Изоляция и окрашивание мыши кожи кератиноцитов для клеточного цикла Специфический анализ выражения клеточного белка массой цитометрии
Summary
Этот протокол описывает, как изолировать кератиноциты кожи от моделей мыши, пятно с металлическими помеченными антителами, и анализировать окрашенные клетки массой цитометрии, чтобы профилировать экспрессионную модель белков, представляющих интерес в различных фазах клеточного цикла.
Abstract
Целью этого протокола является обнаружение и количественное определение изменений экспрессии белка в зависимости от клеточного цикла с использованием одиночных клеток, выделенных из эпидермиса мышиной кожи. Есть семь важных шагов: отделение эпидермиса от дермы, переваривание эпидермиса, окрашивание популяций эпидермальных клеток цисплатином, проба баркодирования, окрашивание металлическими помеченными антителами для маркеров клеточного цикла и белков интерес, обнаружение металлических антител с помощью массовой цитометрии и анализ экспрессии в различных фазах клеточного цикла. Преимуществом этого подхода над гистологическими методами является возможность анализировать шаблон выражения в одной клетке на разных этапах клеточного цикла. Этот подход также позволяет многовариантный анализ корреляции экспрессии белка, что является более количественной, чем гистологические / методы визуализации. Недостатком этого протокола является то, что приостановка одиночных клеток необходима, что приводит к потере информации о местоположении, предоставляемой окрашиванием секций тканей. Такой подход может также потребовать включения дополнительных маркеров для определения различных типов клеток в сырых суспензиях клеток. Применение этого протокола проявляется в анализе моделей гиперпластических кожных заболеваний. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для анализа конкретных подтипов клеток (например, стволовых клеток) путем добавления линейных антител. Этот протокол также может быть адаптирован для анализа клеток кожи у других экспериментальных видов.
Introduction
Корреляция экспрессии генов с стадиями клеточного цикла остается проблемой при анализе моделей животных гиперпластических заболеваний, таких как рак. Частью этой проблемы является совместное обнаружение белков, представляющих интерес (POI) с маркерами распространения. Пролиферативные клетки могут быть найдены в различных фазах клеточного цикла, включая G1, S, G2 и M. Ki67 является одним из наиболее часто используемых маркеров распространения и выражается во всех фазах клеточного цикла. Он широко используется в анализе как человеческих,так и мышей тканей 1,2,3. Однако, как и другие общие маркеры распространения, Ki67 не различить отдельные фазы цикла клеток. Более точный подход использует включение аналогов тимидина нуклеотида, таких как Bromodeoxyuridine (BrdU) в клетки, которые активно реплицируют их геном (т.е. S-фаза)4,5. Одним из недостатков использования нуклеотидных аналогов является необходимость введения их живым животным за несколько часов до анализа. Ki67 и BrdU обычно обнаруживаются на стационарных участках ткани с помощью антител. Одним из преимуществ такого подхода является то, что расположение POIs может быть установлено в архитектуре тканей (например, базальный слой эпидермиса кожи). Этот подход также не требует диссоциации тканей, что может привести к изменениям в экспрессии генов. Одним из недостатков является то, что фиксация тканей или обработка ткани для OCT замороженных или парафинов секции может окклюзии антитела целей (т.е. антигены). Извлечение антигенов обычно требует тепла или пищеварения тканей. Количественная оценка окрашивания интенсивности также может быть сложной задачей. Это связано с изменениями в окрашивании, толщине секций, обнаружении сигнала и предвзятости экспериментатора. Кроме того, ограниченное количество маркеров может быть обнаружено одновременно в наиболее типичных лабораторных установках. Тем не менее, новые мультиплексные подходы к окрашиванию обещают преодолеть эти ограничения; примерами являются визуализация массовой цитометриии усиливаем сигнала тирамид6,7.
Цитометрия потока является еще одной мощной технологией для обнаружения размножающихся клеток. Это позволяет мультиплекс обнаружения маркеров в тех же клетках, но требует диссоциации тканей для большинства негематопоиетических типов клеток. Анализ размножающихся клеток обычно осуществляется с помощью красителей, которые связывают ДНК (например, Propidium Iodide (PI))8. Цитометрия потока также позволяет более точное определение фаз клеточного цикла всочетании с обнаружением регистрации BrdU 9. Хотя мощный подход, BrdU / PI потока цитометрии имеет свои недостатки. Он не в состоянии решить G2/M и G0/G1 фазы без включения фазовых антител. Однако количество антител, которые могут быть использованы, ограничено клеточной ауфлуоресценцией, спектральным распространением выбросов фторрора и использованием компенсационного контроля. Это ограничение отмечает более сложным и трудоемким совместное обнаружение выражения маркеров клеточного цикла с помощью POIs. Более поверхностный подход заключается в использовании массовой цитометрии10,11. Эта технология использует металлические конъюгированные антитела, которые имеют более узкий спектр обнаружения. Как только клетки окрашиваются металлическими антителами, они испаряются, а металлы обнаруживаются масс-спектрометрией цитометрии (CyTOF). Благодаря этим свойствам, массовая цитометрия позволяет мультиплекс ночлегобнаружения йgt;40 различных маркеров с использованием существующих платформ10,11. Кроме того, можно проб штрих-кодов с металлами, которые приводят к экономии драгоценных антител при одновременном снижении вариабельности окрашивания образца к образцу. С другой стороны, массовая цитометрия имеет несколько недостатков. Существует ограниченное число коммерчески доступных металлических антител для некровных клеток. Количественная оценка содержания ДНК менее чувствительна по сравнению с использованием флуоресцентных красителей ДНК, а массовая цитометрия имеет уменьшенный динамический диапазон обнаружения сигналов по сравнению с цитометрией потока флуоресценции.
Описанный здесь протокол был разработан для анализа динамики клеточного цикла от недавно изолированных кератиноцитов (KCs) из кожи мыши и характеристики специфического экспрессии белка клеточного цикла в этих клетках с помощью массовой цитометрии. Этот протокол также может быть использован с культивируемыми ячейками или адаптирован к другим типам клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, изложенный в настоящем документе, может быть завершен примерно за 8 ч. Конечным результатом является приостановление клеток, обогащенных в KCs, которые могут быть проанализированы для экспрессии белка в клеточном цикле-зависимым образом. Несколько предыдущих исследований изл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержка этой работы пришла из Департамента дерматологии, Гейтс Центр регенеративной медицины в Университете Колорадо и Университета Колорадо (UC) Кожных заболеваний центр морфологии и фенотипипинговых корей (NIAMS P30 AR057212). Авторы признают UC онкологический центр потока Цитометрии Общие ресурсы и поддержку гранта (NCI P30 CA046934) для работы массового цитометра и благодарны за Карен Хелм и Кристин Чайлдс в центре за их экспертные советы по потоку и массового цитометрического Методы.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
