Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Hämning av Aspergillus flavus tillväxt och Aflatoxin produktion i transgena majs uttrycker α-amylas-hämmaren från Kristina purpureus L.

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att analysera Aspergillus flavus tillväxt och aflatoxin produktion i majs kärnorna uttrycker en svampdödande protein.  Använda en GFP-uttryckande A. flavus stam övervakade vi infektion och spridning av svampen i mogna kärnor i realtid. Analysen är snabba, tillförlitliga och reproducerbara.

Abstract

Aflatoxinkontaminering av livsmedels- och fodergrödor är en stor utmaning i hela världen. Aflatoxiner, producerad av svampen Aspergillus flavus (A. flavus) är potenta carcinogener som väsentligen minska gröda värdet i majs och andra olja rik grödor som jordnötter förutom utgör allvarliga hot mot människors och djurs hälsa. Olika metoder, inklusive traditionell avel, transgena uttryck för motstånd associerade proteiner och RNA-interferens (RNAi)-baserade värd-inducerad nedtystning av kritiska A. flavus gen mål, utvärderas för att öka aflatoxin motstånd i mottagliga grödor. Tidigare studier har visat en viktig roll av α-amylas i A. flavus patogenes och aflatoxin produktion, vilket tyder på denna gen/enzym är ett potentiellt mål att minska både A. flavus tillväxt och aflatoxin produktion. I detta avseende genomfördes den aktuella studien för att utvärdera heterologa uttryck (under kontroll av promotorn 35S konstituerande CaMV) av en Kristina purpureus L. α-amylas hämmare-liknande protein (AILP) i majs mot A. flavus. AILP är ett 36-kDa-protein, som är en kompetitiv hämmare av A. flavus α-amylas enzym och tillhör familjen lektin – arcelin – α-amylas-hämmare protein gemensamt bean. In vitro studier innan den nuvarande arbetet hade visat AILP roll i hämning av A. flavus α-amylas aktivitet och svamptillväxt. Svamptillväxt och aflatoxin produktion i mogna kärnor övervakades i realtid med hjälp av en GFP-uttryckande A. flavus stam. Denna kärna screening test (KSA) är mycket enkel att ställa in och ger tillförlitliga och reproducerbara data på infektion och omfattningen av spridningen som kunde kvantifieras för utvärdering av arvsmassa och transgena linjerna. Fluorescensen från GFP stammen är nära korrelerad till svamp tillväxt och, i förlängningen, det är väl korrelerade till aflatoxin värden.  Målet för det aktuella arbetet var att genomföra denna tidigare kunskap i en kommersiellt viktig gröda som majs att öka aflatoxin motstånd. Våra resultat visar en minskning på 35% – 72% i A. flavus tillväxt i AILP-uttryckande transgena majs kärnorna som, i sin tur översätts till en minskning med 62% – 88 procent av aflatoxin nivåer.

Introduction

Mykotoxiner av svamp släktena, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumoch Alternaria är ett stort problem av livsmedel och foder grödor som odlas i världen1,2,3. Bland dessa fytotoxiska svampar har Aspergillus den högsta negativa inverkan på gröda värde och människors och djurs hälsa. Aspergillus flavus (A. flavus) är en opportunistisk växt patogen som infekterar olja rik grödor som majs, bomullsfrö och jordnötter och producerar de potenta carcinogena, aflatoxiner, samt ett flertal giftiga sekundära metaboliter (SMs). Majs är en viktig föda och foder gröda som odlas över hela världen och är mycket mottagliga för kontaminering av A. flavus. De ekonomiska effekterna av aflatoxinföroreningar på förlorar och reducerade värdet i majs kan vara så mycket som $686.6 miljoner per år i USA2 med förväntade förändringar i globala klimatet, effekterna av aflatoxiner kan resultera i större ekonomiska förluster i majs med uppskattningar så högt som $1,68 miljarder per år i den nära framtida2. Med tanke på de negativa ekonomiska och hälsa effekterna av aflatoxiner i människor och boskap, kan före skörd aflatoxin kontroll i majs vara det mest effektiva sättet att hindra aflatoxinkontaminering av livsmedel och foderprodukter.

Den stora före skörd kontrollstrategi för aflatoxin motstånd i majs som har använts i stor utsträckning under de senaste decennierna är primärt genom avel, vilket kräver en betydande mängd tid4. Nyligen, Agrilus har haft viss framgång i aflatoxin minskning i stor skala fältet program5,6. Förutom Agrilus, har tillämpningen av banbrytande molekylära verktyg såsom 'Host inducerad nedtystning' (HIGS) via RNAi och transgena uttrycket av resistensassocierade proteiner haft viss framgång i minskning av A. flavus tillväxt och aflatoxin produktion i liten skala laboratorie- och fältstudier. Dessa metoder är för närvarande som optimeras förutom att identifiera nya potentiella A. flavus gen mål för framtida manipulation.

Förutom gener som är direkt involverade i mykotoxin produktion som potentiella mål av transgena kontrollstrategier, har svamp amylaser visat sig spela en avgörande roll i att upprätthålla framgångsrika patogenes och mykotoxin produktion under tidiga stadier av värd växten infektion. Några få exempel inkluderar Pythium pleroticum (kausal agent ingefära rhizom röta), Fusarium solani (kausal agent blomkål vissnesjuka), där positiva korrelationer mellan patogenicitet och α-amylas uttryck och aktivitet observerades 7,8. Hämning av α-amylas aktivitet antingen genom gen knockout eller knockdown förhållningssätt påverkar negativt svamp tillväxt och toxin produktion. En α-amylas knockout mutant av A. flavus kunde inte producera aflatoxiner när den odlas på stärkelse substrat eller degermed majs kärnorna9. Likaså i Fusarium verticillioides en α-amylas knockout stam kunde inte producera fumonisin B1 (mykotoxin) under infektion av majs kärnorna10. I en senare studie visat Gilbert et al. (2018) att en RNAi-baserade knock-down av A. flavus α-amylas uttryck genom HIGS avsevärt mindre A. flavus tillväxt och aflatoxin produktion under majs kernel infektion11 .

Hämmare av α-amylas aktivitet har också producerat liknande resultat som erhålls från down-förordning av α-amylas uttryck. Den första rapporten om rollen av en α-amylas hämmare svamp motstånd kom från isolering och karakterisering av en 14-kDa trypsin-α-amylas hämmare från majslinjer resistenta mot A. flavus12. Ytterligare screening av flera hundratals växtarter av Fakhoury och Woloshuk ledde till identifiering av ett 36-kDa α-amylas hämmare-liknande protein (AILP) från frön av hyacint bönor, Kristina purpureus L.13. Peptid sekvens av AILP liknade lektiner tillhör familjen lektin – arcelin – α-amylas-hämmare rapporterade gemensamt bean14,15. Renade AILP uppvisar inte någon hämmande aktivitet mot däggdjur trypsin och ytterligare in vitro-karakterisering visade signifikant hämning av A. flavus tillväxt och conidial grobarhet13. De rapporter som presenterades här tydligt visar α-amylas kan fungera som ett mål i kontroll metoder att begränsa patogener eller skadedjur som beror på stärkelse mobilisering (genom α-amylas aktivitet) och förvärvet av lösliga sockerarter som energikälla under deras patogena interaktion med värdväxter.

Alpha-amylas är kända för att vara kritisk i A. flavus patogenicitet9,10,11, och med tanke på betydelsen av AILP som en potent anti-A. flavus agent (α-amylas hämning/antigrowth)13, Vi genererat transgena majs växter uttrycker Kristina AILP gen under den konstituerande CaMV 35S-promotorn. Målet var att undersöka om heterologa uttryck för denna α-amylas hämmare i majs är effektivt mot A. flavus patogenes och aflatoxin produktion under majs kernel infektion. Våra resultat visar att transgena majs kärnorna uttrycker AILP avsevärt minskat A. flavus tillväxt och aflatoxin produktion under kernel-infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plasmid konstruktioner och majs omvandling

  1. PCR förstärka Kristina AILP infoga använder primers 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'och 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. PCR-villkoren omfattar ett inledande denaturering steg vid 98 ° C i 30 s (steg 1), följt av denaturering i 98 ° C under 10 s (steg 2), glödgning vid 55 ° C i 30 s (steg 3), töjning vid 72 ° C för 20 s (steg 4), 31 cykler av steg 2 till 4 , och en slutlig töjning steg vid 72 ° C i 5 min. klon PCR-produkten till en modifierad pCAMBIA 1.300 vektor använder XbaI och Pstjag begränsning platser. Sekvens slutliga växt destination vektorn bekräfta orientering och sekvensen av klonade AILP -gen i vektorn.
  2. Omvandla Agrobacterium stam EHA101 med den final vektorgrafik konstruktion (figur 1) som tidigare beskrivs 16.
  3. Användning omvandlas Agrobacterium som innehåller den slutliga växt destination vektorn att omvandla omogen majs (Zea mays L. Hi-II) embryon (utförs vid anläggningen Transformation anläggning av Iowa State University) 16.
  4. Odla T0 växter i växthuset (26 – 29 ° C, 16/8 h fotoperiod kompletteras med högtryck Na-lampor) och upprepade gånger styvhala för att erhålla T6 generation för att uppnå homozygosity för den transgena drag.

2. spore grobarhet assay

  1. Skörda blad prover och lagra vid-80 ° C. Slipa blad prover med en mortel och stöt med hjälp av flytande kväve. Väg upp 0,5 g i 2 mL mikrocentrifugrör, tillsätt 17 µL av proteashämmare och placera rören på is.
  2. Centrifugera rören i 10 min vid 16 000 x g. Över 225 µL av växtextrakt 0,5 mL mikrocentrifug rör och placera på isen.
  3. I en 15 mL centrifugrör, förbereda en 5 mL sporsuspensionen av Aspergillus flavus 70 – god Jordbrukarsed i 1% potatis dextros buljong (w/v). Vortex och justera spor koncentrationen 105 sporer/ml med en haemocytometer.
    FÖRSIKTIGHET: A. flavus producerar aflatoxiner, allt arbete med denna svamp bör ske i biologiska säkerhetsdragskåp.
  4. Inkubera i PDB vid 28 ° C tills kultur uppnår 50% inledande av sporgroning indikerat av utbuktningen av sporer.
  5. Vortex och alikvotens 25 µL spore lösning till 225 µL plant extrakt. Inkubera 20 timmar vid 28 ° C med intermittent skakar prover.
  6. Alikvotens 25 µL spore lösning på ett objektglas och mäta längden på groddar rör sporer med hjälp av digitalkamera programvara. Använda ett minimum av 20 replikera mätningar för varje rad.
    Obs: I detta skede, placera alla kulturer vid 4 ° C att stoppa kolonin tillväxt tills det att räkna.

3. kernel Screening test (KSA)

  1. Konstruera KSA caps genom limning 4 snapin caps (22 mm) i en 60 x 15 mm petriskål. Låt limmet torka i 48 H innan du använder caps. Varje KSA cap utgör ett rep. (figur 2).
  2. I steril biologiska säkerhetsdragskåp, spraya en fyrkantig bioassay bricka (24 x 24 cm) med 70% etanol: H2O (v/v) och låt lufttorka. Lägg till sterila kromatografipapper i facket. Spray 9 KSA caps med 70% etanol, låt torka, och placera i bioassayen facket.
  3. För varje transgena majs av linje som testas, Välj 20 oskadade kärnor och placera i en 50 mL centrifugrör. Lägg till 70% etanol och låt sitta i 4 minuter. Skaka försiktigt rören under sterilisering. Häll av etanol och skölj kärnorna tre gånger i sterilt avjoniserat H2O.
  4. Förbereda en sporsuspensionen av Aspergillus flavus 70 – GFP17 från en 6 dagar gamla kultur odlas på V8 medium (5% V8 Juice, 2% agar, pH 5.2).
    1. Tillsätt 20 mL steril 0,02% Triton X-100/avjoniserat H2O (v/v) och skrot av sporer med en steril ögla. Pipettera av inokulatet och placera i en steril 300 mL-bägare.
    2. Förbereda en 5-faldig utspädning med 0,02% Triton x-100, sedan utföra en spore-räkna med en haemocytometer. Späd igen om det är nödvändigt att erhålla 100 mL med en koncentration av 4 x 106 sporer/mL.
  5. Placera kärnor i en steril 300 mL-bägare med uppståndelse bar. Lägga till inokulum bägaren.
    Varning: Lägga till kärnor i inokulum kommer att orsaka lösning till splash. Placera bägaren på en uppståndelse tallrik i 3 minuter. Efter 3 minuter, Häll av inokulatet till en tom bägare.
  6. Med hjälp av en pincett, placera kärnor i bioassayen skålen (1 kernel/cap). Tillsätt 30 mL avjoniserat vatten till botten av varje bioassay fack och inkubera vid 31 ° C i mörker i 7 dagar.
  7. Förbereda kärnor för fotografering.
    1. Avsätt 4 kärnor från varje rad för Mikroskopisk analys och fotografi.
      Obs: Kärnor kan lagras vid 4 ° C längre än 5 dagar innan du slutför fotografi.
    2. Ta bilder av kärnor efter sju dagar av inympningen med A. flavus (figur 3).
    3. Ren utsida kärnor med en mjuk vävnad och avjoniserat vatten. Utföra längdsnitt av kärnor och omedelbart ta fotografier i fluorescerande Mikroskop.
  8. Förbereda kärnor för analys.
    1. Rena exteriör av kvarvarande kärnor med en mjuk vävnad och avjoniserat vatten.
    2. Plats 4 kärnor, som utgör 1 rep, i en 15 mL skruvlock polykarbonat injektionsflaska innehållande 2 rostfritt stål bollar. Genast frysa injektionsflaskor i flytande kväve och förvaras vid-80 ° C tills vidare bearbetning och analys.
    3. Ta bort flaskor från-80 ° C frys och Mala kärnorna i en Homogenisatorer vid 1500 rpm i 3 minuter.
      Obs: Håll kärnor fryst med flytande kväve.

4. PCR-screening av transgena majs kärnorna

  1. Använda DNA isolering kit isolera genomiskt DNA (gDNA) från pulvriserat majs kärnor infekterade med A. flavus enligt tillverkarens anvisningar. Kort, lägga till 280 µL buffert F 20 µL proteas och 3 µL Ditiotreitol (DTT) i 10-15 mg av pulvriserat majs kärnorna. Inkubera och skaka i en thermomixer (56 ° C, 1200 rpm, 30 min). Centrifugera vid 10 000 x g i 1 min och klara supernatanten skakad kolumnen. Odla i rumstemperatur i 3 min och centrifugera vid 700 x g i 1 min till eluera gDNA.
  2. Ta 0.8 µL av extraherade gDNA att ställa in en 20 µL PCR-reaktion för varje prov med hjälp av en PCR kit. Följ termocykling villkor som rekommenderas i tillverkarens protokollet. PCR-villkoren omfattar ett inledande denaturering steg vid 98 ° C för 5 min (steg 1) följt av denaturering vid 98 ° C i 5 s (steg 2), glödgning vid 55 ° C för 5 s (steg 3), töjning vid 72 ° C för 20 s (steg 4), 40 cykler av steg 2 till 4 , och en slutlig töjning steg vid 72 ° C i 1 min (steg 5).
  3. Använd framåt primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' och reverse primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' att bekräfta förekomsten av Kristina AILP gen i transgena majs kärnorna.

5. RNA isolering, cDNA syntes och semi kvantitativ RT-PCR

  1. Ta homogeniserad A. flavus infekterade majs kärnorna tidigare lagras vid-80 ° C för RNA-extraktion. Extrahera RNA med en total RNA isolering kit enligt tillverkarens protokollet men med smärre ändring18. Efter att tillsätta 50 mg homogeniserad majs kernel pulver i utvinning bufferten, blanda väl (utan vortexa) använder en 1 mL Pipettera spets och lämna det på is för 5-6 minuter innan du fortsätter till efterföljande steg som beskrivs i tillverkarens protokollet.
  2. Förbereda cDNA använder ett cDNA syntes kit enligt tillverkarens protokoll 18.
  3. Använd 0,5 µL av outspädd cDNA per PCR-reaktion för halvkvantitativ RT-PCR som tidigare beskrivits18. Använd framåt och bakåt primers qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' och qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' respektive att upptäcka Kristina AILP genuttryck, och framåt och bakåt primers qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ och qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ respektive för uttryck av majs ribosomal strukturella genen (Rib), GRMZM2G02483819 som en städning-genen.

6. god Jordbrukarsed kvantitering

  1. Förbereda 50 mL 0,2 M monobasiskt natriumfosfat (NaH2PO4) respektive 0,2 M dibasiskt natriumfosfat (Na2HPO4·7H2O) i avjoniserat H2O.
  2. Göra upp 100 mL fosfatbuffert pH 7,0 Sörensons. För pH 7,0, lägga till 19,5 mL NaH2PO4 lager, 30,5 mL NaHPO4·7H2O lager och 50 mL avjoniserat H2O.
  3. Väg ut 25 mg marken kärnan material (färsk vikt, FW) och placera i en 1,0 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 500 µL fosfatbuffert till centrifugrör och virvel för 30 s.
  4. Centrifugera proverna i 15 minuter vid 16 000 x g. Pipettera 100 µL supernatanten till en svart 96 väl platta. Läs proverna med en fluorometer (excitation 485 nm, emission 528 nm).

7. totala aflatoxinhalten analys

  1. Prov bearbetning och aflatoxin utvinning
    1. Torka kernel prover i varmluft ugn 2 dagar vid 60 ° C. Väg prover och placera i en 50 mL Erlenmeyerkolven med en propp av glas.
    2. I ett dragskåp, tillsätt 25 mL metylenklorid i varje kolv.
      FÖRSIKTIGHET: Metylenklorid är mycket volatila och anses farliga (irriterande, cancerframkallande). Varken latex eller Nitril handskar är säkra för att arbeta med metylenklorid. Använd förbättrad organiska lösningsmedel resistent PolyVinylAlcohol handskar.
    3. Skaka prover för 30 min på en handled åtgärd shaker. Efter 30 min, Häll sakta extraktet genom ett veckat filterpapper cirkel i en 80 mL-bägare. Låt torka över natten bägare i dragskåp.
    4. Nästa dag, Tjejsprut metylenklorid (ca 5 mL) runt insidan fälg av de torra bägarna, snurra runt och häll i 2 dram glasampuller. Lämna injektionsflaskor öppna för att torka i ett dragskåp över natten.
  2. Aflatoxin analys
    1. Lägg till 4,0 mL 80-procentig metanol: avjoniserat H2O (v/v) till flaskor.
    2. Använd ett aflatoxin utvinning kit att filtrera rena metanol lösningen med den angivna kolumnen. Analysera totala aflatoxinhalten nivåer med en fluorometer, enligt tillverkarens instruktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Majs omvandling och molekylär screening av transgena växter

Omogna embryon av Hi-II majslinjer omformades med hjälp av Agrobacterium tumefaciens EHA101 stam som innehåller den slutliga växt destination vektor uttrycker Kristina purpureus AILP genen under kontroll av CaMV 35S arrangören. Fem självständigt transformerad majslinjer var avancerade till T6 generation för efterföljande studier. De transgena majs växterna var mycket mindre och mindre kraftfulla men visade inte några andra avvikelser jämfört med de syngena negativa kontrollplantorna. PCR-amplifiering av målgenen AILP visade en 548 bp amplikon, observerades endast i de transgena majsolja linjerna jämfört med kontroll växterna (figur 4A). Den AILP genen visade uttryck i de transgena linjerna medan ingen AILP uttryck observerades i kontroll växter (figur 4B).

Aspergillus flavus Spore assay med blad extrakt

Råolja bladextrakt från unga transgena majs växter utarbetades av slipning i vätska N och centrifugering vid 16 000 x g. Tidigt skede gror sporer utsattes för bladextrakt för 20 timmar och genomsnittlig spore hyphal längden spelades från 20 prover. Hyphal längd från Sporerna utsätts för transgena blad extrakt visade en 58% – 80% minskning jämfört med den negativa kontrollen (figur 5)

Aspergillus flavus tillväxt under kernel infektion

En Kernel Screening test (KSA) utfördes för att undersöka tillväxten av A. flavus i kärnorna i transgena och kontroll. Uttryck för den AILP genen i transgena kärnor negativt A. flavus tillväxt. A. flavus stammen används i den aktuella studien innehåller GFP reporter som möjliggör övervakning och kvantifiering av svamptillväxt i realtid. Betydande minskning av GFP fluorescensen hos transgena AILP kärnor jämfört med syngena negativa kontrollen (figur 6). AILP linjerna 4 och 5 visade en signifikant minskning i svamptillväxt, 69% och 72%, respektive, följt av de andra linjerna där en minskning på 35% – 60% observerades jämfört med kontroll kärnorna (figur 7A).

Aflatoxin produktion i de infekterade kärnorna

Heterologa uttryck av genen AILP i majs resulterade i betydande minskning av aflatoxinhalten i de transgena linjerna kontra kontroll. Den aflatoxin uppgifterna här är totala aflatoxinhalten upptäcks i de infektera kärnorna. En minskning med 62% – 88 procent av aflatoxinhalten observerades i de AILP kärnorna jämfört med kontroll (figur 7B). Bland de 5 olika AILP linjerna visade linje 4 lägsta aflatoxinhalten 486 ng/g DW, följt av andra rader mellan 640-1 498 ng/g DW i kärnorna kontra kontroll (3.986 ng/g DW).

Figure 1
Figur 1: Vektor design för transgena uttrycket av Kristina AILP gen i majs. 35S = blomkålsmosaikviruset eller CaMV konstitutiva promotorn; RB = höger kantlinje; LB = vänstra kant; nptII = neomycin phosphotransferase-kanamycin motstånd genen; nos och 35s = transkription terminators. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kernel Screening test. (A, B) Sterilisera kärnor och häll i en steril bägare i biologiska säkerhetsdragskåp. (C – E) Inokulera kärnor A. flavus sporsuspensionen. (F – H) Använd en steril pincett, placera kärnor i bioassayen maträtt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Ljus micrographs av A. flavus tillväxt. (A) syngena negativ kontroll. (B – F) Transgena kärnor uttrycker AILP (linjer 1-5) en vecka efter inympningen. Skalstapeln = 1 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Molekylär screening av transgena växter. (A), PCR bekräftelse av transgena majs växter (körfält 1-5) som innehåller Kristina AILP (548 bp diagnostiska DNA fragment; C = syngena negativ kontroll; NEB 2-Log DNA stege används som en DNA-markör). (B) uttryck för Kristina AILP gen i transgena majs rader (körfält 1-5) med RT-PCR. Lane C representerar syngena negativ kontroll. Majs ribosomal strukturella genen (Rib), GRMZM2G02483819 användes som en städning gen (NEB 2-Log DNA stege: DNA-markör). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Effekten av råa blad extrakt från transgena AILP majs växter på A. flavus sporgroning jämfört med en syngena negativ kontroll (neg). Genomsnittlig separationen skedde genom Dunnetts posttest efter ANOVA. Nivåer av betydande minskning markeras med asterisker (***P ≤ 0,0001). Felstaplar visar standardfel för medel för tjugo prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. God Jordbrukarsed fluorescens som härrör från den A. flavus stam 70-GFP i transgena kärnor uttrycker AILP efter en vecka av bioassay. Syngena negativa kontroller (A) användes för att utvärdera svampinfektion och sprida i transgena kärnor (B-F som representerar transgena linjerna 1-5). Minst fyra kärnor som screenades för varje rad i fluorescerande Mikroskop. Skalstapeln = 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: En flavus tillväxt och aflatoxin produktion. (A) A. flavus 70-GFP infektion och tillväxt i majs kärnorna efter 7 dagar i en Kernel Screening test. Genomsnitt av tre oberoende experiment med fyra biologiska replikerar varje gång. GFP kvantifiering (i relativa fluorescens enheter, RFU) anger svamptillväxt i transgena majs rader som uttrycker AILP till en syngena negativ kontroll. Genomsnittlig separationen skedde genom Dunnetts posttest efter ANOVA. Nivåer av betydande minskning betecknas med asterisker (*P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***p≤0, 001 ). Felstaplar visar standardfel för medel för fyra randomiserade biologiska replikat. (B) Aflatoxin produktion av A. flavus 70-GFP i majs kärnorna efter 7 dagar i en Kernel Screening test. Genomsnitt av 12 biologiska replikat och varje replikat innehöll fyra kärnor. Aflatoxin nivåer i transgena AILP kärnor (linjer 1-5) jämfört med en syngena negativ kontroll (neg). Genomsnittlig separationen skedde genom Dunnetts posttest efter ANOVA. Nivåer av betydande minskning betecknas med asterisker (**P ≤ 0,01; ***p≤0, 001 ). Felstaplar visar standardfel för medel för fyra randomiserade biologiska replikat. Se kompletterande siffror att visa data i panelen B saknar fördomar på grund av svamp hämning. Nära samband mellan GFP = RFU och aflatoxin värden finns också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Sup Figure 1
Kompletterande bild 1: Data från figur 7B ritas om för att Visa aflatoxin produktion av A. flavus 70-GFP i majs kärnorna efter 7 dagar i en Kernel Screening test att undanröja fördomar på grund av svamp tillväxthämning. Aflatoxin värden delades av svamptillväxt hämning representerade som GFP-RFU värdena i figur 7B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Sup Figure 2
Kompletterande figur 2: Stäng korrelation mellan GFP-RFU värden (= svamptillväxt) och aflatoxin nivåer (r2 = 0,86) rapporterade i KSA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Skördeförluster i grödor på grund av sjukdomsalstrare och skadedjur är ett globalt problem20. För närvarande tillämpningen av syntetiska fungicider och bekämpningsmedel är det dominerande sättet för kontrollerande växt sjukdomsalstrare och skadedjur, men resterande toxicitet av dessa biokemikalier i livsmedel och foder kan utgöra allvarliga hot mot människors och djurs hälsa21. Med tanke på den ekonomiska betydelsen av majs som livsmedel och foder grödan, minskning eller eliminering av aflatoxinföroreningar är av yttersta vikt2,3,22. Konventionell avel genom resistent gen introgression i mottagliga sorter är en tidskrävande process och sådant motstånd är inte alltid stabila som aflatoxin motstånd är en polygenisk drag och uttryck av gener som deltagande varierar avsevärt med förändringar i miljöparametrar4. Alternativa metoder utvärderas för att öka och stabilisera värd växten försvar mot A. flavus på ett miljövänligt sätt.

I den aktuella studien valde vi att utvärdera effekten av AILP -genen från hyacint bönor i majs mot A. flavus. AILP är en kompetitiv hämmare av α-amylas och också har svampdödande egenskaper, uttryckte vi denna gen under en stark konstitutiva promotorn CaMV 35S. Målet var att öka produktionen av detta heterologa protein i majs oavsett utvecklingsstadiet eller vävnadstyp. Betydande uttryck av α-amylas genen i transgena majs rader (figur 4AB) stöder stabilt uttryck för denna gen i ett heterologt system. Detta negativt svamptillväxt som framgår från minskningen av rumslig distribution av GFP fluorescens släpper de infektera AILP kärnorna och minskning av totala GFP fluorescens i kärnorna (figur 6 och figur 7A).

Utvecklingen av Kernel Screening test (KSA) använder tredjeparts en genetiskt modifierade A. flavus reporter stam uttrycker en gen som kodar för grönt fluorescerande protein (GFP) från maneter Aequorea victoria18, 23. för att utforma kontrollstrategier för eventuella patogener, är det nödvändigt att förstå funktionsläget av infektion, sprida och kolonisationen inom värdväxt eller vävnad. Den kolonisering och spridningen av den aflatoxigenic saprophyte, A. flavus är inte väl förstått eftersom genetiska regleringen av motståndskraft mot patogener, om det finns någon, inte är väl förstått. Användning av GFP-uttryckande A. flavus stammen gör det möjligt att spåra i realtid infektionsförlopp och kolonisering. GFP stammen och vildtyp skilde sig inte signifikant i patogen aggressivitet och aflatoxin produktion23. Men placeras den GFP-genen i denna särskilda stam under kontroll av konstitutivt uttryckta glyceraldehyd fosfatdehydrogenas (gpdA) genen arrangören 24 som är mer passande för att spåra svamptillväxt. Dock har använder denna fläck på bomullsfrö och majs kärnorna, vi visat en nära relation mellan GFP fluorescens som härrör från svampen svamp tillväxt och aflatoxin nivåer18,23.

För att etablera ett nära samband med aflatoxin producerande förmåga, kommer att gfp drivs av aflatoxin gen promotorer som omtA eller ver-125,26 vara mer lämplig än gpdA. GFP fluorescensen är tillräckligt känslig för att möjliggöra identifiering och mätning i realtid av även små förändringar i svamp tillväxt, både in vitro- i plantaoch utvärdering av hämmande verksamhet av okänd svampdödande proteiner och peptider såsom AILP och andra11,17,18,23. Dessutom resultaten från KSA korrelerar väl med fältet prestanda av resistenta eller mottagliga majslinjer när det gäller utvärdering för aflatoxin kontaminering27.

KSA är mycket användbart i vårt laboratorium till skärmen klassiskt-uppfödda nya sorter4 och transgena linjerna11,18. Det är lätt att ställa in och utföra KSA i något laboratorium. Man behöver använda oskadade rena kärnor för att utföra denna analys så att en tydlig förståelse för värd växt-svamp interaktion kunde utvärderas. Vi skannar rutinmässigt alla kärnorna som vi använder i vårt laboratorium under ett stereomikroskop innan du utför analysen. Det bör noteras att villkoren som vi använder för KSA innefattar hög luftfuktighet (95% RH) och konstant temperatur (31 ° C). Med uppkomsten av simulerade grobarhet processen under dessa förhållanden ger analysen idealiska förutsättningar att testa den integritet av utsäde pälsen, genetiska makeup av kärnorna inklusive svampdödande gener/proteiner påslagen under groning, eller svamp infektion. Svamp infektion och aflatoxin produktion kommer alltid att vara högre i KSA jämfört med deras förekomst i fältet. en nära korrelation har dock varit etablerade4,27.

Vi har visat i denna KSA att AILP minskar svamptillväxt i majs kärnorna. AILP har svampdödande egenskaper av växten lektiner och har visats hämma α-amylas, minskar stärkelse uppdelning och begränsa svamptillväxt. In vitro-studier visade att AILP kan hämma A. flavus var tillväxten i socker-rika potatis dextros buljong (PDB) artificiellt odlingsmedium, som visar dess svampdödande/tillväxt hämning aktivitet oberoende av dess amylas hämning verksamhet13. Andra växt lektiner isolerade från Urtica dioica (gemensamma nässlor), Heveabrasiliensis (gummiträd) och Solanumtuberosum (potatis) knölar också visa liknande svampdödande egenskaper och hämmade tillväxten av Botrytis cinerea , Pyrenophora triticioch Fusarium oxysporum28,29,30,31. AlfabetiskAmylase hämmare är inte bara effektivt mot svampar och bakterier men också visat sig vara effektivt mot skadeinsekter32. Alpha amylaser rapporteras vara kritiska för normal tillväxt och utveckling av växt-utfodring insekter, och flera insekt α-amylas-hämmare har isolerats från växter såsom vete, gemensamma bönor och majs12,33, 34,35. En betydande minskning av svamp hyphal längd från sporer som utsätts för grova blad extrakt (figur 5), minskning av svamptillväxt i den AILP-uttryckande majsen kärnorna vilket framgår av minskningen av GFP fluorescens både kvalitativt ( Figur 6) och kvantitativt (figur 7A) är möjligen på grund av en kombination av dess α-amylas hämning och svampdödande egenskaper. Experiment med dessa AILP-uttryckande majs växter mot andra patogener och skadedjur i framtiden kommer att vara av stort intresse att testa dess effektivitet mot olika biotiska stressfaktorer av utsäde och vegetativt vävnader. Egenskaperna svampdödande och tillväxt hämning av lektin har främst tillskrivits dess cross-linking med kitin och hämning av hyphal tip expansion28. I själva verket in vitro-AILP-medierad hämning av α-amylaser från olika svamp och bakteriella ursprung visade över 65% hämning i svamp patogener inklusive A. flavus, Magnaporthe länkar, Helminthosporium victoriaeoch 41 % hämning i bakterie patogenen Bacillus subtilis13. Resultaten på minskning av A. flavus tillväxt presenteras här är i linje med rollen av α-amylas-hämmare som antimykotika. Den aktuella studien ytterligare visar praktiska tillämpning av sådana användbar information från tidigare studier.

Minskning av aflatoxinhalten (figur 7B) i den AILP-uttrycker majslinjer är möjligen på grund av hämning av A. flavus α-amylas aktivitet, vilket leder till minskad nedbrytning av lagrade stärkelse, och minskad förvärv av sockerarter som en energikälla från majs kärnorna under patogena interaktion. Eftersom svamp α-amylas spelar en viktig roll i att bryta ner kernel stärkelse, förändrar någon förändring i svamp α-amylas aktivitet av AILP sannolikt halten lösligt socker under kernel infektion. Halten av lösligt socker, särskilt sackaros och glukos, har varit starkt korrelerade med ökad produktion av AFB1 och den totala aflatoxinhalten i majs och andra A. flavus mottagliga grödor såsom jordnötter36,37. Ökar sackaroshalten i konstgjord tillväxt medier ökar A. flavus aflatoxin produktion38. Andra lösliga sockerarter som glukos och maltos bidrar också positivt till aflatoxin produktion både i konstgjorda media och utsäde substrat38. Hämning av α-amylas aktivitet och mykotoxin produktionsminskningen i andra svampar förstärker en viktig roll för svamp α-amylaser toxin produktionen under kernel-infektion. Alpha-amylas knockout mutanter av både F. verticillioides och A. flavus misslyckades att producera fumonisin B1 och aflatoxiner respektive efter infektion av majs kärnorna9,10. Down-förordning av A. flavus α-amylas betydligt likaså svamp tillväxt och aflatoxin produktion under majs kernel infektion11. En 62-88% minskning av aflatoxin i de transgena linjerna är i enlighet med tidigare rapporter på rollen av α-amylas i aflatoxin produktion. Det ska noteras att in vitro-Kernel Screening test (KSA) är strängare än normalt under naturliga förhållanden. Villkor under den in vitro-test är också mycket gynnsamt för aflatoxin produktion, så den procentuella förändringen av aflatoxinhalten i de transgena linjerna kan vara mer meningsfull snarare än den absoluta tal av aflatoxinhalten i infekterade kärnorna. De resultat som presenteras här är lovande och framtida experiment under fältmässiga förhållanden är viktiga att undersöka potentialen hos dessa AILP-uttrycker majslinjer för aflatoxin motstånd under en naturlig scenario.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi tackar David Meints, University of Arkansas för hans hjälp utveckla och analysera de transgena majsen under de tidiga generationerna. Detta arbete fick ekonomiskt stöd av USDA-ARS CRIS projektet 6054-42000-025-00D. Omnämnande av varunamn eller kommersiella produkter i den här artikeln är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller bekräftelse av oss jordbruksdepartementet. USDA-ARS' lika sysselsättning möjlighet (EEO) politiska mandat lika möjligheter för alla personer och förbjuder diskriminering i alla aspekter av byråns personalpolitik, metoder och åtgärder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

Miljövetenskap fråga 144 α-amylas-hämmare aflatoxin Aspergillus flavus majs kernel screening test Kristina purpureus majs transgena
Hämning av <em>Aspergillus flavus</em> tillväxt och Aflatoxin produktion i transgena majs uttrycker α-amylas-hämmaren från <em>Kristina purpureus</em> L.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajasekaran, K., Sayler, R. J.,… More

Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter