Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/59169
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

Summary

Aspergillus flavus büyüme ve aflatoksin üretim mısır çekirdekleri antifungal bir protein ifade içinde analiz etmek için bir iletişim kuralı mevcut burada.  A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak biz izlenen enfeksiyon ve gerçek zamanlı olarak olgun çekirdekleri içinde mantar yayılmasını. Tahlil hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Abstract

Aflatoksin kontaminasyonu gıda ve yem bitkileri dünya çapında büyük bir sorun olduğunu. Mısır ve diğer petrol zengin bitkileri yanı sıra insan ve hayvan sağlığı için ciddi tehdit poz fıstık gibi kırpma değeri önemli ölçüde azaltmak güçlü kanserojen aflatoksin, mantar Aspergillus flavus (A. flavus) tarafından üretilen vardır. Geleneksel ıslah, direnç ilişkili protein ve RNA müdahale (RNAi) transgenik ifadesi de dahil olmak üzere farklı yaklaşımlar-ana bilgisayar kaynaklı gene kritik A. flavus susturmak dayalı gen hedefleri, değerlendirilir artırmak için aflatoksin direnç duyarlı bitkileri. Son çalışmalar α-amilaz A. flavus patogenez ve aflatoksin üretim, bu gen/enzim düşündüren önemli bir rol A. flavus büyüme ve aflatoksin üretim azaltmak için potansiyel bir hedeftir göstermiştir. Bu bağlamda çalışmada Mısır A. flavuskarşı bir Lablab purpureus L. α-amilaz inhibitörü benzeri protein (AILP) kapaklı ifade (altında bünye CaMV 35S organizatörü kontrolünü) değerlendirmek için yapılmıştır. AILP hangi A. flavus α-amilaz enziminin bir rekabetçi inhibitörü ve lektin-arcelin-α-amilaz inhibitörü protein ailesine ortak fasulye ait bir 36-kDa proteindir. İn vitro çalışmalar mevcut iş önce AILP rolünde inhibisyon A. flavus α-amilaz aktivitesi ve mantar büyüme gösterdi. Mantar büyüme ve olgun çekirdekleri aflatoksin üretim A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak gerçek zamanlı olarak takip. Bu çekirdek tahlil (KSA) eleme kurmak basit ve güvenilir ve tekrarlanabilir veri enfeksiyon ve sayısal yaymak ölçüde Pangenez ve transgenik hatları değerlendirme için sağlar. Floresans GFP zorlanma mantar için yakından ilişkili büyüme ve uzatma tarafından aflatoksin değerleri için iyi ilişkili.  Bu ön bilgi aflatoksin direncini artırmak için Mısır gibi ticari açıdan önemli bir ürün uygulamak için mevcut iş amacı oldu. Bizim sonuçları hangi, sırayla, aflatoksin düzeyleri %62-%88 azalma tercüme AILP ifade transgenik mısır çekirdekleri A. flavus büyüme % 35-%72 azalma gösterir.

Introduction

Mikotoksin kirlenme mantar Azomonas, Aspergillus Fusarium, Penicilliumve Alternaria tarafından gıda büyük bir sorundur ve yem bitkileri yetiştirilen dünya çapında1,2,3. Bu pitopatojenik mantarlar arasında Aspergillus kırpma değeri ve insan ve hayvan sağlığı en fazla olumsuz etkiye sahiptir. Aspergillus flavus (A. flavus) Mısır, pamuk ve fıstık gibi petrol zengin bitkileri bozar ve güçlü kanserojen, aflatoksin yanı sıra çok sayıda toksik ikincil metabolit (SMs) üreten bir fırsatçı bitki patojeni var. Mısır önemli bir besindir ve dünya çapında yetiştirilen bitki besleme ve kirlenme A. flavustarafından son derece duyarlı olduğunu. Aflatoksin kirlenme üzerinde ekonomik etkisini kaybeder ve Mısır düşük değeri olarak 686.6 milyon dolar/yıl ABD2 öngörülen değişiklikler ile küresel iklim olabilir, aflatoksin etkisi Mısır ile daha büyük ekonomik kayıplara neden olabilir tahmini olarak 1.68 Milyar dolar/çevre gelecek2yılda yüksek. İnsan ve hayvan aflatoksin olumsuz ekonomik ve sağlık etkileri göz önüne alındığında, Mısır denetiminde öncesi hasat aflatoksin gıda aflatoksin kirlenmesini önlemek ve yem ürünleri için en etkili yolu olabilir.

Saat4önemli miktarda gerektiren öncelikle üreme yoluyla, yoğun son birkaç on yıl içinde kullanılan Mısır aflatoksin direniş için büyük öncesi hasat denetim yaklaşımdır. Son zamanlarda, biyolojik büyük ölçekli alan uygulamaları5,6' aflatoksin azaltma içinde bazı başarı elde etti. Biyolojik yanı sıra, uygulama 'Ana bilgisayar indüklenen Gene susturmak' RNAi aracılığıyla (HIGS) gibi son teknoloji moleküler araçlarından ve direnç ilişkili proteinlerin transgenik ifade A. flavus büyüme ve aflatoksin azaltılması bazı başarı olmuştur üretim ise küçük ölçekli laboratuvar ve alan çalışmaları. Bu yaklaşımların Şu anda gelecekteki manipülasyon için yeni potansiyel A. flavus gen hedefler belirlenmesi ek olarak optimize edilmiş.

Doğrudan transgenik kontrol stratejilerinin potansiyel hedefleri olarak mikotoksin üretimi söz konusu genlerin yanı sıra mantar amylases erken aşamalarında başarılı patogenez ve mikotoksin üretimi korumak kritik bir rol oynamaktadır gösterilmiştir Ana bilgisayar bitki enfeksiyonu. Pythium pleroticum (zencefil köksap rot nedensel Ajan), birkaç örnekler nerede patojenitesi ve α-amilaz ifade ve aktivite arasında pozitif korelasyon gözlendi Fusarium solani (karnabahar solgunluk nedensel Ajan), 7,8. α-amilaz etkinliği gen nakavt veya devirme yaklaşımlar ile inhibisyonu mantar büyüme ve toksin üretimi olumsuz yönde etkiler. Bir α-amilaz nakavt mutant A. flavus ve nişasta substrat veya degermed mısır çekirdekleri9tarihinde yetiştirilen aflatoksin üretmek bulamadı. Benzer şekilde, Fusarium verticillioides içinde bir α-amilaz nakavt zorlanma fumonisin B1 (mikotoksin) Mısır çekirdekleri10enfeksiyon sırasında üretmek başarısız oldu. Daha yeni bir çalışmada, Gilbert ve ark. (2018) bir RNAi tabanlı yıkmak A. flavus α-amilaz ifade HIGS aracılığıyla A. flavus büyüme ve aflatoksin üretim sırasında Mısır çekirdek enfeksiyon11 azaltılacağını gösterdi .

α-amilaz faaliyet belirli inhibitörleri de aşağı-Yönetmeliğin α-amilaz ifade elde gibi benzer sonuçlar doğurmuştur. 14-kDa tripsin-α-amilaz inhibitörü Mısır satırlarından A. flavus12' ye dayanıklı malzemelerin yalıtım ve mantar direnç bir α-amilaz inhibitörü olan rolüne ilk rapor geldi. Daha fazla Fakhoury ve Woloshuk bir 36-kDa α-amilaz inhibitörü benzeri protein (AILP) tanımlaması liderliğindeki tarafından bitki türlerinin birkaç yüz sümbül fasulye, Lablab purpureus L.13taneleri tarama. Lektin-arcelin-α-amilaz inhibitörü ailesine ait AILP andıran lektinlerinin peptit dizisi ortak fasulye14,15bildirdi. Saf AILP memeli tripsin ve daha fazla tüp bebek karakterizasyonu A. flavus büyüme ve conidial çimlenme13önemli inhibisyonu gösterdi doğru inhibitör herhangi bir faaliyet göstermez. Sunulan raporları burada açıkça gösterir α-amilaz hedef patojenler veya nişasta seferberlik (α-amilaz faaliyetleri ile) bağlı çözünür şekerler edinimi sırasında bir enerji kaynağı olarak zararlıları sınırlamak için denetim yaklaşımlar olarak hizmet edebilir onların Ana tesisleri ile patojenik etkileşim.

Alfa-amilaz A. flavus patojenitesi9,10,11ve olarak güçlü bir anti-A. flavus Ajan (α-amilaz inhibisyon/antigrowth)13AILP önemini göz önüne alındığında kritik olduğu bilinmektedir, transgenik mısır bitkileri Lablab AILP ifade oluşturulan gen bünye CaMV 35S organizatörü altında. Mısır bu α-amilaz inhibitörü Contegra ifade A. flavus patogenez ve aflatoksin üretim Mısır çekirdek enfeksiyon sırasında karşı etkili olup olmadığını araştırmak için hedefi oldu. Bizim sonuçlar önemli ölçüde AILP ifade transgenik mısır çekirdekleri A. flavus büyüme ve aflatoksin üretim çekirdek enfeksiyon sırasında azaltılmış gösterilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plazmid yapıları ve Mısır dönüştürme

  1. PCR yükseltmek Lablab AILP 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 've 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3' primerler kullanılarak ekleme. PCR koşullar bir ilk denatürasyon adım 30 98 ° C'de yer denatürasyon 10 98 ° C'de tarafından takip s (adım 1), s (adım 2), 30 55 ° C'de tavlama s (adım 3), 20 72 ° C uzama s (adım 4), adım 2 ile adım 4 31 döngüleri , ve son bir uzama adım 5 dk. değiştirilmiş pCAMBIA 1300 PCR üründe vektör Xbakullanarak klon için 72 ° C'de ben ve Pstben kısıtlama siteleri. Sıra son bitki hedef vektör yönünü ve vektör klonlanmış AILP gen dizisini onaylamak için.
  2. Agrobacterium gerilme EHA101 son vektör yapı (Şekil 1) ile daha önce açıklanan 16olarak dönüştürmek.
  3. Olgunlaşmamış Mısır (Zea mays L. Hi-II) embriyo (bitki dönüşüm tesisi, Iowa Eyalet Üniversitesi'nde gerçekleştirilen) dönüştürmek için son bitki hedef vektör içeren Agrobacterium dönüştürülmüş kullanın 16.
  4. (26-29 ° C; 16/8 h photoperiod yüksek basınç Na-lambalar ile desteklenmiş) sera içinde T0 bitkiler büyümek ve art arda T6 nesil transgenik özelliği için homozygosity elde etmek için elde etmek için self-pollinate.

2. spore çimlenme tahlil

  1. Yaprak örnekleri hasat ve-80 ° C'de depolayın Yaprak örnekleri bir harç ve sıvı nitrojen kullanarak havaneli ile eziyet. 2 mL microcentrifuge tüpler 0.5 g tartmak, proteaz inhibitörü 17 µL eklemek ve tüpler buza koyun.
  2. Tüpler, 16.000 x g10 dk santrifüj kapasitesi. 0.5 mL microcentrifuge tüpler için Bitki ekstresinin 225 µL aktarmak ve buza koyun.
  3. 15 mL santrifüj tüpü Aspergillus flavus 70 – GFP % 1 patates dekstroz suyu (w/v) içinde bir 5 mL spor süspansiyon hazırlamak. Girdap ve spor konsantrasyonu 105 Sporlar/ml bir haemocytometer ile ayarlayın.
    Dikkat: A. flavus aflatoksin üretir, bu mantar ile tüm iş biyolojik emanet dolabı yapılmalıdır.
  4. Kültür Sporlar şişkin tarafından belirtildiği gibi spor çimlenmesi inisiyasyon % 50 elde kadar PDB'de 28 ° C'de kuluçkaya.
  5. Girdap ve aliquot 25 µL spore çözüm 225 µL bitki özü. Örnekleri 28 ° C'de aralıklı sallayarak ile 20 saat kuluçkaya.
  6. Spore çözüm ölçü uzunluğu, mikrop ve mikroskop slayt üzerinde aliquot 25 µL Sporlar dijital kamera yazılımı kullanarak tüpleri. En az 20 Çoğalt ölçümler her satırı için kullanın.
    Not: Bu aşamada 4 ° C'de saymak için hazır kadar koloni büyümesini durdurmak için tüm kültürler yerleştirin.

3. çekirdek tahlil (KSA) Eleme

  1. KSA kapaklar 4 ek kapaklar (22 mm) 60 x 15 mm petri kabına yapıştırma tarafından inşa. Tutkal için 48 H kapaklar kullanmadan önce kurumasını sağlar. Her KSA kap bir rep (Şekil 2) kabul ettiğiniz anlamına gelir.
  2. Bir steril biyolojik güvenlik kabin, bir kare bioassay tepsi (24 cm x 24 cm) % 70 etanol: H2ile O (v/v) sprey ve kuru hava girsin. Steril Kromatografi kağıt tepsisi. % 70 etanol ile 9 KSA caps sprey, bioassay tepsisine yerleştirin ve kuru hava girsin.
  3. Test edilen her transgenik Mısır satırı için 20 hasarsız çekirdekleri seçin ve bir 50 mL santrifüj tüpü yerleştirin. % 70 etanol ekleyin ve 4 dakika oturup bekleyin. Yavaşça tüpler sterilizasyon sırasında sallamak. Kapalı üç kez olarak steril deiyonize H2O. etanol ve durulama çekirdekleri dökün
  4. V8 Orta (%5 V8 suyu, %2 agar, pH 5.2) yetiştirilen Aspergillus flavus 70 – GFP17 6 gün eski bir kültürden bir spor süspansiyon hazırlamak.
    1. 20 mL steril %0.02 Triton X-100/deiyonize H2O (v/v) eklemek ve bir kısır döngü ile Sporlar kapalı hurda. Damlalıklı yeri bir 300 mL steril ölçek ve inoculum kapalı.
    2. 0,02 ile 5-fold bir seyreltme hazırlamak % Triton X-100, sonra bir haemocytometer olan bir spor sayısı gerçekleştirin. Tekrar 4 x 106 Sporlar/mL bir konsantrasyon ile 100 mL elde etmek gerekirse oranında seyreltin.
  5. Çekirdekleri steril 300 mL kabı bir heyecan çizgiyle yerleştirin. İnoculum kabı için ekleyin.
    Dikkat: çekirdekler için inoculum eklemek çözüm sıçrama için neden olacaktır. Kabı 3 dakika boyunca bir heyecan tabağa yerleştirin. 3 dakika sonra inoculum bir boş kabı dökün.
  6. Bir forseps kullanarak, çekirdekleri bioassay tabak (1 çekirdek/kapak) yerleştirin. 30 mL deiyonize su her bioassay tepsi altına ve 7 gün boyunca karanlıkta 31 ° C'de kuluçkaya ekleyin.
  7. Çekirdekleri Fotoğrafçılık için hazırlayın.
    1. 4 çekirdekleri mikroskopik analiz ve Fotoğrafçılık her satırdan kenara.
      Not: Çekirdekler için artık fotoğraf tamamlamadan önce 5 gün daha 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
    2. Aşı A. flavus (Şekil 3) ile yedi gün sonra çekirdekleri fotoğraf çekmek.
    3. Çekirdekleri bir yumuşak doku ve deiyonize su ile temiz dış. Boyuna çekirdekleri bölümlerini gerçekleştirmek ve hemen floresan mikroskop altında fotoğraf çekmek.
  8. Çekirdekleri analiz için hazırlayın.
    1. Bir yumuşak doku ve deiyonize su ile kalan çekirdeklerin temiz dış.
    2. Yer 4 badem, 1 rep, 15 mL vidalı kapak Polikarbonat oluşturan içeren 2 Paslanmaz topları şişe. Hemen şişeleri sıvı azot ve mağaza-80 ° C'de daha fazla işleme ve analiz kadar dondurmak.
    3. Şişeleri-80 ° C dondurucudan kaldırmak ve çekirdekleri bir homogenizer 1500 rpm içinde 3 dakika boyunca eziyet.
      Not: sıvı azot ile dondurulmuş çekirdekleri tutun.

4. PCR tarama transgenik mısır çekirdekleri

  1. DNA izolasyon kit genomik DNA (gDNA) izole etmek için üreticinin yönergelerine göre A. flavus ile enfekte toz mısır çekirdekleri kullanın. Kısaca, 280 µL arabellek F, 20 µL proteaz ve 3 µL dithiothreitol (DTT) toz mısır çekirdekleri için 10-15 mg ekleyin. Kuluçkaya ve bir thermomixer (56 ° C, 1200 rpm, 30 dk) sallamak. 10.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve açık süpernatant dengelenmiş sütuna aktarmak. 3 dk. ve santrifüj 700 x g gDNA elute için 1 dakika için de oda sıcaklığında kuluçkaya.
  2. 0.8 µL PCR kiti kullanarak her örnek için bir 20 µL PCR reaksiyon ayarlamak için çıkarılan gDNA al. Thermocycling koşulları olarak üreticinin iletişim kuralında tavsiye izleyin. PCR koşullar denatürasyon 5 için 98 ° C'de ardından bir ilk denatürasyon adım 5 min (adım 1) için 98 ° C'de yer s (adım 2), 55 ° c 5 tavlama s (adım 3), 20 72 ° C uzama s (adım 4), adım 2 ile adım 4 40 döngüleri ve bir son uzama adım 72 ° c için 1 dk (5. adım).
  3. İleri astar 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3'ü kullanın ' ve ters astar 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' Lablab AILP varlığını doğrulamak için gen transgenik mısır çekirdekleri içinde.

5. RNA izolasyon, cDNA sentezi ve yarı kantitatif RT-PCR

  1. Homojenize almak A. flavus mısır çekirdekleri daha önce RNA çıkarılması için-80 ° C'de depolanan enfekte. Bir toplam RNA izolasyon kit üreticinin protokolüne göre ama hafif değişiklik18ile kullanarak RNA ayıklayın. Homojenize mısır çekirdeği tozu 50 mg ayıklama arabellekte ekledikten sonra onsuz de (vortexing) 1 mL damlalıklı ucu kullanarak karıştırın ve buz üzerinde 5-6 dakika devam etmeden önce sonraki adımlar için üreticinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi bırakın.
  2. CDNA üreticinin iletişim kuralı 18göre cDNA sentez seti kullanarak hazırlayın.
  3. 0.5 µL PCR reaksiyon başına su katılmamış cDNA yarı kantitatif RT-PCR için daha önce açıklanan18kullanın. İleriye ve geriye doğru astar qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3'ü kullanın ' ve qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA sırasıyla Lablab AILP gen ekspresyonu, algılamak ve ileri ve ters astar qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ ve qRib-R - 3' 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ sırasıyla Mısır ribozomal yapısal gen (göğüs), GRMZM2G02483819 ev tutma gen olarak ifade.

6. GFP Nefelometri

  1. 50 mL her 0.2 M Yem mono sodyum fosfat (NaH2PO4) ve 0.2 M dibasic sodyum fosfat (Na2HPO4·7H2O) deiyonize H2O. hazırlamak
  2. PH 7,0 Sorenson fosfat tampon 100 mL kadar olun. 19.5 mL NaH2PO4 hisse senedi, 30.5 mL NaHPO4·7H2O hisse senedi ve 50 mL deiyonize H2O. pH 7,0 için ekleyin
  3. 25 mg yere çekirdek malzeme (taze ağırlık, FW) tartmak ve bir 1.0 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Santrifüj tüpü ve 30 için girdap 500 µL fosfat tampon eklemek s.
  4. Örnekleri 16.000 x gde 15 dakika santrifüj kapasitesi. Damlalıklı 100 µL süpernatant siyah 96 iyi plaka içine. Örnekleri bir yer (uyarma 485 nm, emisyon 528 nm) okuyun.

7. Toplam Aflatoksin Analizi

  1. Örnek işleme ve aflatoksin çıkarma
    1. 60 ° C'de 2 gün cebri hava fırında kuru çekirdek örnekleri Örnekleri tartmak ve 50 mL Cam tıpa ile Erlenmeyer şişeye koyun.
    2. Bir duman başlık, her şişeyi için 25 mL Metilen klorür ekleyin.
      Dikkat: Metilen klorür son derece kırılgandır ve tehlikeli (tahriş edici, kanserojen) olarak kabul edilir. Ne lateks ne de nitril eldiven Metilen klorür ile çalışmak için güvenlidir. Geliştirilmiş organik solvent dayanıklı PolyVinylAlcohol eldiven kullanın.
    3. 30 dk için örnekleri üzerinde bilek eylem sallayıcı. 30 dakika sonra yavaş yavaş özü bir yivli filtre kağıdı daire bir 80 mL kabı dökün. Bir duman hood kadehler kuru geceleme izin.
    4. Ertesi gün, Metilen klorür (yaklaşık 5 mL) iç bücür jant kuru kadehler, etrafında girdap ve 2 Dramı cam şişe dökün. Gecede bir duman mahallede kurumaya bırakın şişe açın.
  2. Aflatoksin Analizi
    1. 4.0 mL % 80 metanol ekleyin: Deiyonize H2O (v/v) tüpleri için.
    2. Kullanım filtre uygulamak için bir aflatoksin ekstraksiyon kiti metanol çözüm sağlanan sütun ile arındırmak. Toplam Aflatoksin düzeyleri ile bir yer, üreticinin yönergelerine göre analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mısır dönüştürme ve Transgenik bitkilerin moleküler tarama

Mısır Hi-II satırlarının olgunlaşmamış embriyo Lablab purpureus AILP gen CaMV 35S kontrol altında ifade son bitki hedef vektör içeren Agrobacterium tumefaciens EHA101 zorlanma kullanılarak dönüştürülen organizatörü. Beş bağımsız olarak dönüştürülmüş Mısır satır T6 nesil sonraki çalışmaları için gelişmiş. Transgenik Mısır bitkiler çok daha küçük ve daha düşük düzeyde ama isogenic negatif kontrol bitkilere göre herhangi bir anormallik yoktu. PCR güçlendirme hedef AILP gen transgenik Mısır hatları kontrol tertibatları (Şekil 4A) ile karşılaştırıldığında sadece gözlenen bir 548 bp amplicon gösterdi. Herhangi bir AILP ifade Kontrol tertibatları (Şekil 4B) gözlendi, ancak AILP gen ifade transgenik satırlarında gösterdi.

Aspergillus flavus Spore tahlil yaprak ayıklar

Bitkiler de 16.000 x gcentrifuging ve sıvı N kabuğu tarafından hazırlanan genç transgenik Mısır ham yaprak ayıklar. Erken sahne takımıdır Sporlar yaprak özü 20 saat sinin ve kötü spor hyphal uzunluğu 20 örnekleri kaydedildi. Sporlar gelen hyphal uzunluğu negatif kontrol (Şekil 5) göre % 58-% 80 tasarruf gösterdi transgenik yaprak özleri maruz

Aspergillus flavus çekirdek enfeksiyon sırasında büyüme

Bir çekirdek eleme tahlil (KSA) A. flavus transgenik ve denetim çekirdekleri içinde gelişimini incelemek için gerçekleştirildi. Transjenik çekirdeklerin AILP gen ifadesi A. flavus büyüme olumsuz etkiledi. Mevcut çalışmada kullanılan A. flavus zorlanma bir izleme sağlayan GFP muhabir ve gerçek zamanlı olarak mantar büyüme miktar içerir. GFP floresans önemli azalma isogenic negatif kontrol (Şekil 6) için karşılaştırıldığında transgenik AILP çekirdekleri gözlendi. AILP satırları 4 ve 5 önemli bir azalma % 35-%60 azaltma denetim çekirdekleri (Şekil 7A) ile karşılaştırıldığında nerede görülmüştür diğer satırların tarafından takip mantar büyüme, % 69 ve % 72, sırasıyla, gösterdi.

Virüslü çekirdekleri aflatoksin üretimde

Mısır AILP gen Contegra ifade aflatoksin içerik denetimi vs transgenik satırlarında önemli azalma sonuçlandı. Aflatoksin verileri virüslü çekirdekleri tespit Toplam Aflatoksin içerik burada verilir. Aflatoksin içerik %62-%88 azalma AILP çekirdekleri ile karşılaştırıldığında kontrol (Şekil 7B) gözlenmiştir. 5 farklı AILP çizgi arasında 640-1,498 ng/g çekirdekleri denetim (3,986 ng/g DW) vs DW arasında değişen diğer satırları ardından en düşük aflatoksin içerik (486 ng/g DW), hat 4 gösterdi.

Figure 1
Şekil 1: Mısır Lablab AILP geni transgenik ifade vektör tasarımı. 35s karnabahar mozaik virüsü veya CaMV kurucu organizatörü; = RB sağ kenarlık; = LB = sol kenarlık; nptII paromisin fosfotransferaz sefaloridin direnç gen; = NOS ve 35s transkripsiyon sonlandırıcılar =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Tahlil eleme çekirdek. (A, B) Çekirdekleri sterilize ve steril bir ölçek biyolojik güvenlik kabin içine dökün. (C-E) A. flavus spor süspansiyon ile çekirdekleri aşılamak. (F-H) Steril bir forseps kullanarak, çekirdekleri bioassay çanak yerleştirin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Işık filmler A. flavus büyüme. (A)Isogenic negatif kontrol. (B-F) Transjenik çekirdeklerin AILP (satır 1-5) bir hafta sonra aşı ifade. Ölçek çubuğu 1 cm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Moleküler tarama Transgenik bitkilerin. (A) PCR onay Mısır Transgenik bitkilerin (dar sokak 1-5) Lablab AILP içeren (548 bp tanılama DNA parçası; C = isogenic negatif kontrol; NF'leri 2-günlük DNA merdiven) DNA işareti olarak kullanılır. (B) ifade Lablab AILP gen transgenik Mısır satırlarındaki (dar sokak 1-5) RT-PCR kullanarak. Lane C isogenic negatif denetim temsil eder. Mısır ribozomal yapısal gen (göğüs),19 ev tutma gen kullanılan GRMZM2G024838 (NF'leri 2-günlük DNA merdiven: DNA işareti). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. Ham yaprak etkilerini ayıklar A. flavus spor çimlenmesi ile karşılaştırıldığında bir isogenic negatif kontrol (negatif) üzerinde transgenik Mısır AILP bitkilerden. Demek ayrılık ANOVA sonra Dunnett'ın posttest tarafından yapıldı. Önemli azaltma düzeyleri tarafından yıldız işareti ile belirtilen (***P ≤ 0.0001). Hata çubukları demek yirmi örnekleri için standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. A. flavus zorlanma 70-GFP transjenik çekirdeklerin AILP bioassay bir hafta sonra ifade içinde üzerinden yayılan GFP Floresans. İsogenic negatif denetimleri(a)mantar enfeksiyonu değerlendirmek ve transjenik çekirdeklerin (transgenik satırlarını 1-5 temsil edenB-F ) yaymak için kullanılmıştır. En az dört çekirdekleri floresan mikroskop altında her satırı için gösterildi. Ölçek çubuğu 2 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: Bir flavus büyüme ve aflatoksin üretim. (A) A. flavus 70-GFP enfeksiyon ve mısır çekirdekleri büyüme bir çekirdek tahlil eleme 7 gün sonra. Ortalama dört biyolojik ile üç bağımsız deneyler her zaman çoğaltır. GFP miktar (biriminde göreli floresan, RFU) AILP için isogenic bir negatif kontrol ifade transgenik Mısır satırlarındaki mantar büyüme gösterir. Demek ayrılık ANOVA sonra Dunnett'ın posttest tarafından yapıldı. Önemli azaltma düzeyleri tarafından yıldız işareti ile belirtilen (*P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0.001). Hata çubukları demek için dört randomize biyolojik çoğaltır standart hatasını gösterir. (B) A. flavus 70-GFP mısır çekirdekleri içinde aflatoksin üretiminde eleme bir çekirdek tahlil 7 gün sonra. Ortalama 12 biyolojik çoğaltır ve her çoğaltma dört çekirdek yer. Aflatoksin seviyelerinde transgenik AILP çekirdekleri (satır 1-5) bir isogenic negatif kontrol (negatif) ile karşılaştırıldığında. Demek ayrılık ANOVA sonra Dunnett'ın posttest tarafından yapıldı. Önemli azaltma düzeyleri tarafından yıldız işareti ile belirtilen (**P ≤ 0,01; ***P ≤ 0.001). Hata çubukları demek için dört randomize biyolojik çoğaltır standart hatasını gösterir. Önyargı mantar inhibisyon nedeniyle yoksun B panelinde veri görüntülemek için ek değerler bkz:. Kapatın GFP arasında korelasyon = RFU ve aflatoksin değerleri de temin edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sup Figure 1
Tamamlayıcı Şekil 1: Aflatoksin üretim göstermek için A. flavus 70-GFP mısır çekirdekleri içinde tarafından bir çekirdek eleme önyargı nedeniyle mantar büyüme inhibisyonu ortadan kaldırmak için tahlil 7 gün sonra yeniden çizilmesi şekil 7b veri. Aflatoksin değerleri Şekil 7BGFP-RFU değer olarak temsil mantar büyüme inhibisyon tarafından ayrıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sup Figure 2
Tamamlayıcı Şekil 2: kapatın (= mantar büyüme) GFP-RFU değerleri ve aflatoksin düzeyleri arasında korelasyon (r2 = 0.86) KSA bildirdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verim kayıp patojenler ve zararlıları nedeniyle tarımsal ürün içinde küresel bir sorun20olduğunu. Şu anda, uygulama sentetik mantar ilaçları ve böcek ilaçları kontrol bitki patojenleri ve zararlıları için baskın anlamına gelir, ama bu biochemicals gıda ve yem içinde kalan toksisitesi insan ve hayvan sağlık21için ciddi bir tehdit oluşturabilir. Gıda ve yem kırpma olarak Mısır ekonomik önemi göz önüne alındığında, azalma veya aflatoksin kirlenme ortadan kaldırılması son derece önemli2,3,22' dir. Dirençli gen introgression aracılığıyla klasik ıslah duyarlı çeşitleri içine zaman alıcı bir süreçtir ve bu tür direnç her zaman aflatoksin direnç polygenic bir özellik ve katılımcı genlerin ifade değişir önemli ölçüde gibi istikrarlı değil çevre parametreleri4değişiklikler ile. Alternatif yaklaşımlar artırmak ve A. flavus karşı ana bitki savunma ecofriendly bir şekilde stabilize etmek üzere değerlendirmeye alınır.

Mevcut çalışmada, sümbül fasulye Mısır A. flavuskarşı gelen AILP gen etkinliğini değerlendirmek seçtik. AILP α-amilaz rekabetçi bir inhibitörü ve ayrıca antifungal özellikleri sahip olarak, biz güçlü bir bünye organizatörü CaMV 35Saltında bu gen dile getirdi. Mısır gelişim aşaması veya doku türü ne olursa olsun bu Contegra protein üretimini artırmak için hedefi oldu. α-amilaz gen (Şekil 4AB) transgenik Mısır satırlarındaki önemli ifade kapaklı bir sistemde bu gen istikrarlı ifade destekler. Bu olumsuz etkilenen GFP floresans enfekte AILP çekirdekleri içinde kayma dağılımını azalma ve çekirdekleri (Şekil 6 ve Şekil 7A) genel GFP floresans azalma belirgin olarak mantar büyüme.

Geliştirme çekirdeği eleme tahlil (KSA) bir genetiği kullanır A. flavus muhabir zorlanma denizanası Aequorea victoria18, yeşil flüoresan protein (GFP) kodlama bir gen ifade 23. herhangi bir patojen için denetim stratejiler tasarlamak için enfeksiyon, yaymak ve kolonizasyon ana bitki veya doku içinde modu anlamak gereklidir. Kolonizasyon ve aflatoxigenic cimri yayılmasını, A. flavus iyi değil çünkü genetik düzenleme patojen direnç varsa, iyi anlaşılamamıştır anladım. GFP ifade A. flavus zorlanma kullanımı enfeksiyon süreci ve kolonizasyon gerçek zamanlı olarak izlemenize olanak sağlar. GFP zorlanma ve vahşi türü önemli ölçüde patojen saldırganlık ve aflatoksin üretim23' te olmayan farklı. Ancak, bu belirli zorlanma GFP gen mantar büyüme izlemek için daha uygun olan yapısal ifade gliseraldehit fosfat dehidrogenaz (gpdA) gen organizatörü 24 kontrol altına alınır. Ancak, bu leke ayçiçek ve mısır çekirdekleri kullanarak, mantar mantar büyüme ve aflatoksin düzeyleri18,23yayılan GFP floresans arasında yakın bir ilişki göstermiştir.

Yetenek üreten aflatoksin ile yakın bir ilişki kurmak için aflatoksin gen Rehberleri omtA veya ver-125,26 gibi tahrik gfp gpdA. daha uygun olacak GFP floresans algılama ve mantar büyüme, küçük değişiklikler bile gerçek zamanlı olarak ölçümü için izin vermek için hassas hem vitro ve planta içindeve bilinmeyen antifungal proteinler ve peptidler inhibitör faaliyetlerinin değerlendirilmesi AILP ve diğerleri gibi11,17,18,23. Buna ek olarak, KSA sonuçlarından ilişkili olan alan performans açısından değerlendirme aflatoksin kirlenme27için Mısır satırlarının dayanıklı veya duyarlı ile iyi.

KSA bizim laboratuvar ekran klasik yetiştirilen yeni çeşitleri4 ve transgenik satırlar11,18için çok yararlıdır. Ayarlamak ve herhangi bir laboratuvarda KSA gerçekleştirmek kolaydır. Bir ana bilgisayar bitki mantar etkileşim net bir anlayış değerlendirildi böylece bu tahlil gerçekleştirmek için hasarsız temiz çekirdekleri kullanması gerekir. Bir stereomicroscope altında bizim laboratuvar tahlil gerçekleştirmeden önce kullandığımız tüm çekirdekler düzenli olarak tarayın. Bu biz KSA için istihdam koşulları yüksek nem (% 95 RH) ve sabit sıcaklık (31 ° C) dahil olması gerekmektedir. Bu koşullar altında simüle çimlenme işlem başlangıcı ile tahlil antifungal genler/proteinler çimlenme sırasında ve/veya mantar açık da dahil olmak üzere çekirdekler genetik tohum kat bütünlüğünü sınamak için ideal koşullar sağlar. enfeksiyon. Mantar enfeksiyonu ve aflatoksin üretim her zaman KSA olay alanında kıyasla daha yüksek olacaktır; Ancak, yakın bir ilişki kurulmuş4,27olmuştur.

Bu KSA AILP mısır çekirdekleri mantar büyüme azalttığını göstermiştir. AILP bitki lektinlerinin antifungal özelliklerine sahiptir ve α-amilaz, etkisizleştirmek için nişasta arıza azalan ve mantar büyüme sınırlama gösterilmiştir. Vitro çalışmalar AILP A. flavus inhibe kapasitesine sahip olduğunu gösterdi büyüme şeker zengini patates dekstroz suyu (PDB) yapay büyüme orta, antifungal/Büyüme inhibisyon faaliyet gösteren onun amilaz inhibisyonu bağımsız faaliyet13. Diğer bitki lektinlerinin Urtica dioica (ortak ısırgan), Hevea brasiliensis (ovucu ağaç) ve Solanum tuberosum (patates) yumrular da benzer antifungal özelliklerini göstermek izole ve Botrytis cinerea büyüme inhibe , Pyrenophora triticive Fusarium oxysporum28,29,30,31. Alfa amilaz inhibitörü sadece mantar ve bakteri karşı etkili değildir ama aynı zamanda böcek zararlıları32karşı etkili olduğu gösterilmiştir. Alfa amylases normal büyüme ve bitki besleme böcekler gelişimi için kritik olduğu bildirilen ve birkaç böcek α-amilaz inhibitörü buğday, ortak fasulye ve Mısır12,33gibi bitkilerden izole edilmiş, 34,35. Ham yaprak özleri (Şekil 5), AILP ifade Mısır mantar büyüme azalma maruz Sporlar gelen mantar hyphal uzunluğu önemli bir azalma GFP floresans azaltma tarafından niteliksel gösterildiği çekirdekleri ( Şekil 6) ve kantitatif (Şekil 7A) muhtemelen α-amilaz inhibisyonu ve antifungal özellikleri nedeniyle birleşimidir. Bu AILP ifade Mısır kullanarak deneyler diğer patojenleri karşı bitkiler ve zararlıları gelecekte tohum ve bitkisel dokular çeşitli biyotik stres karşı onun etkinliğini test etmek için büyük ilgi olacaktır. Lektin antifungal ve Büyüme inhibisyon özellikleri esas olarak atfedilen için onun cross-linking kitin ve hyphal ipucu genişleme28inhibisyonu ile. Aslında, α-amylases çeşitli mantar ve bakteri kökenli tüp bebek AILP-aracılı inhibisyonu gösterdi üzerinde % 65 inhibisyon fungal patojenlerin A. flavus, Magnaporthe grisea, Helminthosporium Kraliçeve 41 de dahil olmak üzere % inhibisyon bakteriyel pathogen Bacillus subtilis13içinde. Burada sunulan A. flavus büyüme azalma sonuçlarına antifungal ajanları olarak α-amilaz inhibitörü rolü doğrultusunda vardır. Çalışmada daha fazla pratik uygulama daha önce tüp bebek çalışmalardan elde edilen gibi yararlı bilgiler gösterir.

Aflatoksin AILP(Şekil 7B) içeriğinde azalma-Mısır hatları ifade saklı nişasta, azalan arıza için önde gelen A. flavus α-amilaz aktivitesinin inhibisyonu muhtemelen kaynaklanmaktadır ve şeker edinimi azaltılmış bir enerji kaynağından patojenik etkileşim sırasında mısır çekirdekleri. Fungal α-amilaz çekirdek nişasta kırılma içinde önemli bir rol oynar gibi fungal α-amilaz etkinliği ile AILP büyük olasılıkla herhangi bir değişiklik çekirdek enfeksiyon sırasında çözünür şeker içeriği değiştirir. Çözünür şekerler, özellikle sukroz ve glikoz, içeriği son derece AFB1 ve Toplam Aflatoksin Mısır ve fıstık36,37gibi diğer A. flavus duyarlı bitkileri, artan üretim ile ilişkili. Yapay büyüme medya içeriğinde sükroz artan A. flavus aflatoksin üretim38artırır. Diğer çözünür şekerler glikoz ve maltoz gibi de olumlu aflatoksin üretim yapay medya ve tohum yüzeylerde38hem de katkıda bulunur. α-amilaz etkinliği ve mikotoksin diğer mantar üretiminde azalma inhibisyonu fungal α-amylases çekirdek enfeksiyon sırasında toksin üretiminde önemli bir rol pekiştiriyor. Alfa-amilaz nakavt mutantlar F. verticillioides ve A. flavus fumonisin B1 ve enfeksiyon mısır çekirdekleri9,10sırasıyla takip aflatoksin üretmek için başarısız oldu. Benzer şekilde, aşağı-Yönetmeliğin A. flavus α-amilaz mantar büyüme ve aflatoksin üretim sırasında Mısır çekirdek enfeksiyon11azaltılacağını. Aflatoksin transgenik satırlarındaki %62 - %88 azalma olan α-amilaz aflatoksin üretiminde rolü ile ilgili önceki raporlar doğrultusunda. O tüp bebek çekirdek eleme tahlil (KSA) normalde bulunan doğal koşullar altında daha sıkı olduğunu belirtmek etmektir. Transgenik satırlarındaki aflatoksin içeriğindeki yüzde değişikliği virüslü çekirdekleri aflatoksin içeriğinin mutlak rakamlardan ziyade daha anlamlı olabilir bu yüzden tüp bebek tahlil koşullarında da aflatoksin üretimi için son derece elverişli. Burada sunulan sonuçlar umut verici ve gelecekteki deneyler alan koşullar altında bu AILPpotansiyelini incelemek önemlidir-Mısır satırları aflatoksin direnci altında doğal bir senaryo için ifade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Acknowledgments

David Meints, Arkansas Üniversitesi geliştirilmesi ve transgenik Mısır sırasında erken nesiller analiz onun yardım için teşekkür ederiz. Bu eser USDA-ARS CRIS proje 6054-42000-025-00D mali destek aldı. Ticari adlar veya ticari ürünler bu makalede söz yalnızca belirli bilgileri sağlamak amacıyla ve tavsiye veya bize Tarım Bakanlığı tarafından onaylandığı anlamına gelmez. USDA-ARS eşit istihdam fırsatı (EEO) ilkesi fırsat eşitliği için tüm kişilerin görev ve Ajans'ın personel politikaları, uygulamalar ve işlemler her yönüyle ayrımcılığı yasaklar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves Ansell 012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

Çevre Bilimleri sayı: 144 α-amilaz inhibitörü aflatoksin Aspergillus flavus Mısır tahlil Lablab purpureus Mısır transgenik eleme çekirdek
<em>Aspergillus flavus</em> büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü <em>Lablab purpureus</em> L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajasekaran, K., Sayler, R. J.,… More

Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter