Summary
本文提出了一种利用免疫组织化学方法制备小鼠小脑和髓鞘染色的有机切片培养方法, 该方法适用于研究中枢神经系统髓鞘和再髓鞘的机制。
Abstract
在神经系统中, 髓鞘是由髓鞘胶质细胞产生的复杂的膜结构, 它使轴突产生, 并促进快速的导电性。髓鞘改变已被证明发生在各种神经疾病, 其中它与功能缺陷。在这里, 我们提供了一个由小鼠有机型小脑切片组成的体外模型的详细描述, 该模型可以在培养中保持数周, 并进一步标记为髓鞘可视化。
Introduction
神经元是高度极化的细胞, 它包括一个接收来自其环境的输入的长质树突隔间和一个轴突, 确保电脉冲的产生和传播到其他细胞。快速传播和及时提供信息对于神经系统的正常运作至关重要。在脊椎动物中, 它是由髓鞘促进, 这允许增加轴突传导速度1。髓鞘是由髓鞘胶质细胞 (即中枢神经系统中的少突胶质细胞) 和外周神经系统 (PNS) 中的雪旺细胞) 所产生的质膜压实层形成的一种特殊结构。在中枢神经系统和 PNS 中, 轴交相互作用推动了专门轴突域的形成: Ranvier 的节点及其周围域、anoco因为和 juxtaparode2。由髓鞘绝缘的轴突段, 或节间, 与 Ranvier 的节点交替, 对应于在电压门控钠通道 (Na v) 中丰富的未髓鞘小域 (nav)。Ranvier 节点上 nav通道的高浓度和快速激活使动作电位得以再生, 并与髓鞘的绝缘性能相结合, 确保了沿轴突3的神经冲动.
髓鞘胶质细胞除了在加速神经冲动传导速度方面的作用外, 还为轴突提供代谢支持, 保持其长期完整性, 并参与其生存4,5。此外, 近年来, 髓鞘在整个生命过程中都得到了动态的调节, 因此大概参与了各种神经系统功能的调节和可塑性。因此, 沿轴突调整髓鞘的分布、数量、长度和厚度可能是一种新颖的方法, 可以对各种网络6、7、8进行微调。因此, 髓鞘的进化习得是感觉、运动和认知功能的关键过程, 轴突和胶质细胞之间相互作用的扰动越来越被认为有助于发育或获得的神经疾病9。
髓鞘成分的特点, 其特点是脂质比例高 (70%)与蛋白质相比 (30%)与其他细胞膜相比,10。然而, 与髓鞘脂质不同的是, 髓鞘蛋白大多是髓鞘特异性的, 包括髓鞘碱性蛋白 (MBP)、蛋白脂蛋白 (PLP)、2 '、3 '-环核苷酸 3 '-磷酸二酯酶 (CNP)、髓碱相关糖蛋白 (MAG),髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG), PMP-22 和 P010.各种染色髓鞘的组织学方法, 如卢克索快速蓝11, 苏丹黑色 b12, 贝克酸血红素法13, 以及银染色14。然而, 这些方法并不总是允许足够的对比和分辨率来可视化单个纤维。检测髓鞘的另一种方法是针对髓鞘蛋白的免疫组织化学。各种抗体针对的是具有高度特异性的髓系特异性抗原, 可用于常规检测髓鞘结构。抗体-抗原相互作用可以进一步揭示使用二级抗体结合到荧光团针对的原代抗体和可视化与适当的荧光显微镜。在这里, 我们描述了一个免疫化学协议, 染色髓鞘在体内小脑切片上, 一个模型, 允许一个很好地保存神经组织结构。此外, Purkinje 细胞 (小脑的唯一髓鞘神经元) 的组织和大小使它们成为电生理研究的经典模型, 它们同样是进行固定或活体成像研究的理想选择。
小脑切片由 P9-p10 小鼠生成, 这一时间与 Purkinje 细胞髓鞘的早期发生相对应, 这一过程主要是通过体内一周 (体外 6-7, DIV)15来实现的。此外, 该模型适用于研究脱髓鞘疾病, 如多发性硬化症 (MS), 因为广泛脱髓鞘可以诱导小脑片使用骨髓毒性化合物溶磷酸胆碱 (或溶菌素, LPC),随后是 16,17 的自发再髓鞘。内源性再髓鞘发生在 LPC 从培养基中取出后的两天内膜再髓鞘, 几乎在治疗一周后完成。
完成该协议大约需要3周的时间, 包括半天的小脑切片培养准备, 一周获得完全髓鞘切片, 然后2天达到脱髓鞘的高峰, 再过一周的时间进行充分的准备。再髓鞘。此外, 免疫组织化学可在2天内完成。这里描述的协议适用于6只小狗的标准垃圾, 需要根据计划中的实验所使用的动物数量进行调整。
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Protocol
所有涉及动物的工作都符合 UPMC、中小学和法国及欧洲共同体理事会第86/609/EEC 号指令制定的体制政策和准则。
1. 培养培养基和文化插入物的准备 (动手时间10–15分钟)
请注意:在无菌条件下, 在流动培养罩中执行此步骤
- 制备40毫升培养基, 包括 50% BME, 25% Hank 的平衡盐溶液 (1x), 25% 的热灭活马血清, 补充 2 ML 谷氨酰胺衍生物, 100 Um/ml 青霉素链霉素和 4.5 mgml d-葡萄糖。将 pH 值调整为7.4。
- 通过适用于50毫升塑料注射器的0.22μm 过滤器对培养基进行消毒。
请注意:培养基可在4°c 下储存至少一周。 - 对于6个小狗的标准垃圾, 使用两个无菌6孔板。对于每个板材, 取下盖子, 每口添加1毫升培养基。
- 用无菌钳固定塑料边缘, 将一个培养物插入每个井中。把盖子放回盘子里。
请注意:从一只小狗 (6-8) 收集的小脑切片可在两个膜上发送 (每膜插入3-4 个小脑片)。
2. 解剖介质的制备 (动手时间 5分钟)
请注意:在无菌条件下, 在流动培养罩中执行此步骤
- 制备100毫升的解剖介质, 其中包括 Gey 的平衡盐溶液, 辅以 4.5 mgl d-葡萄糖和1x 青霉素-链霉素 (每个100元)。
- 滤清器通过0.22μm 过滤单元对介质进行灭菌。
请注意:解剖介质可在4°c 下储存至少一个月。 - 在60毫米细胞培养皿中加入5毫升的冷解剖介质。准备一个60毫米细胞培养盘, 为每只幼崽进行解剖。
- 将解剖盘放在冰上, 直到使用。
3. 解剖材料的准备 (动手时间 15分钟)
- 用100% 乙醇清洁长凳。
- 用100% 乙醇消毒所有解剖工具、剃须刀片和组织切割机的塑料平台。
- 将剃须刀片和塑料平台固定在纸巾切刀上, 并将切割厚度调整为300μm。
- 在开始解剖之前, 一定要确保所有的乙醇都蒸发了。
4. 小脑解剖和切片准备 (每只动物15-20分钟的实际时间)
- 将含有冰凉解剖介质的60毫米细胞培养盘中的一个放置在双目显微镜下, 取出顶板。
- 根据批准的程序, 用70% 的乙醇擦拭头部毛皮 (小心避免触摸动物的眼睛), 并使用大型锋利的剪刀将动物斩首。
请注意:小脑切片是由 P9-p10 小鼠产生的, 没有任何特定的性别或应变偏差。 - 用小剪刀从脖子开始, 一直走到老鼠的枪口, 沿着头部中线切割皮肤。
- 要抓住头部, 露出头骨, 将皮肤在头部下侧向折叠, 并在手指之间捏两个皮肤褶皱。
- 将小剪刀轻轻插入孔状大, 并通过向一侧进行一个侧向切口来切割头骨, 然后在头部颅骨周围全部切割。在切割时, 保持剪刀尖端平行, 尽可能靠近头骨, 以避免破坏脑组织。
- 用细直钳取回头骨的背侧。在小心抬起颅骨的背侧的同时, 如果需要, 用小剪刀切割粘附的脑膜 (脑组织周围的半透明冲洗膜), 以避免损坏脑组织。
- 小心引入腹侧头骨和大脑之间的细直钳 (或使用铲子), 轻轻翻转大脑, 用小剪刀切割视神经和三叉神经。
- 帮助大脑通过重力进入包含冰凉解剖介质的60毫米细胞培养盘, 将头部倒置在盘子上方, 并在需要时用小剪刀释放最后的粘连。
- 使用精细的钳子, 将大脑定位, 背侧面向研究人员, 腹侧躺在盘子底部。
- 在双目显微镜下, 使用细直钳固定大脑的前脑侧, 避免接触后脑, 因为它可能会得到损害。将后脑与大脑的其他部分分开 (前脑和中脑, 见图 1Aa上的示意图), 使用精细直钳。要将小脑与后脑其他部位分开, 请使用细钳将小脑下方的小脑踏板切开 (参见图 1Aa '图的示意图)。
- 一旦小脑被隔离, 用细直钳小心地撕开脑膜 (参见图 1Aa ' 上的示意图).
- 用精细弯曲的钳子轻轻握住小脑, 将其与背侧垂直地放在塑料平台上 (参见图 1Bb上的示意图)。
- 使用适用于1毫升移液器的无菌薄端移液尖端在小脑周围吸收任何多余的解剖介质 (参见图 1Bb上的示意图)。
- 确保小脑扁平, 但不拉伸, 一旦放置到平台上, 以获得最佳的矢状切片在切片过程中 (参见图 1Bb上的示意图)。
- 用组织切割机将小脑的300μmtal 部分切成薄片 (参见图 1Bb '上的示意图)。刀片的力和速度必须在现场进行优化。
- 轻轻地在切片的小脑上加入一滴解剖介质。使用放置在1毫升移液器上的宽孔移液器尖端, 慢慢吸气切割小脑, 并将其转移回包含冰凉解剖介质的60毫米细胞培养盘 (参见图 1Bb ' ')上的示意图)。
- 用100% 乙醇在每个小脑切片之间清洁组织切割机的塑料平台。让乙醇蒸发, 然后再把下一个小脑放在平台上。
- 使用两个细直钳 (或或者钛针) 来分离单个切片, 并从片中选择6-8 片 (参见图 1Cc和1cc '上的示意图)。
- 使用适应在1毫升移液器上的宽孔移液器尖端 (参见图1Cc '上的示意图), 取一个6孔板, 并将最多4个选定的切片与一些解剖介质一起转移到一个培养件上。
- 将切片放置在培养物的中间, 使用解剖介质或钳子将切片轻轻推入正确位置, 避免它们彼此接触 (参见图 1Cc '上的示意图)。
- 使用薄端移液器尖端去除切片周围多余的解剖介质。确保切片平铺在膜上 (参见图 1Cc '上的示意图)。
- 在膜上添加切片后, 立即将6孔板放入孵化器中。
5. 切片培养和脱髓鞘 (动手时间 15-20分钟)
请注意:在无菌条件下, 在流动培养罩中执行此步骤
- 切片制备后, 每口预热和缓冲新鲜培养基, 每井用1毫升取代培养基。
- 对于脱髓鞘, 体外 6天 (DIV) 后取出培养基下面的所有培养基, 用每口含有 0.5 mg/mL LPC 的预热新鲜培养基中每口1毫升取代。在37°c 下孵化 15-17小时, 5% CO2。
- 孵育后, 将刀片放入含有1毫升预热培养基的25毫米培养皿中, 清洗。
请注意:刀片应与介质接触, 但不包括在介质中。 - 立即转移培养物插入一个新的6孔板, 其中包含新鲜的预热培养基。
- 每2-3天将培养基更换1毫升预热新鲜培养基, 直到固定切片。
6. 免疫组织化学 (动手时间1:30–2小时)
请注意:执行步骤6.1。到6.3。在通风柜下避免对甲醛 (PFA) 进行说明, 并参考产品安全数据表进行充分的操作和保护。
- 使用钳子通过保持塑料边缘和从每个井的膜插入下去除培养基下面的培养介质来提升每个培养物的插入物。
- 在膜刀片上添加2ml 的 4% PFA, 将小脑片固定30分钟。
请注意:固定的时间点取决于所研究的髓鞘阶段: 4 DIV 对应于髓鞘的开始, 7 DIV 对应于完全髓鞘切片。在 LPC 治疗的情况下, 9 DIV 对应于脱髓鞘的峰值, 11个 DIV 对应于再髓鞘的开始, 14div 对应于完全再髓鞘切片。 - 用2毫升 1X PBS 用切片清洗刀片三次, 时间为10分钟。
- 使用25x 至30x 的放大倍率将切片与双目显微镜下的膜插入物分离, 方法是使用手术刀或刷子轻轻推送切片。或者, 为了避免在将切片从膜上分离时损坏切片的风险, 请使用手术刀将切片固定在一起。
- 使用刷子将浮动切片转移到含有 1x PBS 的4井板的井中。
- 将 PBS 从每口井中吸收, 并在-20°c 的预冷却100% 乙醇中孵育切片15至20分钟。这一步骤促进了髓鞘纤维的抗体渗透。
- 在室温下, 用 1x PBS 短暂地吸走100% 乙醇, 然后在 1x PBS 中短暂清洗一次, 时间为10分钟。
- 在室温下, 用含有 1x PBS、5% NGS、0.3% 非离子洗涤剂的溶液对切片进行吸收, 并孵育30至45分钟的切片, 以阻断非特异性抗体固定位点。
- 吸气阻塞溶液。无需清洗。
- 在4°C 的情况下, 用稀释的原生抗体在阻断溶液中对切片进行隔夜培育。要在小脑有机切片上显示髓鞘, 请使用 MBP (鸡, 半或小鼠 IGg2b, Smy99, 1.5 200) 或 PLP (鼠, 杂交瘤, 1.5 至 1.5) 抗体。
请注意:要在同一切片中显示多个抗原的表达, 请执行双染色或三重染色过程 (例如, 请参见图 1 )。为了同时进行孵化, 确保在不同的物种中产生初级抗体。然后, 使用它们相应的二级抗体与不同的荧光体 (请参阅节点和单口标记18抗体的材料表)。 - 第二天, 在 1 x PBS 中清洗切片 3次, 时间为10分钟。
- 在室温下, 用在封堵液中稀释的二级抗体 (半稀释) 在室温下培养3小时。
请注意:在使用此处描述的抗体以外的抗体时, 可能需要优化抗体稀释和培养时间。 - 在黑暗中, 在 1x PBS 中清洗切片 3次, 10分钟。
- 在双目显微镜下, 将切片安装在玻璃幻灯片上。在幻灯片上放置100μl 的 1x PBS, 然后使用画笔将切片传输到 PBS 中。根据需要展开切片, 并在幻灯片上将其展平。删除任何多余的 PBS。如果免疫标记是在仍连接到膜上的切片下进行的, 则安装在贴膜面朝的切片上, 将滤膜安装在玻璃滑块上。
- 将一滴安装介质直接放在玻璃盖板上, 轻轻覆盖切片。安装的幻灯片可以在4°c 的黑暗中存储几个月。
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Representative Results
从 P9-p10 C57black6 野生型 (Wt) 以及 PLP-GFP 转基因小鼠 (图 2A) 以及 Purkinje 细胞染色中获得的有机小脑切片中具有代表性的髓鞘免疫染色示例.小脑髓鞘从白质轨道区域的切片向周围的叶和髓鞘的 Purkinje 细胞大多是在6至 7 DIV 后实现的。在 7 DIV 中, 通过 LPC 处理 (图 2ci-ii) 可以诱导完全脱髓鞘。脱髓鞘后, 切片在脱髓鞘高峰后6-7 自动再加髓化并完全再磋商 (图 2Ciii)。
图 1: 小脑片生成的示意图.解剖分为三个主要步骤。(a) 小脑被隔离, 脑膜被摘除 (步骤4.10 和 4.10)。(b) 小脑随后被转移到直升机平台并切片 (步骤4.12 至 4.12)。(c) 最后, 切片与片隔离, 放置在膜插入物上。将与切片一起转移的解剖介质取出, 将6孔板放入孵化器 (步骤4.18 和 4.18)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 体外培养的髓鞘小脑膜的例子.图像堆栈 (正交投影) 是使用直立共聚焦显微镜后, 自由浮动免疫标记和平面安装后, 如协议所述。切片在 11DIV (a, plp;b, gfp 在绿色) 和轴突域被组装为在体内观察到与兰维耶的节点丰富的电压门控钠通道 (nav,在红色) 两侧的单点单点轴质交界处域 (里海, 在白色) 在 c57black6 wt (a) 以及 PLP-GFP (b) 转基因小鼠切片。(c) 小脑皮层结构保存在培养的切片中, 如在 plp-gfp 小鼠的小脑切片上观察到的那样。(i) purkinje 细胞轴突 (卡尔宾、钙, 蓝色) 在培养一周后被强烈的髓鞘 (gfp, 绿色)。(二) lpc 处理完全脱髓化切片, 这些切片自发再加髓化, 并在脱髓鞘后6天完全再解髓化 (iii, 14div)。刻度柱 = 20μm (A, B);100μm (C)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们详细介绍了一个方案, 以产生一个与小鼠小脑有机切片培养相对应的体外模型, 该模型改编自先前公布的方法15、16、19和随后的髓鞘这些制剂的免疫染色。该策略提供了在健康和病理状态下使用高分辨率可视化髓鞘成分的可能性。
从10天大的小鼠身上提取的小脑有机切片培养是一个成熟的实验模型, 用于研究髓鞘和再髓鞘过程背后的分子和细胞机制, 因为它可以复制大多数解剖和相应组织在体内的功能特征, 不仅包括保存一个明确的细胞结构, 而且成熟时间线17。此外, 小脑切片在体外两周后有一个保存完好的建筑组织(图 1c).转基因 PLP-GFP 菌株是一种替代菌株, 特别允许在活片上的荧光双目显微镜下观察髓鞘状态, 这对于脱髓鞘-再髓鞘研究特别方便 (图 1 c)).
这些制剂作为一种快速的方法, 以评估髓鞘率的发展与发达的自动化定量, 包括西方印迹分析20, cnpase 分析16或定量的 plpcinp (或 mbp/卡尔宾丁) 染色17,21, 从而代表了一个高通量系统, 允许检测药物在脱髓鞘疾病 22,23。
进行这些实验时的主要关键问题之一可能与小脑切片的质量有关。首先, 小鼠年龄对小脑有机切片培养具有重要意义。Purkinje 细胞是小脑培养中唯一的髓鞘神经元, 如果培养物从 P2 到 P7 啮齿类动物或与 P13 17 以上的捐献者制备, 则其存活率会受到损害。更广泛地说, 很难从成年动物那里获得大脑切片的有机型培养。其次, 解剖过程中的组织处理时间至关重要, 因为每只动物解剖时间超过 1 5-2 0分钟, 导致切片存活率下降。此外, 在选择要培养的切片时, 最好避免使用小脑两端的切片, 因为神经元生存率低, 导致髓鞘纤维稀缺。
其他参数, 如温度和二氧化碳浓度的稳定性, 而在培养过程中是决定因素, 以确保切片健康。最后, 切片的质量受马血清成分的影响, 不能由使用者控制。因此, 强烈建议检测几批血清。
为了获得足够的标签, 组织固定是一个关键的步骤。为了促进抗体的渗透, 以达到髓鞘抗原, 由于髓鞘是一个非常紧凑的结构, 切片使用绝对乙醇治疗后, 建议固定。类似的染色协议可以进一步应用于体内固定组织, 尽管 triton 浓度可能需要适应体内培养的振动体或低温恒温器的厚度。非商业抗体的供应也应考虑在内。因此, 从 PLP-GFP24或 CNP-GFP25等转基因小鼠身上制备切片是一种可视化髓鞘和少突胶质细胞过程的替代方法。
除了本协议中描述的免疫化学方法外, 还经常使用其他方法来研究髓鞘结构。此外, 还采用了以电子显微镜为金标准26的补充技术来研究髓鞘超微结构。还存在其他技术, 如无标签方法, 包括光学相干层析成像27、28、拉曼散射28、29、三谐波产生30或光谱共聚焦反射显微镜31;这些方法还具有能够观察动态细胞过程的另一个优点。然而, 其中一些技术是复杂的, 进一步需要最先进的显微镜设置。由于这些原因, 通过免疫荧光标记的髓鞘研究仍然是一个标准的方法, 以调查髓鞘和缺陷, 在各种发育或后天疾病及其模型, 以及评估未来的治疗潜力治疗。它还可以进一步用于研究多种情况下的髓鞘, 如学习和可塑性, 以及年龄、抑郁或自闭症, 其中髓鞘已知被改变 32.
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Disclosures
作者都没有相互竞争的利益或相互冲突的利益。
Acknowledgments
我们感谢肖恩·弗里曼博士、Nathalie Sol-Foulon 博士和 Thomas Roux 博士对手稿的宝贵评论。这项工作由 INSERT、ICM、ARSEP 赠款 R13123DD、ANR R17127DD (至 a. d.) 和 FRM 研究金、SPF20110421435 (至 a. d.)、FDT201-704332 (至 m. t.) 提供资金。我们感谢 CELIS 细胞培养设施和冰毒。Quant 成像平台。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology. Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).
- Waxman, S. G., Ritchie, J. M. Molecular dissection of the myelinated axon. Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).
- Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485, 517-521 (2012).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487, 443-448 (2012).
- Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity. Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).
- Fields, R. D. A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination. Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).
- Nave, K. -A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
- Nave, K. -A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468, 244-252 (2010).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).
- Meier, C. Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study. Brain Research. 104, 21-32 (1976).
- Hori, S. H. A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS. Stain Technology. 38, 221-225 (1963).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurological Research. 1, 203-209 (1979).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
- Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).
- Rasband, M. N., Peles, E. The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).
- Hussain, R., et al. Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. , 3820-3831 (2011).
- Wioland, L., et al. Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination. Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Medina-Rodríguez, E. M., et al. Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis. Science Reports. 7, (2017).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).
- Yuan, X., et al. Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies. Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).
- Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344, 1252304 (2014).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wang, H., et al. Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging. Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, 1857-1861 (2008).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. The node of Ranvier in CNS pathology. Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).
