Summary

ארעי ביטוי סלק אדום של חיסון ביולוגיות המועמד לסוכרת מסוג 1

Published: March 19, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מועמד חיסון אוראלי נגד סוכרת מסוג 1 במפעל אכיל.

Abstract

הצמח בחקלאות מולקולרי הוא השימוש של צמחים כדי לייצר מולקולות של עניין. בפרספקטיבה הזו, צמחים עשוי לשמש הן ריאקטורים על ההפקה ועל טיהור עוקבות של המוצר הסופי, למסירה אוראלי ישירה של חלבונים heterologous בעת שימוש מיני צמחים אכילים. בעבודה זו, אנו מציגים הפיתוח של חיסון אוראלי המועמד נגד סוכרת סוג 1 (T1D) מערכות צמח אכיל בעזרת טכנולוגיה מבוססת-וירוס דנ א רקומביננטי צמח המפורקים, הנכללת הסתננות ואקום. התוצאות שלנו מראים כי סלק אדום פונדקאי מתאים לביטוי ארעית autoantigen נגזר האנושי קשור T1D, נחשב מועמד מבטיח כמו חיסון T1D. עלים לייצר את autoantigen מאופיינים ביסודיות שלהם עמידות עיכול קיבה, נוכחות של מטען חיידקי שיורית, שלהם פרופיל מטבולי המשני, נותן סקירה כללית של תהליך הייצור לשימוש פוטנציאלי הצמחים עבור משלוח אוראלי ישירה של חלבון heterologous. הניתוח שלנו הראה השפלה כמעט מוחלטת של המועמד הליחה חיסון אוראלי בעקבות עיכול קיבה מדומה, רומז כי אסטרטגיית כימוס בייצור של החיסון גד הצמחי נדרש.

Introduction

מאז המהפכה ביולוגיה מולקולרית צמח בשנות ה-80, מערכות מבוססות-מפעל לייצור ביופרמצבטיקה יכול להיחשב כאלטרנטיבה למערכות מסורתית המבוססת על חיידקים בתרבית של תאים1. צמחים להציג כמה יתרונות על פני פלטפורמות מסורתי, עם מדרגיות, עלות האפקטיביות והבטיחות להיות הרלוונטיים ביותר2. המוצר רקומביננטי ניתן לטהר מרקמות הצמח טרנספורמציה, ואז מנוהל, גם parenterally או בעל פה, יתר על כן, צמח מאכל טרנספורמציה ניתן להשתמש ישירות עבור משלוח אוראלי. תוואי אוראלי בו זמנית מקדם חסינות הרירית ומערכתית, זה מבטל את הצורך של מחטים וצוותים רפואיים מיוחדים. יתר על כן, משלוח אוראלי מבטלת את העיבוד במורד הזרם מורכבים, עובייה בד כ 80% של העלות הייצור הכולל של חלבון רקומביננטי3. כל היתרונות הללו יכול להיות מתורגם חסכון בעלויות ייצור, אספקה, העבודה הפחתת העלויות של כל מנה, לבצע את התרופה במחיר נוח רוב האוכלוסייה הכללית.

מספר אסטרטגיות, הן עבור שינוי יציב, ביטוי ארעי, פותחו לייצור של חומרים בצמחים. ביניהם, מערכת מבוססת-וירוס הביטוי צמח המפורקים תשואה גבוהה (למשל, magnICON) מספק ביצועים מעולים מובילים תפוקה גבוהה של חומרים על צירי זמן קצר יחסית4. דוגמאות רבות של ביטוי ארעי באמצעות מערכת מבוססת-וירוס הביטוי צמח בצמחים benthamiana טבק ידווחו, להיות המארח ייצור תקן הזהב. עם זאת, צמח מודל זה לא נחשב זן אכיל בשל של אלקלואידים אחרים מטבוליטים רעילים שאינן שהצטברו העלים שלו.

בעבודה זו, אנו מתארים את ההשוואה בין שתי מערכות צמח אכיל, סלק אדום (בטא דלקתית קורות חיים Moulin Rouge) ותרד (Spinacea הבר קורות חיים תעשייה), עבור הביטוי של שתי צורות המועמד איזופורם 65 kDa חומצה גלוטמית decarboxylase (GAD65), בוצע על ידי המפעל מבוסס-וירוס המומנט5. GAD65 autoantigen העיקריים הקשורים לסוכרת סוג 1 (T1D) וזה כרגע תחת חקירה בניסויים קליניים אנושי כדי למנוע או לעכב את T1D על ידי גרימת רגישות6. הייצור של GAD65 בצמחים בהרחבה נחקרה במין צמח מודל כמו טבק tabacum ו- benthamiana (ש ע)4,5,6,7. כאן, אנו מתארים את השימוש מיני צמחים אכילים לייצור המולקולה ברקמות זה הכוונה על משלוח אוראלי ישירה. מנקודת מבט טכנית, אנחנו למד ונבחר את המערכת עבור הצמח agroinfiltration ואת פלטפורמת צמח אכיל לייצור GAD65 על-ידי הערכת פרמטרים שונים: רמות הביטוי חלבון רקומביננטי, החיוב מיקרוביאלי שיורית בצמח רקמות מיועד משלוח אוראלי, ההתנגדות של GAD65 כדי עיכול קיבה ולאחר את אקוויוולנטיות של הצמחים טרנספורמציה עם סוג הפרוע.

Protocol

1. אדום טיפוח סלק ותרד לגדל סלק אדום (דרב דלקתית קורות חיים Moulin Rouge) ותרד (ס הבר קורות חיים Industria) צמחים כדורים צמיחה, באמצעות µE 150 של עוצמת האור, 65% לחות יחסית, 12 h/כהה מחזור ב 23/21 ° C, בהתאמה. לאחר נביטת הזרעים, לדשן את הצמחים פעמיים בשבוע עם פתרון 1 g/L של דשן זמין מסחרית (טבל…

Representative Results

בעבודה זו, מוצג את זרימת העבודה עבור הפיתוח של חיסון אוראלי ברקמות הצמח אכיל. המוקד של עבודה זו היא הביטוי של חלבון המטרה זן צמח אכיל מארח אפיון חיסון אוראלי פוטנציאליים. הצעד הראשון מעורב הערכת ההתאמה של הטכנולוגיה מבוססת-וירוס הביטוי צמ…

Discussion

במחקר זה הראינו ניתוח ראשוני על עיצוב האתר של חיסון אוראלי מועמד לטיפול בסוכרת אוטואימונית. החלבון היעד עבור ניסוי זה היה בצורת מוטציה kDa 65 בני אדם Decarboxylase גלוטמט, אשר ייצור ופונקציונליות הם לזיהוי בקלות וניתנת למדידה12. הביטוי שלה ברקמות צמח מאכל שונים הייתה מתווכת על-ידי וקטו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט המשותף “שימוש בצמחים לייצור חיסון אכיל סוכרת אוטואימונית (eDIVA)” (מזהה הפרוייקט: 891854) ממומן על ידי האוניברסיטה של ורונה, במסגרת השיחה 2014.

Materials

0.2-μm Minisart RC4 membrane filters Sartorius-Stedim 17764
2–mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma M8250 pH 5.5
96-well plate Sarstedt 833924
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade Sigma 34967
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate Sigma 70221
Anti-eGFP antibody ABCam ab290
Anti-GAD 65/67 antibody Sigma G5163
Anti-LHCB2 antibody Agrisera AS01 003
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
C18 Column Grace    – Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column Grace    – Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower Peter Excel 15-5-15 Fertilizer
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Chemiluminescence imaging system BioRad 1708370 ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform Sigma C2432
Detergent Sigma P5927 Polysorbate 20
Fluorescence reader Perkin-Elmer  1420-011 VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade Sigma 94318
Glycerol Sigma G5516 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase Promega M7841
HCl Sigma H1758 Corrosive
HILIC Column Grace    – Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column Grace    – Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler Beckman Coulter    – System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter    – System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol Sigma 24137 Flamable
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
KCl Sigma P9541 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4 Sigma P9791 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution Ge Healthcare RPN2232 Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator 5Pascal LIO5P0000DGT
Mass Spectometer Bruker Daltonics   – Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol Sigma 32213
MgSO4 Sigma M7506
Milk-blocking solution Ristora    – 3 % in PBS
Na2HPO4 Sigma S7907 Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl Sigma S3014 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4 Sigma S8282  Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH Sigma S8045
Nitrocellulase membrane Ge Healthcare 10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7000
Peroxidase substrate ECL GE Healthcare RPN2235 Light sensitive material
Pump Vacuum Press VWR 111400000098
Reagent A Sigma B9643 Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B Sigma B9643 Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite Sigma 7681-57-4
Sonicator system Soltec 090.003.0003 Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe Terumo    –
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes Thermo Scientific 11573680
Trizma Base Sigma T1503 Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone Formedium TRP03 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator Heto 3878 F1-3 Speed-vac System
Water LC-MS grade Sigma 39253
Yeast extract Sigma Y1333 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade

References

  1. Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
  2. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
  3. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  4. Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?. Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
  5. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
  6. Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
  7. Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
  8. Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
  9. Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
  10. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
  11. Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
  12. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
  13. Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, (2005).
  14. Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
  15. . Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015)
  16. Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
  17. Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
  18. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447, 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, (2017).

Play Video

Cite This Article
Santoni, M., Bertini, E., Zampieri, R., Cuccurullo, A., Commisso, M., Gecchele, E., Avesani, L. Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes. J. Vis. Exp. (145), e59298, doi:10.3791/59298 (2019).

View Video