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Aspergillus flavus वृद्धि और ट्रांसजेनिक मक्का में Aflatoxin उत्पादन की बाधा α amylase से Lablab-purpureus अवरोधक व्यक्त L

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

यहां हम एक Aspergillus flavus विकास और मक्का एक रोधी प्रोटीन व्यक्त गुठली में aflatoxin उत्पादन का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।  एक GFP-व्यक्त एक. flavus तनाव का उपयोग हम संक्रमण और वास्तविक समय में परिपक्व गुठली में कवक के प्रसार पर नजर रखी । परख तेजी से, विश्वसनीय है, और reproducible ।

Abstract

खाद्य और फ़ीड फसलों में Aflatoxin संदूषण दुनिया भर में एक बड़ी चुनौती है । Aflatoxins, कवक Aspergillus flavus (ए. flavus) द्वारा उत्पादित शक्तिशाली कैंसर है कि काफी हद तक मक्का में फसल मूल्य और अन्य तेल मानव और पशु स्वास्थ्य के लिए गंभीर खतरा खड़ी के अलावा मूंगफली की तरह समृद्ध फसलों को कम कर रहे हैं । पारंपरिक प्रजनन, प्रतिरोध जुड़े प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति सहित विभिंन दृष्टिकोण, और आरएनए हस्तक्षेप (RNAi)-आधारित मेजबान-प्रेरित जीन मुंह बंद करने के महत्वपूर्ण ए flavus जीन लक्ष्य, को बढ़ाने के लिए मूल्यांकन किया जा रहा है अतिसंवेदनशील फसलों में aflatoxin प्रतिरोध । पिछले अध्ययनों में ए. flavus रोगजनन और aflatoxin उत्पादन में α-amylase की एक महत्वपूर्ण भूमिका दर्शाई गई है, इस जीन/एंजाइम का सुझाव है कि दोनों ए. flavus वृद्धि और aflatoxin उत्पादन को कम करने के लिए एक संभावित लक्ष्य है । इस संबंध में, वर्तमान अध्ययन heterologous अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था (के गठन CaMV 35S प्रवर्तक के नियंत्रण में) एक Lablab purpureus एल α-amylase अवरोधक की तरह प्रोटीन (AILP) के खिलाफ मक्का में . flavus. AILP एक ३६-केडीए प्रोटीन है, जो ए. flavus α-amylase एंजाइम का प्रतिस्पर्धी अवरोधक है और लेक्टिन – arcelin – α-amylase अवरोधक आम बीन में प्रोटीन परिवार के अंतर्गत आता है. इन विट्रो अध्ययनों से पहले वर्तमान काम करने के लिए एक. flavus α-amylase गतिविधि और कवक विकास के निषेध में AILP की भूमिका का प्रदर्शन किया था । कवक विकास और परिपक्व गुठली में aflatoxin उत्पादन एक GFP-व्यक्त ए flavus तनाव का उपयोग कर वास्तविक समय में निगरानी की गई । इस कर्नेल स्क्रीनिंग परख (केएसए) स्थापित करने के लिए बहुत आसान है और संक्रमण पर विश्वसनीय और reproducible डेटा प्रदान करता है और प्रसार की हद है कि जर्मप्लाज्म और ट्रांसजेनिक लाइनों के मूल्यांकन के लिए quantified जा सकता है । GFP तनाव से प्रतिदीप्ति कवक विकास को बारीकी से संबंधित है और विस्तार से, यह aflatoxin मूल्यों को अच्छी तरह से संबंधित है ।  वर्तमान कार्य का लक्ष्य aflatoxin प्रतिरोध बढ़ाने के लिए मक्का जैसी व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण फसल में इस पिछले ज्ञान को लागू करना था. हमारे परिणाम एक 35%-AILP में एक. flavus विकास में 72% कमी-एक्सप्रेस ट्रांसजेनिक मक्का गुठली जो, बारी में, एक 62% में अनुवाद-88% aflatoxin के स्तर में कमी दिखाते हैं ।

Introduction

कवक पीढ़ी, Aspergillus, फ़्यूज़ेरियम, Penicillium, और ओल्टेर्नेरिया द्वारा Mycotoxin संदूषण खाद्य और फ़ीड फसलों की एक बड़ी समस्या है वर्ल्डवाइड1,2,3। इन phytopathogenic कवक के बीच, Aspergillus फसल मूल्य और मानव और पशु स्वास्थ्य पर सबसे अधिक प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है । Aspergillus flavus (ए. flavus) एक अवसरवादी संयंत्र रोगज़नक़ कि मक्का, बिनौला और मूंगफली के रूप में तेल समृद्ध फसलों को संक्रमित है और शक्तिशाली यलो, aflatoxins, साथ ही कई विषाक्त माध्यमिक चयापचयों (एसएमएस) का उत्पादन । मक्का एक महत्वपूर्ण खाद्य और फ़ीड फसल दुनिया भर में उगाया जाता है और अत्यधिक flavusद्वारा प्रदूषित करने के लिए अतिसंवेदनशील है । खो देता है और मक्का में कम मूल्य पर aflatoxin संदूषण के आर्थिक प्रभाव के रूप में ज्यादा के रूप में $६८६.६ करोड़ डॉलर/वैश्विक जलवायु में परिवर्तन की भविष्यवाणी के साथ अमेरिका2 में वर्ष हो सकता है, aflatoxins के प्रभाव के साथ मक्का में अधिक से अधिक आर्थिक नुकसान में परिणाम सकता है निकट भविष्य में2के रूप में उच्च के रूप में $१.६८ अरब डॉलर/ मनुष्यों और पशुधन में aflatoxins के प्रतिकूल आर्थिक और स्वास्थ्य संबंधी प्रभावों को देखते हुए मक्का में पूर्व-फसल aflatoxin नियंत्रण खाद्य और फीड उत्पादों में aflatoxin संदूषण को रोकने का सबसे कारगर तरीका हो सकता है ।

पिछले कुछ दशकों में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है कि मक्का में aflatoxin प्रतिरोध के लिए प्रमुख पूर्व फसल नियंत्रण दृष्टिकोण प्रजनन है, जो समय4की एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता है के माध्यम से मुख्य रूप से है । हाल ही में, नियंत्रण बड़े पैमाने पर क्षेत्र अनुप्रयोगों5,6में aflatoxin कमी में कुछ सफलता मिली है । इसके अलावा, अत्याधुनिक आणविक उपकरणों के अनुप्रयोग जैसे ' होस्ट प्रेरित जीन मुंह बंद करने ' (HIGS) के माध्यम से RNAi और प्रतिरोध के ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति-संबंधित प्रोटीन के रूप में कुछ सफलता मिली है एक. flavus वृद्धि और aflatoxin की कमी में छोटे पैमाने पर प्रयोगशाला और क्षेत्र की पढ़ाई में उत्पादन. इन दृष्टिकोण वर्तमान में भविष्य में हेरफेर के लिए नई क्षमता ए flavus जीन लक्ष्यों की पहचान करने के अलावा अनुकूलित किया जा रहा है ।

जीन है कि सीधे mycotoxin उत्पादन में ट्रांसजेनिक नियंत्रण रणनीतियों के संभावित लक्ष्यों के रूप में शामिल कर रहे है के अलावा, कवक amylases प्रारंभिक चरणों के दौरान सफल रोगजनन और mycotoxin उत्पादन बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते दिखाया गया है मेजबान संयंत्र के संक्रमण के । कुछ उदाहरणों में शामिल है Pythium pleroticum (कारण अदरक प्रकंद सड़ांध का एजेंट), फ़्यूज़ेरियम सोलानी (फूलगोभी के कारण एजेंट टूटेगी), जहां pathogenicity और α-amylase अभिव्यक्ति और गतिविधि के बीच सकारात्मक सहसंबंध मनाया गया 7,8. α-amylase गतिविधि या तो जीन नॉकआउट या पछाड़ना दृष्टिकोण के माध्यम से निषेध नकारात्मक कवक विकास और विष उत्पादन को प्रभावित करता है । flavus के एक α-amylase नॉकआउट उत्परिवर्ती aflatoxins जब स्टार्च सब्सट्रेट या रोगाणुओं मक्का गुठली9पर हो उत्पादन करने में असमर्थ था । इसी तरह, फ़्यूज़ेरियम verticillioides में एक α-amylase पीटकर तनाव मक्का गुठली10के संक्रमण के दौरान fumonisin बी1 (mycotoxin) का उत्पादन करने में विफल रहा । एक और अधिक हाल के अध्ययन में, गिल्बर्ट एट अल (२०१८) का प्रदर्शन किया है कि एक RNAi आधारित दस्तक के नीचे एक. flavus α-amylase अभिव्यक्ति HIGS के माध्यम से काफी कम एक. flavus वृद्धि और मक्का कर्नेल संक्रमण के दौरान aflatoxin उत्पादन11 .

α-amylase गतिविधि के विशिष्ट अवरोधकों भी नीचे से प्राप्त के रूप में इसी तरह के परिणाम का उत्पादन किया है α-amylase अभिव्यक्ति के विनियमन । फंगल प्रतिरोध में एक α-amylase अवरोधक की भूमिका पर पहली रिपोर्ट अलगाव और एक 14 के लक्षण वर्णन से आया है-केडीए trypsin-α-amylase अवरोधक मक्का लाइनों से एक. flavus12के लिए प्रतिरोधी । Fakhoury और Woloshuk द्वारा संयंत्र प्रजातियों के कई सैकड़ों के आगे स्क्रीनिंग एक ३६ की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया-केडीए α-amylase अवरोधक की तरह प्रोटीन (AILP) जलकुंभी सेम के बीज से, Lablab purpureus L.13. AILP के पेप्टाइड अनुक्रम लेक्टिन से संबंधित lectins सदृश-arcelin-α-amylase अवरोध करनेवाला परिवार आम बीन14,15में सूचना दी । शुद्ध AILP स्तनधारी trypsin के प्रति किसी भी निरोधात्मक गतिविधि प्रदर्शित नहीं करता है और आगे इन विट्रो लक्षण वर्णन में एक. flavus वृद्धि और conidial अंकुरण13की महत्वपूर्ण बाधा दिखाई । यहां प्रस्तुत रिपोर्टों स्पष्ट रूप से पता चलता है α-amylase नियंत्रण के दृष्टिकोण में एक लक्ष्य के रूप में सेवा कर सकते है रोगजनकों या कीट है कि स्टार्च जुड़ाव पर निर्भर प्रतिबंधित (α-amylase गतिविधि के माध्यम से) और एक ऊर्जा के स्रोत के रूप में घुलनशील शर्करा के अधिग्रहण के दौरान उनके मेजबान संयंत्रों के साथ रोगजनक बातचीत ।

अल्फा-amylase एक. flavus pathogenicity9,10,11में महत्वपूर्ण माना जाता है, और एक शक्तिशाली विरोधी के रूप में AILP के महत्व को देखते हुएएक. flavus एजेंट (α-amylase निषेध/antigrowth)13, हमने CaMV 35S प्रवर्तक के अंतर्गत Lablab AILP जीन व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक मक्का संयंत्रों का सृजन किया । इस लक्ष्य की जांच अगर मक्का में इस α-amylase अवरोधक के heterologous अभिव्यक्ति ए. flavus रोगजनन और aflatoxin उत्पादन के खिलाफ मक्का कर्नेल संक्रमण के दौरान प्रभावी है के लिए किया गया था । हमारे परिणाम प्रदर्शित करता है कि ट्रांसजेनिक मक्का कर्नेल AILP काफी कम एक flavus वृद्धि और कर्नेल संक्रमण के दौरान aflatoxin उत्पादन व्यक्त ।

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Protocol

१. प्लाज्मिड construction and भुट्टा रुपांतरण

  1. पीसीआर बढ़ाना Lablab AILP प्राइमरों का प्रयोग 5 '-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 ' और 5 '-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3 ' । पीसीआर शर्तों 30 एस के लिए ९८ ° c पर एक प्रारंभिक विकार कदम शामिल है (चरण 1), 10 एस के लिए ९८ ° c पर विकार द्वारा पीछा किया (चरण 2), 30 एस के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग (चरण 3), 20 एस के लिए ७२ ° c पर बढ़ाव (चरण 4), चरण 2 से 31 चक्र के चरण 4 , और 5 मिनट के लिए ७२ ° c पर एक अंतिम बढ़ाव कदम एक संशोधित pCAMBIA १,३०० वेक्टर में पीसीआर उत्पाद क्लोन Xbaमैं और पीएसटीमैं प्रतिबंध साइटों का उपयोग कर । अनुक्रम अंतिम संयंत्र गंतव्य वेक्टर सदिश में क्लोन AILP जीन के अभिविंयास और अनुक्रम की पुष्टि करने के लिए ।
  2. रूपांतर एग्रोबेक्टीरियम तनाव EHA101 के साथ अंतिम सदिश का निर्माण (चित्रा 1) के रूप में पहले 16वर्णित है ।
  3. परिवर्तित एग्रोबेक्टीरियम अंतिम संयंत्र गंतव्य वेक्टर युक्त का प्रयोग अपरिपक्व मक्का (Zea mays एल हाय-द्वितीय) भ्रूण को बदलने के लिए (आयोवा राज्य विश्वविद्यालय के संयंत्र परिवर्तन की सुविधा पर प्रदर्शन किया) 16।
  4. ग्रीन ग्रीनहाउस में टी0 संयंत्रों (26-29 डिग्री सेल्सियस; 16/8 एच photoperiod उच्च दबाव ना-लैंप के साथ पूरक) और बार आत्म परागण टी6 पीढ़ी प्राप्त करने के लिए ट्रांसजेनिक विशेषता के लिए homozygosity प्राप्त करने के लिए ।

2. बीजाणु अंकुरण परख

  1. फसल पत्ती के नमूने और स्टोर पर-८० ° c । एक मोर्टार और मूसल तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर के साथ पत्ती के नमूने पीस । 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में ०.५ ग्राम बाहर वजन, 17 µ को छेड़ने अवरोधक के एल जोड़ें, और बर्फ पर जगह ट्यूबों ।
  2. १६,००० एक्स जीमें 10 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक हस्तांतरण २२५ µ एल संयंत्र निकालने के लिए ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और जगह पर बर्फ ।
  3. एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में, Aspergillus flavus ७० के एक 5 मिलीलीटर बीजाणु निलंबन तैयार – GFP में 1% आलू डेक्सट्रोज शोरबा (डब्ल्यू/ भंवर और एक haemocytometer के साथ 105 बीजाणु/एमएल के लिए बीजाणु एकाग्रता समायोजित करें ।
    सावधानी: a. flavus उत्पादन aflatoxins, इस कवक के साथ सभी काम एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित किया जाना चाहिए ।
  4. 28 ° c में PDB में मशीन जब तक संस्कृति बीजाणुओं के उभार के रूप में संकेत के रूप में बीजाणु अंकुरण के ५०% दीक्षा प्राप्त है ।
  5. भंवर और aliquot 25 µ एल बीजाणु समाधान २२५ µ एल संयंत्र निकालने के लिए । आंतरायिक झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए नमूने की मशीन ।
  6. Aliquot 25 µ एक खुर्दबीन स्लाइड पर बीजाणु समाधान के एल और मापने रोगाणु ट्यूबों डिजिटल कैमरा सॉफ्टवेयर का उपयोग बीजाणुओं की लंबाई । प्रत्येक पंक्ति के लिए 20 की एक न्यूनतम माप दोहराने का उपयोग करें ।
    नोट: इस स्तर पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी संस्कृतियों प्लेस कॉलोनी विकास को रोकने के लिए गिनती के लिए तैयार जब तक ।

3. कर्नेल जांच परख (केएसए)

  1. gluing द्वारा केएसए टोपियां निर्माण 4 स्नैप कैप्स (22 मिमी) एक ६० x 15 मिमी पेट्री डिश में । की अनुमति दें गोंद कैप्स का उपयोग करने से पहले ४८ ज के लिए सूखी । प्रत्येक केएसए कैप एक प्रतिनिधि (चित्रा 2) का गठन किया ।
  2. एक बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, स्प्रे एक वर्ग परख ट्रे (24 सेमी x 24 सेमी) ७०% इथेनॉल के साथ: एच2ओ (वी/) और हवा सूखी चलो । ट्रे में बाँझ क्रोमैटोग्राफी पेपर जोड़ें । स्प्रे 9 केएसए कैप्स ७०% इथेनॉल के साथ, हवा सूखी चलो, और जगह में परख ट्रे ।
  3. प्रत्येक ट्रांसजेनिक मक्का लाइन के लिए परीक्षण किया जा रहा है, एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में 20 नुकसान गुठली और जगह का चयन करें । जोड़ें ७०% इथेनॉल और चलो 4 मिनट के लिए बैठो । धीरे नसबंदी के दौरान ट्यूबों शेक । इथेनॉल और कुल्ला गुठली तीन बार बंद बाँझ में डालना एच2ओ ।
  4. Aspergillus flavus ७० के एक बीजाणु सस्पेंशन तैयार – 6 दिन पुरानी संस्कृति v8 मध्यम पर उगाया से GFP17 (5% v8 रस, 2% आगर, पीएच ५.२) ।
    1. 20 मिलीलीटर बाँझ जोड़ें ०.०२% ट्राइटन X-100/एक बाँझ पाश के साथ बीजाणु के बंद और स्क्रैप एच2ओ (वी/ प्लास्टिक बंद इनोक्युलम और जगह एक ३०० मिलीलीटर बाँझ चोंच में ।
    2. ०.०२% ट्राइटन एक्स-१०० के साथ एक 5 गुना कमजोर पड़ने तैयार है, तो एक haemocytometer के साथ एक बीजाणु गिनती प्रदर्शन करते हैं । 4 x 106 बीजाणुओं/एमएल के एक एकाग्रता के साथ १०० मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो तो फिर से पतला ।
  5. एक बाँझ ३०० मिलीलीटर चोंच में गुठली एक बार हलचल के साथ जगह । इनोक्युलम को यूरिन में डालें ।
    चेतावनी: इनोक्युलम के लिए गुठली जोड़ने के लिए छप समाधान का कारण होगा । 3 मिनट के लिए एक हलचल प्लेट पर चोंच रखें । 3 मिनट के बाद, एक खाली चोंच में इनोक्युलम बंद डालो ।
  6. एक संदंश का प्रयोग, परख डिश में जगह गुठली (1 कर्नेल/ प्रत्येक परख ट्रे और 7 दिनों के लिए अंधेरे में 31 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के नीचे करने के लिए 30 मिलीलीटर जल पानी जोड़ें ।
  7. फोटोग्राफी के लिए गुठली तैयार करते हैं.
    1. सूक्ष्म विश्लेषण और फोटोग्राफी के लिए प्रत्येक पंक्ति से अलग सेट 4 गुठली ।
      नोट: गुठली 4 ° c पर अब से 5 दिनों के लिए फोटोग्राफी को पूरा करने से पहले संग्रहीत किया जा सकता है ।
    2. flavus (चित्रा 3) के साथ टीका के सात दिनों के बाद गुठली की तस्वीरें ले लो ।
    3. एक नरम ऊतक और जल के साथ गुठली के साफ बाहरी । गुठली के अनुदैर्ध्य वर्गों प्रदर्शन और तुरंत फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत तस्वीरें ले लो ।
  8. विश्लेषण के लिए गुठली तैयार करें ।
    1. एक नरम ऊतक और पानी के साथ शेष गुठली के स्वच्छ बाहरी ।
    2. 4 गुठली प्लेस, 1 प्रतिनिधि का गठन, एक 15 मिलीलीटर पेंच टोपी पाली कार्बोनेट 2 स्टेनलेस स्टील गेंदों युक्त शीशी में । तुरंत तरल नाइट्रोजन में शीशियों फ्रीज और आगे प्रसंस्करण और विश्लेषण जब तक-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    3. शीशियों से निकालें-८० ° c फ्रीजर और एक homogenizer में १,५०० rpm पर 3 मिनट के लिए गुठली पीस ।
      नोट: गुठली तरल नाइट्रोजन के साथ जमे हुए रखो ।

4. ट्रांसजेनिक मक्का गुठली की पीसीआर स्क्रीनिंग

  1. निर्माता के निर्देश के अनुसार flavus से संक्रमित चूर मक्का गुठली से जीनोमिक डीएनए (gDNA) को अलग करने के लिए डीएनए आइसोलेशन किट का प्रयोग करें । संक्षेप में, जोड़ें २८० µ एल बफर एफ, 20 µ l को छेड़ो, और 3 µ l dithiothreitol (डीटीटी) को 10-15 मिलीग्राम के चूर मक्का गुठली । एक thermomixer (५६ ° c, १,२०० rpm, 30 मिनट) में मशीन और शेक । 1 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक और equilibrated कॉलम को स्पष्ट supernatant हस्तांतरण । 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन और elute gDNA के लिए 1 मिनट के लिए ७०० x g पर केंद्रापसारक ।
  2. एक पीसीआर किट का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए एक 20 µ एल पीसीआर प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए निकाले gDNA के ०.८ µ एल ले लो । निर्माता के प्रोटोकॉल में अनुशंसित के रूप में thermocycling शर्तों का पालन करें । पीसीआर शर्तों 5 मिनट के लिए ९८ डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकार कदम शामिल (चरण 1) के बाद विकार द्वारा ९८ ° c 5 s (चरण 2) के लिए, 5 एस के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग (चरण 3), 20 एस के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाव (चरण 4), चरण 2 के ४० चक्र 4 चरण के लिए , और 1 मिनट के लिए ७२ ° c पर एक अंतिम बढ़ाव कदम (5 कदम) ।
  3. ट्रांसजेनिक मक्का गुठली में Lablab AILP जीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए फॉरवर्ड प्राइमरी 5 '-TATACCACCCCCATCCGTGT-3 ' और रिवर्स प्राइमरी 5 '-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3 ' का प्रयोग करें ।

5. आरएनए अलगाव, सीडीएनए संश्लेषण, और अर्द्ध मात्रात्मक आरटी-पीसीआर

  1. आरएनए निष्कर्षण के लिए-80 डिग्री सेल्सियस पर पहले से संग्रहीत homogenized ए. flavus संक्रमित मक्का गुठली ले लो । एक कुल आरएनए अलगाव किट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार लेकिन मामूली संशोधन18के साथ का उपयोग कर आरएनए निकालें । निष्कर्षण बफर में homogenized मक्का कर्नेल पाउडर के ५० मिलीग्राम जोड़ने के बाद, यह अच्छी तरह से मिश्रण (भंवर के बिना) एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक टिप का उपयोग कर और यह बर्फ पर 5-6 मिनट के लिए आगे बढ़ने से पहले के रूप में निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों के लिए छोड़ दें ।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग कर सीडीएनए तैयार करें 18.
  3. पहले वर्णित18के रूप में अर्द्ध मात्रात्मक आरटी के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया प्रति पतला सीडीएनए के ०.५ µ एल का उपयोग करें । आगे और रिवर्स प्राइमरों का उपयोग करें qAILP-एफ 5 '-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3 ' और qAILP-आर 5 '-CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA-3 ' क्रमशः Lablab AILP जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए, और आगे और रिवर्स प्राइमरों qRib-f 5 पिरणामस्वरूप-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3 पिरणामस्वरूप और qRib-r 5 पिरणामस्वरूप-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3 पिरणामस्वरूप क्रमशः मक्का की अभिव्यक्ति के लिए राइबोसोमल स्ट्रक्चरल जीन (रिब), GRMZM2G02483819 एक घर रखने जीन के रूप में ।

6. GFP quantitation

  1. तैयार ५० मिलीलीटर प्रत्येक को ०.२ मीटर monobasic सोडियम फॉस्फेट (णः2पीओ4) और ०.२ मीटर dibasic सोडियम फॉस्फेट (Na2HPO4· 7H2हे) में
  2. पीएच ७.० Sorenson के फास्फेट बफर के १०० मिलीलीटर बनाओ । त्यात पीएच ७.०, जोड १९.५ मिलि णः2पो4 stock, ३०.५ मिलि NaHPO4· 7H2हे stock, व ५० मिलि क H2हे.
  3. बाहर वजन 25 मिलीग्राम जमीन कर्नेल सामग्री (ताजा वजन, परिवार कल्याण) और एक १.० मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह है । 30 एस के लिए केंद्रापसारक ट्यूब और भंवर के लिए ५०० µ एल फॉस्फेट बफर जोड़ें
  4. १६,००० x gपर 15 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक प्लास्टिक १०० µ एल एक काले ९६ अच्छी तरह से थाली में supernatant । एक fluorometer (उत्तेजना ४८५ एनएम, उत्सर्जन ५२८ एनएम) के साथ नमूनों पढ़ें ।

7. कुल aflatoxin विश्लेषण

  1. नमूना प्रसंस्करण और aflatoxin निष्कर्षण
    1. ६० डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए एक मजबूर हवा ओवन में सूखी कर्नेल के नमूने । नमूनों और एक ग्लास डाट के साथ एक ५० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी में जगह तौलना ।
    2. एक धुएं के हुड में, प्रत्येक कुप्पी के लिए 25 मिलीलीटर methylene क्लोराइड जोड़ें ।
      सावधानी: Methylene क्लोराइड अत्यधिक अस्थिर है और खतरनाक (अड़चन, यलो) माना जाता है । न तो लेटेक्स और न ही nitrile दस्ताने Methylene क्लोराइड के साथ काम करने के लिए सुरक्षित हैं । सुधार कार्बनिक विलायक प्रतिरोधी PolyVinylAlcohol दस्ताने का प्रयोग करें ।
    3. एक कलाई कार्रवाई शेखर पर 30 मिनट के लिए नमूने शेक । 30 मिनट के बाद, धीरे से एक ८० मिलीलीटर चोंच में एक बांसुरी फिल्टर कागज सर्कल के माध्यम से निकालने डालो । एक धुएं के हुड में रात भर यूरिन सूखने दें ।
    4. अगले दिन, धार methylene क्लोराइड (लगभग 5 मिलीलीटर) सूखी यूरिन के अंदर रिम के आसपास, घूमता है, और 2 घूंट गिलास शीशियों में डालना । छोड़ शीशियों रातोंरात एक धुएं डाकू में शुष्क करने के लिए खुला ।
  2. Aflatoxin विश्लेषण
    1. जोड़ ४.० एमएल ८०% मेथनॉल: (v/v) के लिए शीशियों को एच2ओ (वी/
    2. प्रदान किए गए स्तंभ के साथ शुद्ध मेथनॉल समाधान फ़िल्टर करने के लिए एक aflatoxin निष्कर्षण किट का उपयोग करें । एक fluorometer के साथ कुल aflatoxin स्तरों का विश्लेषण, निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।

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Representative Results

ट्रांसजेनिक संयंत्रों की खाद्यान परिवर्तन और आणविक स्क्रीनिंग

मक्का के अपरिपक्व भ्रूण हाय-द्वितीय लाइनों एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens EHA101 तनाव अंतिम संयंत्र गंतव्य वेक्टर purpureus AILP के नियंत्रण के तहत Lablab CaMV 35S जीन व्यक्त युक्त का उपयोग कर बदल रहे थे प्रमोटर. पांच स्वतंत्र रूप से परिवर्तित मक्का लाइनों को बाद की पढ़ाई के लिए T6 पीढ़ी के लिए उंनत किया गया । ट्रांसजेनिक मक्का पौधों बहुत छोटे थे और कम जोरदार लेकिन isogenic नकारात्मक नियंत्रण संयंत्रों की तुलना में किसी भी अन्य विषमता नहीं दिखा था. इस लक्ष्य AILP जीन के पीसीआर प्रवर्धन एक ५४८ बीपी amplicon, केवल ट्रांसजेनिक मक्का लाइनों में मनाया के रूप में नियंत्रण संयंत्रों की तुलना में दिखाया (चित्र 4a) । AILP जीन ट्रांसजेनिक लाइनों में अभिव्यक्ति दिखाया जबकि नियंत्रण संयंत्रों (चित्रा 4B) में कोई AILP अभिव्यक्ति मनाया गया ।

Aspergillus flavus पत्तियों के अर्क के साथ बीजाणु परख

युवा ट्रांसजेनिक मक्का संयंत्रों से कच्चे पत्ती निष्कर्षों तरल एन में पीस और १६,००० x gपर केंद्रापसारक द्वारा तैयार किया गया । आरंभिक चरण में बीजाणु 20 घंटे तक पत्ती निकालने के लिए सामने आ रहे थे और 20 नमूनों से बीजाणु hyphal लंबाई दर्ज की गई थी । ट्रांसजेनिक पत्ती के अर्क से उजागर बीजाणुओं से Hyphal लंबाई में 58% की कमी आई – 80% नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में (चित्रा 5)

Aspergillus flavus कर्नेल संक्रमण के दौरान विकास

एक कर्नेल स्क्रीनिंग परख (केएसए) ट्रांसजेनिक और नियंत्रण गुठली में ए flavus के विकास की जांच करने के लिए किया गया था । ट्रांसजेनिक गुठली में AILP जीन की अभिव्यक्ति नकारात्मक एक. flavus वृद्धि प्रभावित । a. flavus वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया तनाव एक GFP रिपोर्टर जो वास्तविक समय में कवक विकास की निगरानी और ठहराव सक्षम बनाता है शामिल हैं । GFP प्रतिदीप्ति में उल्लेखनीय कमी isogenic नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 6) की तुलना में ट्रांसजेनिक AILP गुठली में मनाया गया. AILP लाइंस 4 और 5 कवक विकास में एक महत्वपूर्ण कमी, ६९% और ७२%, क्रमशः, जहां एक 35%-60% कटौती नियंत्रण गुठली (चित्रा 7A) की तुलना में मनाया गया अंय लाइनों के बाद दिखाया ।

संक्रमित गुठली में Aflatoxin उत्पादन

मक्का में AILP जीन की Heterologous अभिव्यक्ति पर नियंत्रण बनाम ट्रांसजेनिक लाइनों में aflatoxin सामग्री की उल्लेखनीय कमी हुई. यहाँ उपलब्ध कराए गए aflatoxin डेटा में संक्रमित गुठली का पाया गया कुल aflatoxin सामग्री है. एक 62% – 88% aflatoxin सामग्री में कमी AILP गुठली में मनाया गया के रूप में नियंत्रण की तुलना में (चित्रा 7B). 5 अलग AILP लाइनों के अलावा, लाइन 4 सबसे कम aflatoxin सामग्री (४८६ एनजी/जी dw), दूसरे के बीच में 640-1498 एनजी/जी dw बनाम नियंत्रण (३,९८६ एनजी/जी dw) के बीच लेकर लाइनों के बाद दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1: मक्का में Lablab AILP जीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के लिए वेक्टर डिजाइन। 35S = फूलगोभी मोज़ेक वायरस या CaMV गठित प्रवर्तक; आरबी = सही सीमा; LB = बायां बॉर्डर; nptII = निओमायसिन phosphotransferase-कनमीसिन प्रतिरोध जीन; नग व 35s = प्रतिलेखना टर्मिनेटर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: कर्नेल जांच परख । (A, B) गुठली निष्फल और एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एक बाँझ चोंच में डाल दिया । (सी – ई) Inoculate गुठली के साथ एक. flavus बीजाणु निलंबन । (एफ – एच) एक बाँझ संदंश का उपयोग करना, परख पकवान में जगह गुठली. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अ. flavus वृद्धि की हल्की माइक्रोग्राफ . (क) Isogenic नकारात्मक नियंत्रण । (बी – एफ) ट्रांसजेनिक गुठली एक्सप्रेस AILP (लाइनों 1-5) एक सप्ताह के बाद टीका । स्केल बार = 1 सेमी. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. ट्रांसजेनिक संयंत्रों की आणविक स्क्रीनिंग । (क) Lablab AILP युक्त ट्रांसजेनिक खाद्यान संयंत्रों (गलियाँ 1-5) की पीसीआर पुष्टि (५४८ बीपी नैदानिक डीएनए अंश; C = isogenic नकारात्मक नियंत्रण; नेब 2-प्रवेश डीएनए एक डीएनए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया सीढ़ी) । (ख) आरटी-पीसीआर का उपयोग करते हुए ट्रांसजेनिक मक्का लाइनों (गलियाँ 1-5) में Lablab AILP जीन की अभिव्यक्ति. लेन सी isogenic नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है । मक्का राइबोसोमल संरचनात्मक जीन (रिब), GRMZM2G02483819 एक घर रखने जीन (नेब 2-प्रवेश डीएनए सीढ़ी: डीएनए मार्कर) के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. एक isogenic नकारात्मक नियंत्रण (नेग) के साथ तुलना के रूप में एक. flavus बीजाणु अंकुरण पर ट्रांसजेनिक AILP मक्का संयंत्रों से कच्चे पत्ते के अर्क का प्रभाव । मतलब जुदाई ANOVA के बाद Dunnett के posttest द्वारा किया गया था । महत्वपूर्ण कमी के स्तर तारों से चिह्नित कर रहे हैं (* * * *P ≤ ०.०००१). त्रुटि पट्टियां बीस नमूनों के लिए मानक त्रुटि का संकेत देती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. GFP प्रतिदीप्ति flavus तनाव ७०-GFP से निर्गत ट्रांसजेनिक गुठली के एक सप्ताह के बाद AILP एक्सप्रेस में परख । Isogenic नकारात्मक नियंत्रण (A) कवक संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए और ट्रांसजेनिक गुठली में फैले (बी एफ ट्रांसजेनिक लाइनों 1-5 का प्रतिनिधित्व) का उपयोग किया गया । फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक लाइन के लिए कम से कम चार गुठली की जांच की गई । स्केल बार = 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एक flavus विकास आणि aflatoxin उत्पादन. (क) a. flavus ७०-GFP संक्रमण और मक्का गुठली में वृद्धि एक कर्नेल स्क्रीनिंग परख में 7 दिनों के बाद । चार जैविक के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत हर बार प्रतिकृति । GFP ठहराव (रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों में, RFU) ट्रांसजेनिक मक्का AILP एक्सप्रेस में कवक वृद्धि एक isogenic नकारात्मक नियंत्रण को इंगित करता है । मतलब जुदाई ANOVA के बाद Dunnett के posttest द्वारा किया गया था । महत्वपूर्ण कमी का स्तर तारक (*p ≤ ०.०५; * *p ≤ ०.०१; * * *p ≤ ०.००१) द्वारा चिह्नित है । त्रुटि पट्टियां चार यादृच्छिक जैविक प्रतिकृति के लिए साधन की मानक त्रुटि इंगित करता है । (ख) flavus ७०-GFP द्वारा मक्का गुठली में Aflatoxin उत्पादन में ७ दिनों के बाद गिरी हुई स्क्रीनिंग परख की गई. 12 जैविक प्रतिकृति और प्रत्येक दोहराने के औसत चार गुठली समाहित । ट्रांसजेनिक AILP गुठली (लाइनों 1-5) में Aflatoxin स्तर एक isogenic नकारात्मक नियंत्रण (नेग) के साथ तुलना के रूप में. मतलब जुदाई ANOVA के बाद Dunnett के posttest द्वारा किया गया था । महत्वपूर्ण कमी के स्तर तारों से चिह्नित है (* *p ≤ ०.०१; * * *p ≤ ०.००१) । त्रुटि पट्टियां चार यादृच्छिक जैविक प्रतिकृति के लिए साधन की मानक त्रुटि इंगित करता है । फंगल निषेध के कारण पूर्वाग्रह से रहित पैनल बी में डेटा देखने के लिए पूरक आंकड़े देखें । GFP के बीच घनिष्ठ सहसंबंध = RFU और aflatoxin मान भी प्रदान किए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Sup Figure 1
पूरक चित्रा 1: चित्रा 7B से डेटा aflatoxin उत्पादन दिखाने के लिए फिर से तैयार एक flavus ७०-GFP मक्का गुठली में एक कर्नेल स्क्रीनिंग परख में 7 दिनों के बाद कवक विकास निषेध के कारण पूर्वाग्रह को खत्म करने के लिए । Aflatoxin मान कवक विकास अवरोध द्वारा विभाजित किया गया था GFP-RFU मान चित्रा 7Bमें के रूप में प्रतिनिधित्व किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Sup Figure 2
पूरक चित्रा 2: GFP-RFU मूल्यों के बीच घनिष्ठ संबंध (= कवक विकास) और aflatoxin स्तर (आर2 = ०.८६) केएसए में सूचना दी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

रोगजनकों और कीटों के कारण कृषि फसलों में उपज घाटा एक वैश्विक समस्या है। वर्तमान में, सिंथेटिक कवक और कीटनाशकों के आवेदन संयंत्र रोगजनकों और कीट को नियंत्रित करने के लिए प्रमुख साधन है, लेकिन भोजन और फ़ीड में इन जैव रासायनिकों के अवशिष्ट विषाक्तता मानव और पशु स्वास्थ्य21के लिए गंभीर खतरा पैदा कर सकते हैं । एक खाद्य और फ़ीड फसल के रूप में मक्का के आर्थिक महत्व को ध्यान में रखते हुए, में कमी या aflatoxin संदूषण के उंमूलन अत्यंत महत्व का है2,3,22। अतिसंवेदनशील किस्मों में प्रतिरोधी जीन introgression के माध्यम से पारंपरिक प्रजनन एक समय लेने वाली प्रक्रिया है और इस तरह के प्रतिरोध aflatoxin प्रतिरोध के रूप में हमेशा स्थिर नहीं है एक polygenic विशेषता और भाग लेने के जीन की अभिव्यक्ति है काफी बदलती पर्यावरण के मापदंडों में परिवर्तन के साथ4. वैकल्पिक दृष्टिकोण को बढ़ाने और एक ecofriendly तरीके से एक. flavus के खिलाफ मेजबान संयंत्र रक्षा स्थिर मूल्यांकन किया जा रहा है ।

वर्तमान अध्ययन में, हम flavusके खिलाफ मक्का में जलकुंभी सेम से AILP जीन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए चुना है । के रूप में AILP α के एक प्रतियोगी अवरोधक-amylase है और यह भी रोधी गुण के पास, हम एक मजबूत गठन प्रमोटर CaMV 35Sके तहत इस जीन व्यक्त की । लक्ष्य यह था कि मक्का में इस heterologous प्रोटीन का उत्पादन चाहे विकासात्मक अवस्था या ऊतक के प्रकार से बढ़ जाए. α की महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति-ट्रांसजेनिक मक्का लाइनों में amylase जीन (4a आंकड़ा, ख) एक heterologous प्रणाली में इस जीन की स्थिर अभिव्यक्ति का समर्थन करता है । यह नकारात्मक GFP प्रतिदीप्ति के स्थानिक वितरण में कमी से स्पष्ट रूप में कवक विकास प्रभावित के अंदर संक्रमित AILP गुठली और गुठली में समग्र GFP प्रतिदीप्ति में कमी (चित्रा 6 और चित्रा 7A).

कर्नेल स्क्रीनिंग परख (केएसए) के विकास के एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर एक flavus रिपोर्टर तनाव जेलिफ़िश Aequorea विक्टोरिया18से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एंकोडिंग जीन व्यक्त का इस्तेमाल, 23. किसी भी रोगज़नक़ के लिए नियंत्रण रणनीति ईजाद करने के लिए, यह मेजबान संयंत्र या ऊतक के भीतर संक्रमण, प्रसार और औपनिवेशीकरण के मोड को समझने के लिए आवश्यक है । aflatoxigenic saprophyte, ए. flavus के औपनिवेशीकरण और प्रसार अच्छी तरह से नहीं समझा जाता है क्योंकि रोगज़नक़ के प्रतिरोध के आनुवंशिक विनियमन, अगर एक मौजूद है, अच्छी तरह से समझ में नहीं है । GFP-व्यक्त ए. flavus तनाव का उपयोग यह संभव वास्तविक समय में संक्रमण की प्रक्रिया और औपनिवेशीकरण ट्रैक करने के लिए बनाता है । GFP तनाव और वंय-प्रकार काफी रोगजनक बुद्धिमता और aflatoxin उत्पादन में अलग नहीं था23। हालांकि, इस विशेष तनाव में GFP जीन constitutively के नियंत्रण के तहत रखा glyceraldehyde फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (gpdएक) जीन प्रवर्तक 24 जो कवक विकास पर नज़र रखने के लिए अधिक उपयुक्त है । हालांकि, बिनौला और मक्का गुठली पर इस दाग का उपयोग कर, हम कवक से कवक विकास और aflatoxin स्तर18,23के लिए GFP प्रतिदीप्ति के बीच एक घनिष्ठ संबंध दिखाया गया है ।

aflatoxin उत्पादन क्षमता के साथ एक करीबी संबंध स्थापित करने के लिए, gfp जैसे omtएक या ver-125,26 gpda से अधिक उपयुक्त हो जाएगा के रूप में aflatoxin जीन प्रवर्तकों द्वारा संचालित । GFP प्रतिदीप्ति काफी संवेदनशील को पता लगाने और फंगल विकास में भी छोटे परिवर्तन की वास्तविक समय में माप के लिए अनुमति है, दोनों विट्रो में और planta में, और अज्ञात रोधी प्रोटीन और पेप्टाइड्स की निरोधात्मक गतिविधियों का मूल्यांकन जैसे AILP व अन्य11,17,18,23। इसके अलावा, केएसए से परिणाम aflatoxin संदूषण27के लिए मूल्यांकन करने के लिए संबंध के साथ प्रतिरोधी या अतिसंवेदनशील मक्का लाइनों के क्षेत्र के प्रदर्शन के साथ अच्छी तरह से संबद्ध ।

केएसए हमारी प्रयोगशाला में बहुत उपयोगी है क्लासिक-नई किस्मों4 और ट्रांसजेनिक लाइनों11,18नस्ल । यह स्थापित करने के लिए आसान है और किसी भी प्रयोगशाला में केएसए प्रदर्शन । एक को नुकसान साफ गुठली का उपयोग करने के लिए इस परख ताकि मेजबान संयंत्र कवक संपर्क का एक स्पष्ट समझ का मूल्यांकन किया जा सकता है प्रदर्शन की जरूरत है । हम नियमित रूप से सभी गुठली है कि हम एक stereomicroscope के तहत हमारी प्रयोगशाला में उपयोग परख के संचालन से पहले स्कैन । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि शर्तों है कि हम केएसए के लिए रोजगार उच्च आर्द्रता (९५% आरएच) और लगातार तापमान (31 डिग्री सेल्सियस) शामिल हैं । इन शर्तों के तहत नकली अंकुरण की प्रक्रिया की शुरुआत के साथ, परख बीज कोट की अखंडता का परीक्षण करने के लिए आदर्श शर्तों प्रदान करता है, गुठली के आनुवंशिक श्रृंगार रोधी जीन सहित/प्रोटीन अंकुरण के दौरान चालू, और/ संक्रमण. कवक संक्रमण और aflatoxin उत्पादन हमेशा क्षेत्र में उनकी घटना की तुलना में केएसए में अधिक हो जाएगा; हालांकि, एक करीबी संबंध स्थापित किया गया है4,27।

हम इस केएसए में प्रदर्शन किया है कि AILP मक्का गुठली में कवक विकास कम कर देता है । AILP संयंत्र lectins के रोधी गुण के पास, और α-amylase को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, स्टार्च टूटने कम करने और कवक विकास सीमित. इन विट्रो अध्ययनों में प्रदर्शन किया कि AILP चीनी अमीर आलू डेक्सट्रोज शोरबा (PDB) कृत्रिम विकास माध्यम में एक. flavus विकास को बाधित करने में सक्षम था, अपनी रोधी/विकास अवरोध गतिविधि का संकेत अपनी amylase निषेध से स्वतंत्र था गतिविधि13. अंय संयंत्र lectins Urtica dioica (आम बिछुआ), Hevea brasiliensis (रबर ट्री), और मकोय tuberosum (आलू) कंद से अलग भी समान रोधी गुण और Botrytis cinerea के बाधित विकास दिखा , Pyrenophora tritici, व फ़्यूज़ेरियम oxysporum२८,२९,३०,३१. अल्फा amylase अवरोधक केवल कवक और बैक्टीरिया के खिलाफ प्रभावी नहीं हैं, लेकिन यह भी कीट कीट३२के खिलाफ प्रभावी होना दिखाया गया है । अल्फा amylases सामांय वृद्धि और संयंत्र के विकास-कीड़ों को खिलाने के लिए महत्वपूर्ण होने की सूचना है, और कई कीट α-amylase अवरोधकों पौधों से गेहूं, आम बीन के रूप में अलग किया गया है, और मक्का12,३३, ३४,३५. कच्चे पत्ते के अर्क (चित्रा 5), AILP-एक्सप्रेस मक्का गुठली में कवक की वृद्धि में कमी के रूप में उजागर बीजाणुओं से फफूंद hyphal लंबाई में उल्लेखनीय कमी GFP प्रतिदीप्ति की कमी के द्वारा प्रदर्शित दोनों गुणात्मक ( चित्रा 6) और मात्रात्मक (चित्रा 7A) संभवतः अपने α-amylase अवरोध और रोधी गुणों का एक संयोजन के कारण है । भविष्य में अन्य रोगजनकों और कीटों के खिलाफ इन AILP-एक्सप्रेस मक्का संयंत्रों का उपयोग करते हुए प्रयोगों के बीज और वनस्पति ऊतकों के विविध बायोटिक तनाव के खिलाफ इसकी प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए बहुत रुचि होगी । लेक्टिन के रोधी और विकास अवरोध गुणों को मुख्य रूप से काइटिन और hyphal टिप विस्तार28के निषेध के साथ अपने पार जोड़ने के लिए जिंमेदार ठहराया गया है । वास्तव में, इन विट्रो में AILP-α की मध्यस्थता निषेध-विविध कवक और बैक्टीरियल मूल से amylases एक. flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium विक्टोरिया, और ४१ सहित कवक रोगजनकों में ६५% से अधिक निषेध दिखाया जीवाणु रोगज़नक़ में% बाधा बैसिलस सबटिलिस13. ए. flavus वृद्धि की कमी पर परिणाम यहां प्रस्तुत α-रोधी एजेंटों के रूप में amylase अवरोधकों की भूमिका के साथ कतार में हैं । वर्तमान अध्ययन आगे इन विट्रो अध्ययन में पहले से प्राप्त ऐसी उपयोगी जानकारी के व्यावहारिक अनुप्रयोग को दर्शाता है ।

AILP-एक्सप्रेस मक्का लाइनों में aflatoxin सामग्री (चित्रा 7B) में कमी संभवतः एक. flavus α-amylase गतिविधि के निषेध के कारण है, संग्रहीत स्टार्च की कम टूटने के लिए अग्रणी है, और एक के रूप में शर्करा की कमी अधिग्रहण रोगजनक संपर्क के दौरान मक्का गुठली से ऊर्जा स्रोत । के रूप में कवक α-amylase नीचे कर्नेल स्टार्च तोड़ने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, कवक α में किसी भी परिवर्तन-AILP द्वारा amylase गतिविधि की संभावना कर्नेल संक्रमण के दौरान घुलनशील चीनी सामग्री बदल । घुलनशील शर्करा की सामग्री, विशेष रूप से सुक्रोज और ग्लूकोज, अत्यधिक AFB के उत्पादन में वृद्धि के साथ संबंधित किया गया है1 और कुल aflatoxins मक्का और अन्य ए flavus अतिसंवेदनशील फसलों जैसे मूंगफली३६,३७. कृत्रिम विकास मीडिया में सुक्रोज सामग्री बढ़ाने से एक. flavus aflatoxin उत्पादन३८बढ़ जाती है । ऐसे ग्लूकोज और माल्टोज़ के रूप में अंय घुलनशील शर्करा भी सकारात्मक दोनों कृत्रिम मीडिया और बीज सब्सट्रेट्स३८में aflatoxin उत्पादन में योगदान । α-amylase गतिविधि और अन्य कवक में mycotoxin उत्पादन में कमी की बाधा कर्नेल संक्रमण के दौरान विष उत्पादन में फफूंद α-amylases की एक महत्वपूर्ण भूमिका पुष्ट । अल्फा-amylase दोनों एफ verticillioides और ए flavus के नॉकआउट म्यूटेंट fumonisin बी1 और aflatoxins क्रमशः मक्का गुठली9,10के संक्रमण के बाद उत्पादन करने में विफल रहा है । इसी प्रकार, flavus α के नीचे-विनियमन-amylase काफी कम कवक विकास और aflatoxin उत्पादन के दौरान मक्का कर्नेल संक्रमण11. ट्रांसजेनिक लाइनों में aflatoxin में 62%-८८% की कटौती aflatoxin उत्पादन में α-amylase की भूमिका पर पहले की रिपोर्ट के अनुसार होती है । यह ध्यान दिया जाना है कि इन विट्रो में कर्नेल स्क्रीनिंग परख (केएसए) और अधिक कड़े से सामांय प्राकृतिक परिस्थितियों में पाया गया है । शर्तों में इन विट्रो परख के दौरान भी अत्यधिक aflatoxin उत्पादन के लिए अनुकूल है, तो प्रतिशत परिवर्तन ट्रांसजेनिक लाइनों में aflatoxin सामग्री में अधिक सार्थक हो सकता है बजाय निरपेक्ष संख्या में aflatoxin सामग्री की संक्रमित गुठली । यहां प्रस्तुत परिणामों के आशाजनक और भविष्य के प्रयोगों के तहत क्षेत्र की स्थितियों में एक प्राकृतिक परिदृश्य के तहत aflatoxin प्रतिरोध के लिए इन AILP-एक्सप्रेस मक्का लाइनों की क्षमता की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

हम डेविड Meints, Arkansas विश्वविद्यालय के विकास और प्रारंभिक पीढ़ियों के दौरान ट्रांसजेनिक मक्का का विश्लेषण करने में उनकी सहायता के लिए धंयवाद । यह काम USDA-ARS CRIS परियोजना 6054-42000-025-00D के वित्तीय सहायता प्राप्त की । इस लेख में व्यापार के नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख केवल विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य के लिए है और अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा सिफारिश या समर्थन मतलब नहीं है । USDA-' ARS समान रोजगार के अवसर (EEO) नीति जनादेश सभी व्यक्तियों के लिए समान अवसर और एजेंसी के कर्मियों की नीतियों, प्रथाओं के सभी पहलुओं में भेदभाव पर प्रतिबंध लगाता है, और संचालन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

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पर्यावरण विज्ञान अंक १४४ α-amylase अवरोधक aflatoxin Aspergillus flavus मकई कर्नेल स्क्रीनिंग परख Lablab purpureus मक्का ट्रांसजेनिक
<em>Aspergillus flavus</em> वृद्धि और ट्रांसजेनिक मक्का में Aflatoxin उत्पादन की बाधा α amylase से Lablab-purpureus अवरोधक व्यक्त L <em></em>
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Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

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