Summary

Изоляция и окрашивание мыши кожи кератиноцитов для клеточного цикла Специфический анализ выражения клеточного белка массой цитометрии

Published: May 09, 2019
doi:

Summary

Этот протокол описывает, как изолировать кератиноциты кожи от моделей мыши, пятно с металлическими помеченными антителами, и анализировать окрашенные клетки массой цитометрии, чтобы профилировать экспрессионную модель белков, представляющих интерес в различных фазах клеточного цикла.

Abstract

Целью этого протокола является обнаружение и количественное определение изменений экспрессии белка в зависимости от клеточного цикла с использованием одиночных клеток, выделенных из эпидермиса мышиной кожи. Есть семь важных шагов: отделение эпидермиса от дермы, переваривание эпидермиса, окрашивание популяций эпидермальных клеток цисплатином, проба баркодирования, окрашивание металлическими помеченными антителами для маркеров клеточного цикла и белков интерес, обнаружение металлических антител с помощью массовой цитометрии и анализ экспрессии в различных фазах клеточного цикла. Преимуществом этого подхода над гистологическими методами является возможность анализировать шаблон выражения в одной клетке на разных этапах клеточного цикла. Этот подход также позволяет многовариантный анализ корреляции экспрессии белка, что является более количественной, чем гистологические / методы визуализации. Недостатком этого протокола является то, что приостановка одиночных клеток необходима, что приводит к потере информации о местоположении, предоставляемой окрашиванием секций тканей. Такой подход может также потребовать включения дополнительных маркеров для определения различных типов клеток в сырых суспензиях клеток. Применение этого протокола проявляется в анализе моделей гиперпластических кожных заболеваний. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для анализа конкретных подтипов клеток (например, стволовых клеток) путем добавления линейных антител. Этот протокол также может быть адаптирован для анализа клеток кожи у других экспериментальных видов.

Introduction

Корреляция экспрессии генов с стадиями клеточного цикла остается проблемой при анализе моделей животных гиперпластических заболеваний, таких как рак. Частью этой проблемы является совместное обнаружение белков, представляющих интерес (POI) с маркерами распространения. Пролиферативные клетки могут быть найдены в различных фазах клеточного цикла, включая G1, S, G2 и M. Ki67 является одним из наиболее часто используемых маркеров распространения и выражается во всех фазах клеточного цикла. Он широко используется в анализе как человеческих,так и мышей тканей 1,2,3. Однако, как и другие общие маркеры распространения, Ki67 не различить отдельные фазы цикла клеток. Более точный подход использует включение аналогов тимидина нуклеотида, таких как Bromodeoxyuridine (BrdU) в клетки, которые активно реплицируют их геном (т.е. S-фаза)4,5. Одним из недостатков использования нуклеотидных аналогов является необходимость введения их живым животным за несколько часов до анализа. Ki67 и BrdU обычно обнаруживаются на стационарных участках ткани с помощью антител. Одним из преимуществ такого подхода является то, что расположение POIs может быть установлено в архитектуре тканей (например, базальный слой эпидермиса кожи). Этот подход также не требует диссоциации тканей, что может привести к изменениям в экспрессии генов. Одним из недостатков является то, что фиксация тканей или обработка ткани для OCT замороженных или парафинов секции может окклюзии антитела целей (т.е. антигены). Извлечение антигенов обычно требует тепла или пищеварения тканей. Количественная оценка окрашивания интенсивности также может быть сложной задачей. Это связано с изменениями в окрашивании, толщине секций, обнаружении сигнала и предвзятости экспериментатора. Кроме того, ограниченное количество маркеров может быть обнаружено одновременно в наиболее типичных лабораторных установках. Тем не менее, новые мультиплексные подходы к окрашиванию обещают преодолеть эти ограничения; примерами являются визуализация массовой цитометриии усиливаем сигнала тирамид6,7.

Цитометрия потока является еще одной мощной технологией для обнаружения размножающихся клеток. Это позволяет мультиплекс обнаружения маркеров в тех же клетках, но требует диссоциации тканей для большинства негематопоиетических типов клеток. Анализ размножающихся клеток обычно осуществляется с помощью красителей, которые связывают ДНК (например, Propidium Iodide (PI))8. Цитометрия потока также позволяет более точное определение фаз клеточного цикла всочетании с обнаружением регистрации BrdU 9. Хотя мощный подход, BrdU / PI потока цитометрии имеет свои недостатки. Он не в состоянии решить G2/M и G0/G1 фазы без включения фазовых антител. Однако количество антител, которые могут быть использованы, ограничено клеточной ауфлуоресценцией, спектральным распространением выбросов фторрора и использованием компенсационного контроля. Это ограничение отмечает более сложным и трудоемким совместное обнаружение выражения маркеров клеточного цикла с помощью POIs. Более поверхностный подход заключается в использовании массовой цитометрии10,11. Эта технология использует металлические конъюгированные антитела, которые имеют более узкий спектр обнаружения. Как только клетки окрашиваются металлическими антителами, они испаряются, а металлы обнаруживаются масс-спектрометрией цитометрии (CyTOF). Благодаря этим свойствам, массовая цитометрия позволяет мультиплекс ночлегобнаружения йgt;40 различных маркеров с использованием существующих платформ10,11. Кроме того, можно проб штрих-кодов с металлами, которые приводят к экономии драгоценных антител при одновременном снижении вариабельности окрашивания образца к образцу. С другой стороны, массовая цитометрия имеет несколько недостатков. Существует ограниченное число коммерчески доступных металлических антител для некровных клеток. Количественная оценка содержания ДНК менее чувствительна по сравнению с использованием флуоресцентных красителей ДНК, а массовая цитометрия имеет уменьшенный динамический диапазон обнаружения сигналов по сравнению с цитометрией потока флуоресценции.

Описанный здесь протокол был разработан для анализа динамики клеточного цикла от недавно изолированных кератиноцитов (KCs) из кожи мыши и характеристики специфического экспрессии белка клеточного цикла в этих клетках с помощью массовой цитометрии. Этот протокол также может быть использован с культивируемыми ячейками или адаптирован к другим типам клеток.

Protocol

Комитет по институциональному уходу и использованию животных Медицинского кампуса университета Колорадо Аншутц одобрил эксперименты на животных, описанные в этом протоколе. 1. Подготовка Дизайн металлических помеченных антитела панели. Используйте бесплатное пр…

Representative Results

Таблица 1 показывает ожидаемые выходы клеток и жизнеспособность от взрослого мышле(рисунок1) и неонатальной кожи в непатологических условиях. В таблице также показаны репрезентативные данные животных со смешанного фона C57/126. Ожидается, что ко…

Discussion

Протокол, изложенный в настоящем документе, может быть завершен примерно за 8 ч. Конечным результатом является приостановление клеток, обогащенных в KCs, которые могут быть проанализированы для экспрессии белка в клеточном цикле-зависимым образом. Несколько предыдущих исследований изл?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Поддержка этой работы пришла из Департамента дерматологии, Гейтс Центр регенеративной медицины в Университете Колорадо и Университета Колорадо (UC) Кожных заболеваний центр морфологии и фенотипипинговых корей (NIAMS P30 AR057212). Авторы признают UC онкологический центр потока Цитометрии Общие ресурсы и поддержку гранта (NCI P30 CA046934) для работы массового цитометра и благодарны за Карен Хелм и Кристин Чайлдс в центре за их экспертные советы по потоку и массового цитометрического Методы.

Materials

12-well plate Cell Treat 229512
Intercalator solution Fluidigm 201192A 125 µM – Ir intercalator solution
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4 16 %  PFA
Strainer cap flow tubes Fisher/Corning 352235 35 µm pore size 
Cell sieve Fisher 22363547 40 μm pore size 
Cell detatchment solution CELLnTEC CnT-ACCUTASE-100 Accutase
Iodine Solution ThermoFisher/Purdue 67618-151-17 Betadine 7.5%-iodine surgical scrub
Barcode permeabilization buffer  Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Barcodes Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH strips EMD 9590 colorpHast
DMEM Hyclone SH30022.01 Dulbecco’s Modified Eagle Media
Fine forceps Dumont & Fils 0109-5-PO Dumostar #5
Curved precision forceps Dumont & Fils 0109-7-PO Dumostar #7
Calibration Beads Fluidigm 201078 EQ Four Element Calibration Beads
HBSS Gibco 14175-095 Hank's Balanced Salt Solution
Water Fisher SH30538.03 Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine  Sigma I7125 IdU
Cryo vials ThermoFisher 366656PK internal thread
Cell Staining buffer Fluidigm 201068 Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Perm buffer Fluidigm 201067 Maxpar Fix & Perm buffer
Fix I buffer Fluidigm 201065 Maxpar Fix I buffer
Phosphate buffered saline Rockland MB-008 Metal free 10x PBS
isopropanol-freezing container ThermoFisher 5100-0001 Mr.Frosty
Sodium hydroxide Fisher BP359-500 NaOH
Petri dish Kord-Valmark 2900 Supplied by Genesee 32-107 
15 mL conical Olympus/Genesee 28-101
50 mL conical Olympus/Genesee 28-106
6-well plate Cell Treat 229506
Cisplatin Sigma 479306
Dispase II Sigma/Roche 4942078001
DMSO Sigma D2650
FBS Atlanta Biologicals S11150
Hydrochloric acid Fisher A144-212
Nuclear Antigen Staining  permeabilization buffer Fluidigm 201063
Nuclear Antigen Staining buffer Fluidigm 201063
Trypan blue Sigma T8154
Tuberculin syringe BD 309626
Type IV Collagenase  Worthington Bioscience CLSS-4

References

  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  8. Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
  9. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  10. Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
  12. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  13. Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
  14. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
  15. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  16. Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
  17. Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  18. Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
  19. Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  20. Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
  21. Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
  22. Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
  23. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  24. Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  25. Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
  26. Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
  27. Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
  28. Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).

Play Video

Cite This Article
Fernandez, J., Torchia, E. C. Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59353, doi:10.3791/59353 (2019).

View Video