigeminal مع مقص صغير.
- تساعد الدماغ على التخلي عن طريق الجاذبية إلى 60 مم الطبق ثقافة الخلية المحتوية على تشريح المثلج المتوسطة عن طريق تحويل الرأس رأسا على عقب فوق الطبق والإفراج عن الالتصاقات الماضي مع مقص صغير إذا لزم الأمر.
- استخدام الملقط غرامة، توجيه الدماغ مع الجانب الظهرية التي تواجه الباحث، والجانب البطني الكذب على الجزء السفلي من الطبق.
- تحت المجهر، استخدام الملقط غرامة على التوالي لشل الدماغ على الجانب فوريبرين وتجنب لمس hindbrain، كما أنها يمكن أن تحصل على تضررت. فصل في هيندبرين عن باقي الدماغ (الصدارة-و midbrain، انظر التخطيطي على الرقم 1Aa)، باستخدام الملقط غرامة على التوالي. لفصل المخيخ عن بقية هيندبرين، استخدم الملقط غرامة لقطع بيدونكليس الدماغ تحت المخيخ (انظر التخطيطي على 1Aa الشكل ').
- مرة واحدة المخيخ معزولة، بعناية بعيداً المسيل للدموع السحايا استخدام الملقط غرامة على التوالي (انظر التخطيطي على 1Aa الشكل ').
- عقد المخيخ برفق مع الملقط المنحنية الجميلة ووضعه مع الجانب الظهرية يصل إلى ساحة البلاستيك عمودياً إلى شفرة حلاقة المروحية (انظر الشكل 1Bbالتخطيطي).
- نضح أي فائض من تشريح المتوسطة حول المخيخ باستخدام تلميح عقيمة نهاية رقيقة ماصة تكييفها على 1 مل "الماصة؛" (انظر 1Bb الشكلالتخطيطي).
- ضمان أن المخيخ يضع شقة، ولكن لا تمتد، وتوضع مرة واحدة على منصة للحصول على شرائح السهمي الأمثل أثناء تقطيع (انظر التخطيطي على الرقم 1Bb).
- شريحة 300 ميكرومتر سميكة السهمي أقسام المخيخ مع المروحية الأنسجة (انظر التخطيطي على 1Bb الشكل '). بقوة وسرعة النصل يجب أن يكون الأمثل في الموقع.
- إضافة قطره من تشريح المتوسطة على المخيخ شرائح بلطف. استخدام تلميح ماصة واسعة-تتحمل توضع على ماصة 1 مل، نضح المخيخ شرائح ببطء وتحويلها مرة أخرى إلى الطبق الثقافة خلية 60 ملم يحتوي على تشريح المثلج المتوسطة (انظر التخطيطي على 1Bb الشكل '').
- تنظيف منصة بلاستيكية أن المروحية الأنسجة مع الإيثانول 100% بين كل تقطيع المخيخ. واسمحوا الإيثانول تتبخر قبل وضع المخيخ القادم إلى ساحة.
- استخدام اثنين الملقط غرامة على التوالي (أو بدلاً من ذلك الإبر التيتانيوم) لفصل شرائح فردية وحدد شرائح 6-8 من الدودة (انظر التخطيطي على الرقم 1Cc و 1Cc ').
- تأخذ لوحة 6-جيدا مع إدراج الثقافة ونقل تصل إلى 4 شرائح مختارة على إدراج ثقافة واحدة جنبا إلى جنب مع بعض المتوسطة التشريح، استخدام تلميح ماصة واسعة-تتحمل تكييفها على ماصة 1 مل (انظر التخطيطي على 1Cc الشكل ').
- وضع الشرائح في وسط إدراج ثقافة استخدام المتوسطة تشريح أو الملقط لدفع وسحب منهم بلطف في الموقع الصحيح، وتجنب لها أن تكون على اتصال ببعضها البعض (انظر التخطيطي على 1Cc الشكل ').
- إزالة أي فائض من تشريح المتوسطة حول الشرائح باستخدام تلميح ماصة نهاية رقيقة. التأكد من أن الشرائح وضع مسطح على الغشاء (انظر التخطيطي على 1Cc الشكل ').
- ضع لوحة 6-جيدا في الحاضنة بعد مباشرة بعد إضافة الشرائح على الغشاء.
5-شرائح الثقافة و Demyelination (التدريب العملي على الوقت ≈ 15 – 20 دقيقة)
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء ثقافة تدفق تحت ظروف معقمة
- استبدال المتوسطة الثقافة مع 1 مل كل بئر المعالجون مسبقاً ومخزنة المتوسطة ثقافة جديدة كل 3 أيام بعد إعداد شريحة.
- Demyelination، إزالة جميع الثقافة المتوسطة أدناه إدراج الثقافة بعد 6 أيام في المختبر (DIV) واستبدله مع 1 مل كل جيدا من قبل حرارة المتوسطة الثقافة الطازجة التي تحتوي على 0.5 ملغ/مل LPC. احتضانها ح 15-17 على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
- بعد الحضانة، يغسل إدراج بوضعها في طبق بتري 25 مم تحتوي على 1 مل من قبل حرارة الثقافة المتوسطة.
ملاحظة: إدراج ينبغي أن يكون على اتصال المتوسطة، ولكن لا تكون مشمولة بذلك. - نقل إدراج الثقافة في صفيحة 6-بئر جديدة تتضمن الطازجة المتوسطة الثقافة المعالجون مسبقاً على الفور.
- استبدال المتوسطة الثقافة مع 1 مل من قبل حرارة متوسطة ثقافة جديدة كل 2-3 أيام حتى شرائح التثبيت.
6-إيمونوهيستوتشيميستري (وقت التدريب العملي على ≈ 01:30 – 2 ح)
ملاحظة: القيام بخطوات 6.1. إلى 6.3. تحت غطاء دخان. تجنب المعرض إلى بارافورمالدهيد (PFA) والرجوع إلى ورقة بيانات السلامة المنتج للتلاعب بالكافي والحماية.
- استخدام الملقط لرفع إدراج كل ثقافة بالضغط على حافة البلاستيك وإزالة إدراج المتوسطة الثقافة تحت الغشاء من كل بئر.
- إصلاح شرائح الدماغ لمدة 30 دقيقة عن طريق إضافة 2 مل 4% منهاج عمل بيجين في 1 × برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4 على إدراج غشاء.
ملاحظة: النقطة وقت التثبيت يعتمد على مرحلة مييلينيشن درس: 4 DIV يتوافق مع بداية مييلينيشن، 7 DIV لشرائح ميليناتيد تماما. في حالة العلاج LPC، يناظر 9 DIV ذروة demyelination، DIV 11 إلى بداية ريميلينيشن و DIV 14 إلى شرائح ريميليناتيد تماما. - أغسل إدراج مع شرائح ثلاث مرات مع مل 2 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
- فصل الشرائح من إدراج غشاء تحت مجهر استخدام علامة x 25 إلى 30 x التكبير، بدفعهم برفق باستخدام مشرط أو فرشاة. وبدلاً من ذلك، لتجنب خطر إلحاق الضرر بالشرائح أثناء فصل لهم من الغشاء، استخدام مشرط لقطع الغشاء مع شرائح لا تزال تعلق.
- نقل شرائح عائمة في آبار صفيحة 4-كذلك يتضمن برنامج تلفزيوني x 1، باستخدام فرشاة.
- نضح برنامج تلفزيوني من كل بئر واحتضان الشرائح في الإيثانول 100% قبل تبريد في-20 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. هذه الخطوة تسهل اختراق جسم في ألياف ميليناتيد.
- نضح الإيثانول 100% ويغسل مرة واحدة بإيجاز مع 1 × برنامج تلفزيوني، ثم مرتين في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح في برنامج تلفزيوني واحتضان الشرائح من 30 إلى 45 دقيقة مع محلول يحتوي على 1 × برنامج تلفزيوني، 5% خ ع، المنظفات غير الأيونية 0.3% عند درجة حرارة الغرفة كتلة جسم غير محدد مواقع التثبيت.
- نضح عرقلة الحل. لا الغسيل ضروري.
- احتضان الشرائح بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأساسي المخفف في عرقلة الحل في 4 درجات مئوية. تصور المايلين على شرائح أورجانوتيبيك الدماغ، استخدام MBP (الدجاج، 1/150 أو الماوس IGg2b، Smi99، 1/200) أو حزب العمال التقدمي (الفئران، هيبريدوما، 1/5 إلى 1/10) الأجسام المضادة.
ملاحظة: للكشف عن التعبير عن مستضد واحد أو أكثر في نفس الشريحة، إجراء مزدوج أو ثلاثية تلطيخ الداخلي (انظر الشكل 1 على سبيل مثال). لتنفيذ في الحضانة في وقت واحد، تكفل إنتاج الأجسام المضادة الأولية في الأنواع المختلفة. ثم استخدم تلك الأجسام المضادة الثانوية المقابلة بالإضافة إلى فلوروفوريس مختلفة (انظر الجدول للمواد العقدي وبارانودال ماركر18 الأجسام المضادة). - اليوم الثاني، تغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 10 دقائق.
- احتضانها ح 3 مع الأجسام المضادة الثانوية التي تضعف في عرقلة الحل (تمييع 1/500) في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: الاستغلال الأمثل للوقت جسم تمييع والحضانة قد تكون مطلوبة عند استخدام أجسام أخرى من تلك الموصوفة هنا. - تغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 10 دقائق في الظلام.
- تحت مجهر، جبل الشرائح على شريحة زجاجية. ضع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x على الشريحة ونقل الشرائح في برنامج تلفزيوني باستخدام فرشاة. تتكشف الشرائح إذا لزم الأمر، وتتسطح منهم على الشريحة. إزالة أي فائض في برنامج تلفزيوني. في حالة إيمونولابيلينج تتم مع الشرائح لا تزال تعلق الأغشية، جبل مع الشرائح التي تواجه ساترة، مع الغشاء على الشريحة الزجاجية.
- ضع قطره من تصاعد المتوسطة مباشرة على ساترة الزجاج وتغطي الشرائح بلطف. ويمكن تخزين الشرائح المحملة لعدة أشهر عند 4 درجة مئوية في الظلام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أمثلة على إيمونوستينينجس المايلين الممثل في شرائح الدماغ أورجانوتيبيك التي تم الحصول عليها من C57black6 P9 P10 البرية من نوع (WT) (الشكل 2A)، فضلا عن حزب العمال التقدمي-بروتينات فلورية خضراء الفئران المحورة وراثيا (الشكل 2)، جنبا إلى جنب مع خلايا بوركنجي تلطيخ. شرائح الدماغ ميليناتي من هذه المسألة الأبيض مسارات منطقة الشرائح صوب المحيط فندق folia وميليناتيون خلايا بوركنجي يتحقق معظمها بعد 6 إلى 7 شعبة. في شعبة 7، تقلد ديمييلينيشن الكامل ممكن عن طريق العلاج LPC (2Ci الشكلالثاني). ديميليناتيون التالية، والشرائح تلقائياً ريميليناتي وتماماً ريميليناتيد 6-7 أيام بعد ذروة ديميليناتيون (الشكل 2Ciii).
رقم 1: رسم توضيحي المخيخ شرائح الجيل. ينقسم التشريح في ثلاث خطوات رئيسية. (أ) المخيخ معزولة وإزالتها السحايا (الخطوات 4.10 و 4.11). (ب) المخيخ ثم نقل إلى منصة المروحية وشرائح (خطوات 4.12 إلى 4.16). (ج) أخيرا، الشرائح معزولة من دودة ووضعت في إدراج غشاء. تتم إزالة المتوسطة التشريح نقل مع الشرائح ويوضع لوحة 6-جيدا في الحاضنة (الخطوات 4.18 و 4.22). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: مثال على شرائح الدماغ myelinated مثقف السابقين فيفو. رصات الصور (مع إسقاط متعامد) تم الحصول على استخدام مجهر [كنفوكل] تستقيم عقب إيمونولابيلينج العائمة مجاناً ومسطحة تصاعد كما هو موضح في البروتوكول. الشرائح قوة ميليناتيد في الدرجة 11 (A, حزب العمال التقدمي؛ ب، والتجارة والنقل باللون الأخضر) ويتم تجميعها في مجالات محواري كما لوحظ في المجراة مع عقد رانفييه للتخصيب في الصوديوم عن طريق بوابة الجهد قنوات (Naالخامس، باللون الأحمر) يحف به المجال مفرق أكسوجليال بارانودال (كاسبر، في الأبيض) في وزن C57black6 (A ) فضلا عن شرائح الفئران المعدلة وراثيا حزب العمال التقدمي-التجارة والنقل (ب). الهندسة المعمارية (ج) قشرة الدماغ محفوظاً في شرائح مثقف، كما لوحظ على شرائح الدماغ من الفئران حزب العمال التقدمي-التجارة والنقل. (أنا) بوركنجي الخلايا إكسون (كالبيندين، كالب، باللون الأزرق) هي قوة ميليناتيد (التجارة والنقل، باللون الأخضر) بعد أسبوع واحد في الثقافة. العلاج (ثانيا) LPC تماما ديميليناتيس الشرائح، التي ريميليناتي تلقائياً وهي تماما ريميليناتيد 6 أيام بعد demyelination (ثالثا، 14 DIV). تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر (أ، ب)؛ 100 ميكرومتر (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لإنشاء السابقين فيفو نموذج المقابلة لثقافات شريحة أورجانوتيبيك الدماغ الماوس، تكييفها من قبل أساليب نشر15،،من1619 والمايلين اللاحقة إيمونوستينينج لهذه الاستعدادات. توفر هذه الاستراتيجية إمكانية تصور مكونات المايلين مع ذات الدقة العالية في الدول على حد سواء سليمة ومرضية.
أورجانوتيبيك الدماغ شريحة الثقافات المأخوذة من الفئران عمره 10 أيام نموذج تجريبي راسخة للتحقيق الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء عمليات ميليناتيون وريميليناتيون، كما أنها تسمح لاستخراج معظم التشريحية و الحصول على ميزات وظيفية المقابلة الأنسجة الحية بما في ذلك ليس فقط الحفاظ على بنية خلوية محددة تحديداً جيدا ولكن أيضا جدول زمني نضوج17. وعلاوة على ذلك، شرائح الدماغ لديها منظمة معمارية الحفاظ عليها بعد أسبوعين في المختبر (الشكل 1). حزب العمال التقدمي-بروتينات فلورية خضراء سلالة محوره وراثيا بديل، يسمح، على وجه الخصوص، لمراقبة حالة myelination تحت مجهر فلوري على شرائح حية، ومناسبة خاصة للدراسات ديميليناتيون-ريميليناتيون (الرقم 1 ).
هذه الاستعدادات تعتبر ذات أهمية خاصة كنهج سريعة لتقييم معدل مييلينيشن مع التقدير الكمي الآلي المتقدمة، بما في ذلك تحليل وصمة عار الغربية20، كنباسي المقايسة16 أو التحديد الكمي لحزب العمال التقدمي/كالبيندين (أو MBP/ كالبيندين) المصبوغة17،21، وبالتالي يمثل نظام الفائق للسماح لاختبار العقاقير الدوائية في دملينتينغ الاضطرابات22،23.
واحدة من القضايا الرئيسية الحاسمة عند إجراء هذه التجارب قد تكون ذات صلة بنوعية شرائح الدماغ. أولاً، سن الفئران من أهمية بالنسبة للثقافات شريحة أورجانوتيبيك الدماغ. للخطر بقاء خلايا بوركنجي، العصبية myelinated فقط في الثقافات الدماغ، إذا كانت الثقافات تعد من P2 إلى القوارض P7 أو مع الجهات المانحة أقدم من P1317. وبصورة أعم، أورجانوتيبيك الدماغ شريحة الثقافات من الصعب الحصول على من الحيوانات الكبار. ثانيا، مدة تجهيز الأنسجة أثناء تشريح أمر بالغ الأهمية، تشريح خطوة لأكثر من 15-20 دقيقة للحيوان الواحد يؤدي إلى انخفاض في معدل البقاء على قيد الحياة من الشرائح. وعلاوة على ذلك، عند تحديد الشرائح تكون مثقف، فمن الأفضل تجنب استخدام تلك من طرفي المخيخ بسبب بقاء الفقراء من الخلايا العصبية وندرة الناتجة من ألياف ميليناتيد.
معلمات أخرى مثل استقرار درجة الحرارة وتركيز CO2 بينما في الثقافة هي تحديد العوامل لضمان صحة شريحة. أخيرا، ونوعية الشرائح يتأثر تكوين المصل الحصان، التي لا يمكن التحكم بها للمستخدمين. ولذلك، اختبار عدة دفعات من مصل الدم ينصح بشدة.
للحصول على العلامات الكافية، يتم تثبيت الأنسجة خطوة أساسية. من أجل تسهيل الاختراق من الأجسام المضادة للوصول إلى المستضدات المايلين، المايلين هيكل مضغوط جداً، ينصح شرائح المعالجة المسبقة مع الإيثانول المطلق التالي للتثبيت. يمكن كذلك تطبيق بروتوكول مماثل لتلطيخ للأنسجة في فيفو ثابتة، على الرغم من تركيز تريتون قد تحتاج إلى أن يتكيف مع سمك فيبرتوم أو كريوستات إنشاء المقاطع الحية. ينبغي أيضا النظر في توافر الأجسام المضادة غير تجارية. إعداد شرائح من الفئران المعدلة وراثيا مثل حزب العمال التقدمي-بروتينات فلورية خضراء24 أو25 من CNP-التجارة والنقل وبالتالي يمثل بديلاً لوضع تصور لعمليات المايلين وأوليجوديندروسيتيس.
فضلا عن الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول، تستخدم عادة نهج أخرى لدراسة الهندسة المعمارية المايلين. كما توجد تقنيات مكملة للتحقيق أولتراستروكتوري المايلين، مع الميكروسكوب الإلكتروني يجري معيار الذهب26. توجد تقنيات أخرى، مثل النهج تسمية مجاناً بما في ذلك التصوير المقطعي التماسك الضوئية27،28، رامان تبعثر28،29، الجيل الثالث-التوافقي30 أو الطيفية [كنفوكل] الانعكاس مجهرية31؛ هذه النهج مزية إضافية لتمكين مراقبة العمليات الحيوية الخلوية. ومع ذلك، بعض هذه التقنيات معقدة، وتتطلب كذلك الهياكل مجهرية الدولة للفنون. لهذه الأسباب، تبقى دراسة المايلين بوصفها الفلورة نهجاً موحدة للتحقيق في مييلينيشن وعيوبه في مختلف الأمراض الإنمائية أو المكتسبة ونماذجها، فضلا عن تقييم إمكانات المستقبل العلاجية العلاجات. يمكن استخدامه كذلك لدراسة مييلينيشن في سياقات متعددة، مثل التعلم واللدونه، فضلا عن الشيخوخة، والاكتئاب، أو التوحد التي من المعروف أن غيرت32المايلين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لدى أي من أصحاب المصالح المتنافسة أو المصالح المتضاربة.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور شون فريمان، والدكتورة ناتالي سول-فولون والدكتور توماس رو لتعليقات قيمة على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من INSERM، ICM، والمنح أرسيب R13123DD، R17127DD ANR (إلى ميلادي) والعلاجات الزمالة، SPF20110421435 (إلى ميلادي)، FDT20170437332 (لتم). ونشكر مرفق الثقافة الخليوي سيليس و icm. منصة التصوير ضليع في الرياضيات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
