ארעי ביטוי סלק אדום של חיסון ביולוגיות המועמד לסוכרת מסוג 1

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מועמד חיסון אוראלי נגד סוכרת מסוג 1 במפעל אכיל.

Abstract

הצמח בחקלאות מולקולרי הוא השימוש של צמחים כדי לייצר מולקולות של עניין. בפרספקטיבה הזו, צמחים עשוי לשמש הן ריאקטורים על ההפקה ועל טיהור עוקבות של המוצר הסופי, למסירה אוראלי ישירה של חלבונים heterologous בעת שימוש מיני צמחים אכילים. בעבודה זו, אנו מציגים הפיתוח של חיסון אוראלי המועמד נגד סוכרת סוג 1 (T1D) מערכות צמח אכיל בעזרת טכנולוגיה מבוססת-וירוס דנ א רקומביננטי צמח המפורקים, הנכללת הסתננות ואקום. התוצאות שלנו מראים כי סלק אדום פונדקאי מתאים לביטוי ארעית autoantigen נגזר האנושי קשור T1D, נחשב מועמד מבטיח כמו חיסון T1D. עלים לייצר את autoantigen מאופיינים ביסודיות שלהם עמידות עיכול קיבה, נוכחות של מטען חיידקי שיורית, שלהם פרופיל מטבולי המשני, נותן סקירה כללית של תהליך הייצור לשימוש פוטנציאלי הצמחים עבור משלוח אוראלי ישירה של חלבון heterologous. הניתוח שלנו הראה השפלה כמעט מוחלטת של המועמד הליחה חיסון אוראלי בעקבות עיכול קיבה מדומה, רומז כי אסטרטגיית כימוס בייצור של החיסון גד הצמחי נדרש.

Introduction

מאז המהפכה ביולוגיה מולקולרית צמח בשנות ה-80, מערכות מבוססות-מפעל לייצור ביופרמצבטיקה יכול להיחשב כאלטרנטיבה למערכות מסורתית המבוססת על חיידקים בתרבית של תאים¹. צמחים להציג כמה יתרונות על פני פלטפורמות מסורתי, עם מדרגיות, עלות האפקטיביות והבטיחות להיות הרלוונטיים ביותר². המוצר רקומביננטי ניתן לטהר מרקמות הצמח טרנספורמציה, ואז מנוהל, גם parenterally או בעל פה, יתר על כן, צמח מאכל טרנספורמציה ניתן להשתמש ישירות עבור משלוח אוראלי. תוואי אוראלי בו זמנית מקדם חסינות הרירית ומערכתית, זה מבטל את הצורך של מחטים וצוותים רפואיים מיוחדים. יתר על כן, משלוח אוראלי מבטלת את העיבוד במורד הזרם מורכבים, עובייה בד כ 80% של העלות הייצור הכולל של חלבון רקומביננטי³. כל היתרונות הללו יכול להיות מתורגם חסכון בעלויות ייצור, אספקה, העבודה הפחתת העלויות של כל מנה, לבצע את התרופה במחיר נוח רוב האוכלוסייה הכללית.

מספר אסטרטגיות, הן עבור שינוי יציב, ביטוי ארעי, פותחו לייצור של חומרים בצמחים. ביניהם, מערכת מבוססת-וירוס הביטוי צמח המפורקים תשואה גבוהה (למשל, magnICON) מספק ביצועים מעולים מובילים תפוקה גבוהה של חומרים על צירי זמן קצר יחסית⁴. דוגמאות רבות של ביטוי ארעי באמצעות מערכת מבוססת-וירוס הביטוי צמח בצמחים benthamiana טבק ידווחו, להיות המארח ייצור תקן הזהב. עם זאת, צמח מודל זה לא נחשב זן אכיל בשל של אלקלואידים אחרים מטבוליטים רעילים שאינן שהצטברו העלים שלו.

בעבודה זו, אנו מתארים את ההשוואה בין שתי מערכות צמח אכיל, סלק אדום (בטא דלקתית קורות חיים Moulin Rouge) ותרד (Spinacea הבר קורות חיים תעשייה), עבור הביטוי של שתי צורות המועמד איזופורם 65 kDa חומצה גלוטמית decarboxylase (GAD65), בוצע על ידי המפעל מבוסס-וירוס המומנט⁵. GAD65 autoantigen העיקריים הקשורים לסוכרת סוג 1 (T1D) וזה כרגע תחת חקירה בניסויים קליניים אנושי כדי למנוע או לעכב את T1D על ידי גרימת רגישות⁶. הייצור של GAD65 בצמחים בהרחבה נחקרה במין צמח מודל כמו טבק tabacum ו- benthamiana (ש ע)^4,5,6,7. כאן, אנו מתארים את השימוש מיני צמחים אכילים לייצור המולקולה ברקמות זה הכוונה על משלוח אוראלי ישירה. מנקודת מבט טכנית, אנחנו למד ונבחר את המערכת עבור הצמח agroinfiltration ואת פלטפורמת צמח אכיל לייצור GAD65 על-ידי הערכת פרמטרים שונים: רמות הביטוי חלבון רקומביננטי, החיוב מיקרוביאלי שיורית בצמח רקמות מיועד משלוח אוראלי, ההתנגדות של GAD65 כדי עיכול קיבה ולאחר את אקוויוולנטיות של הצמחים טרנספורמציה עם סוג הפרוע.

Protocol

1. אדום טיפוח סלק ותרד לגדל סלק אדום (דרב דלקתית קורות חיים Moulin Rouge) ותרד (ס הבר קורות חיים Industria) צמחים כדורים צמיחה, באמצעות µE 150 של עוצמת האור, 65% לחות יחסית, 12 h/כהה מחזור ב 23/21 ° C, בהתאמה. לאחר נביטת הזרעים, לדשן את הצמחים פעמיים בשבוע עם פתרון 1 g/L של דשן זמין מסחרית (טבל…

Representative Results

בעבודה זו, מוצג את זרימת העבודה עבור הפיתוח של חיסון אוראלי ברקמות הצמח אכיל. המוקד של עבודה זו היא הביטוי של חלבון המטרה זן צמח אכיל מארח אפיון חיסון אוראלי פוטנציאליים. הצעד הראשון מעורב הערכת ההתאמה של הטכנולוגיה מבוססת-וירוס הביטוי צמ…

Discussion

במחקר זה הראינו ניתוח ראשוני על עיצוב האתר של חיסון אוראלי מועמד לטיפול בסוכרת אוטואימונית. החלבון היעד עבור ניסוי זה היה בצורת מוטציה kDa 65 בני אדם Decarboxylase גלוטמט, אשר ייצור ופונקציונליות הם לזיהוי בקלות וניתנת למדידה¹². הביטוי שלה ברקמות צמח מאכל שונים הייתה מתווכת על-ידי וקטו…

Materials

0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	–	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	–	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	–	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	–	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	–	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	–	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	–	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	–	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	–
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade