Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Hautkeratinozyten von Mausmodellen isoliert werden, mit metallmarkierten Antikörpern gefärbt werden und wie man gefärbte Zellen durch Massenzytometrie analysiert, um das Expressionsmuster von Proteinen zu profilieren, die in den verschiedenen Zellzyklusphasen von Interesse sind.
Abstract
Ziel dieses Protokolls ist es, Proteinexpressionsänderungen auf zellzyklusabhängige Weise mithilfe einzelner Zellen zu erkennen und zu quantifizieren, die von der Epidermis der Maushaut isoliert sind. Es gibt sieben wichtige Schritte: Trennung der Epidermis von der Dermis, Verdauung der Epidermis, Färbung der epidermalen Zellpopulationen mit Cisplatin, Proben-Barcoding, Färbung mit metallmarkierten Antikörpern für Zellzyklusmarker und Proteine von Interesse, Detektion von metallmarkierten Antikörpern durch Massenzytometrie und die Analyse der Expression in den verschiedenen Zellzyklusphasen. Der Vorteil dieses Ansatzes gegenüber histologischen Methoden ist das Potenzial, das Expressionsmuster von >40 verschiedenen Markern in einer einzelnen Zelle in verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu assayen. Dieser Ansatz ermöglicht auch die multivariate Korrelationsanalyse der Proteinexpression, die quantifizierbarer ist als histologische/bildgebende Verfahren. Der Nachteil dieses Protokolls ist, dass eine Suspension einzelner Zellen erforderlich ist, was zum Verlust von Standortinformationen führt, die durch die Färbung von Gewebeabschnitten bereitgestellt werden. Dieser Ansatz kann auch die Aufnahme zusätzlicher Marker erfordern, um verschiedene Zelltypen in Rohzellsuspensionen zu identifizieren. Die Anwendung dieses Protokolls zeigt sich in der Analyse von hyperplastischen Hautkrankheitsmodellen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Analyse bestimmter Untertypen von Zellen (z. B. Stammzellen) durch Zugabe von linienspezifischen Antikörpern angepasst werden. Dieses Protokoll kann auch für die Analyse von Hautzellen in anderen Versuchsarten angepasst werden.
Introduction
Die Korrelation der Genexpression mit den Zellzyklusstadien bleibt eine Herausforderung bei der Analyse von Tiermodellen hyperplastischer Krankheiten wie Krebs. Ein Teil dieser Herausforderung ist die Ko-Detektion von Proteinen von Interesse (POI) mit Markern der Proliferation. Proliferative Zellen können in verschiedenen Zellzyklusphasen einschließlich G1, S, G2 und M gefunden werden. Ki67 ist einer der am häufigsten verwendeten Marker der Proliferation und wird in allen Phasen des Zellzyklus exprimiert. Es wurde ausgiebig in der Analyse von menschlichen und Mausgewebe1,2,3verwendet. Jedoch, wie andere allgemeine Proliferation Marker, Ki67 erkennt nicht einzelne Zellzyklusphasen. Ein präziserer Ansatz nutzt die Einbeziehung von Thymidin-Nukleotid-Analogen wie Bromodeoxyuridin (BrdU) in Zellen, die ihr Genom aktiv replizieren (d.h. S-Phase)4,5. Ein Nachteil der Verwendung von Nukleotid-Analoga ist die Notwendigkeit, sie lebenden Tieren Stunden vor der Analyse zu verabreichen. Ki67 und BrdU werden häufig auf festen Gewebeabschnitten durch die Verwendung von Antikörpern nachgewiesen. Ein Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die Position von POIs innerhalb der Gewebearchitektur (z. B. der Basalschicht der Hautepidermis) ermittelt werden kann. Dieser Ansatz erfordert auch keine Gewebedissoziation, die zu Veränderungen in der Genexpression führen kann. Ein Nachteil ist, dass die Gewebefixierung oder die Verarbeitung des Gewebes für OCT eingefroren oder Paraffin-Sektion kann Antikörper-Ziele (d. h. Antigene) okkludieren. Die Rückgewinnung von Antigenen erfordert in der Regel Wärme- oder Gewebeverdauung. Die Quantifizierung der Färbeintensitäten kann ebenfalls eine Herausforderung darstellen. Dies ist auf Variationen in Färbung, Schnittdicke, Signalerkennung und Experimentierverzerrung zurückzuführen. Darüber hinaus kann eine begrenzte Anzahl von Markern gleichzeitig in den meisten typischen Labor-Setups nachgewiesen werden. Doch neuere Multiplex-Färbungsansätze versprechen, diese Einschränkungen zu überwinden; Beispiele sind bildgebende Massenzytometrie und Tyramid-Signalverstärkung6,7.
Die Durchflusszytometrie ist eine weitere leistungsstarke Technologie zur Erkennung von sich ausbreitenden Zellen. Es ermöglicht die Multiplex-Erkennung von Markern in den gleichen Zellen, erfordert aber Gewebedissoziation für die meisten nicht-hämatopoetischen Zelltypen. Die Analyse von vermehrenden Zellen erfolgt routinemäßig durch die Verwendung von Farbstoffen, die DNA binden (z.B. Propidium Iodid (PI))8. Die Durchflusszytometrie ermöglicht auch eine genauere Bestimmung der Zellzyklusphasen in Verbindung mit dem Nachweis der BrdU-Inkorporation9. Obwohl ein leistungsstarker Ansatz, BrdU / PI Durchflusszytometrie hat seine Nachteile. Es ist nicht in der Lage, die G2/M- und G0/G1-Phasen ohne die Einbeziehung phasenspezifischer Antikörper zu lösen. Die Anzahl der Antikörper, die verwendet werden können, wird jedoch durch zelluläre Autofluoreszenz, spektrales Ausstrahlung von Fluorophoremissionen und die Verwendung von Kompensationskontrollen begrenzt. Diese Einschränkung markiert es schwieriger und mühsamer, die Expression von Zellzyklusmarkern mit POIs zu erkennen. Ein leichterer Ansatz ist die Verwendung von Massenzytometrie10,11. Diese Technologie verwendet metallkonjugierte Antikörper, die ein schmaleres Detektionsspektrum haben. Sobald Zellen mit metallgetaggten Antikörpern gefärbt sind, werden sie verdampft und die Metalle durch Cytometrie-Zeit-of-Flight (CyTOF)-Massenspektrometrie nachgewiesen. Aufgrund dieser Eigenschaften ermöglicht die Massenzytometrie die Multiplexerkennung von >40 verschiedenen Markern mit vorhandenen Plattformen10,11. Darüber hinaus ist es möglich, Barcode-Proben mit Metallen, die in der Einsparung von wertvollen Antikörpern führen, während Die Proben-zu-Probe-Färbungvariabilität reduziert wird. Auf der anderen Seite hat die Massenzytometrie mehrere Nachteile. Es gibt eine begrenzte Anzahl von handelsüblichen metallmarkierten Antikörpern für nicht blutbildende Zellen. Die Quantifizierung des DNA-Gehalts ist im Vergleich zur Verwendung fluoreszierender DNA-Farbstoffe weniger empfindlich, und die Massenzytometrie hat einen reduzierten Dynamikbereich der Signaldetektion im Vergleich zur Fluoreszenzflusszytometrie.
Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die Zellzyklusdynamik von neu isolierten Keratinozyten (KCs) aus der Maushaut zu analysieren und die zellzyklusspezifische Proteinexpression in diesen Zellen mittels Massenzytometrie zu charakterisieren. Dieses Protokoll kann auch mit kultivierten Zellen verwendet oder an andere Zelltypen angepasst werden.
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Protocol
Das Institutional Animal Care and Use Committee der University of Colorado Anschutz Medical Campus genehmigte die in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche.
1. Vorbereitungen
- Entwerfen Sie eine mit Metall markierte Antikörperplatte. Nutzen Sie die kostenlose Online-Panel-Design-Software12 und enthalten 127IododeoxyUridin (IdU), 164Dy (Dysprosium) mit Anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) Phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3) und 150 Nd (Neodym)-pRETINOBLASTOMA ProteinSer807/811 (pRB)13. Fügen Sie zusätzliche metallmarkierte Antikörper hinzu, die sich in ihrem Kanalsignal14nicht überlappen.
- Bereiten Sie eine IdU-Lagerlösung vor. IdU-Pulver bei 10 mg/ml in 0,1 N NaOH bei 60 °C auflösen. Aliquot IdU-Lagerlösung in Mikrozentrifugenröhren und gefrieren bei -20 °C zur Langzeitlagerung.
- Stellen Sie den pH-Wert der IdU-Lösung unmittelbar vor Dem Gebrauch auf 7,5 mit 12 N HCl ein. Testen Sie mit einem pH-Streifen auf einem Ablage-Aliquot, um sicherzustellen, dass die Lösung bei pH 7,5 liegt.
HINWEIS: Längere Zeit (>5 min) von IdU bei pH 7,5 führt zu Niederschlägen und ein neuer Aliquot von IdU ist erforderlich, wenn dies geschieht. - Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (z. B. Handschuhe, Labormantel und Schutzbrille) und arbeiten Sie in einem Sicherheitsschrank, wenn Sie Mithaben von NaOH- oder HCl-Lösungen verwenden.
- Stellen Sie den pH-Wert der IdU-Lösung unmittelbar vor Dem Gebrauch auf 7,5 mit 12 N HCl ein. Testen Sie mit einem pH-Streifen auf einem Ablage-Aliquot, um sicherzustellen, dass die Lösung bei pH 7,5 liegt.
- Bereiten Sie eine 2x Paraformaldehyd (PFA) Befestigungslösung vor. Kombinieren Sie 5 ml 10x PBS (pH 7,5) und 1 ml 16% PFA mit 44 ml reinem molekularem Grad dH2O (3,2% Endkonzentration).
HINWEIS: Ein PFA-Bestand kann wie bisherveröffentlicht 15 erstellt werden oder 16% Aktien ohne kontaminierende Metalle kaufen.- Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie in einem Sicherheitsschrank, wenn SIE PFA-Pulver und Lösungen handhaben.
- Barium (Ba2+) frei 1x PBS vorbereiten, indem Sie 5 ml metallfreie 10x PBS (pH 7,5) mit 45 ml reinem molekularem dH2O kombinieren.
HINWEIS: Die Qualität von PBS und anderen Reagenzien ist sehr wichtig, um eine Kontamination von Metallen zu vermeiden, die bei der Analyse von zytometrischen Massendaten Hintergrundgeräusche verursachen können. - Bereiten Sie eine 100 mM Cisplatin-Lagerlösung vor. 300,5 mg Cisplatinpulver in 10 ml DMSO auflösen. In Aliquots bei -80 °C lagern. Bereiten Sie eine 10 mM Cisplatin-Arbeitslösung für Experimente vor, die über 1 d verwendet werden.
- Epidermis/Dermis-Trennungslösungen vorbereiten. Bereiten Sie eine 20x Dispase-Stammlösung vor, indem Sie 30 mg in 1 ml HBSS oder PBS auflösen. Filter durch einen 0,22 m Filter sterilisieren und in Aliquots bei -20 °C lagern. Bereiten Sie eine 1x Typ IV Kollagennase-Lagerlösung bei 1 mg/ml in HBSS vor, filtern Sie sie durch einen 0,22-mm-Filter und lagern Sie Aliquots bei -20 °C.
2. Kennzeichnung der S-Phase durch IdU-Eingemeindung
- Wiegen Sie Mäuse. Verwenden Sie P1-P3 neonatale Welpen oder 8-10 Wochen alte erwachsene Mäuse und männliche oder weibliche Mäuse aus einem C57BL/6, FvB oder 129 Hintergründen. Bestimmen Sie eine Dosis bei 0,1 mg IdU (pH 7,5)/g Körpergewicht. Eine 25 g-Maus benötigt beispielsweise 0,25 ml IdU.
- Verabreichen Sie die Dosis von IdU durch eine intraperitoneale Injektion und warten Sie 2 h, bevor Sie Zellen ernten. Verwenden Sie eine Tuberkulinspritze, um neonatale Welpen zu injizieren.
HINWEIS: Eine Dosis von 2 mg/ml IdU kann mit Gewebekulturzellen mit einer Inkubation von 1 h bei 37 °C vor der Ernte und Etikettierung für Massenzytometrie verwendet werden.
3. Isolierung von Zellen zur Kennzeichnung
- Tauen Dispase und Kollagenase Lagerlösungen. Verdünnen Sie die 20x Dispase-Stammlösung auf 1x (1,5 mg/ml) in sterilen HBSS oder PBS. Auf Eis bleiben, bis es einsatzbereit ist.
- Kombinieren Sie 2 Bände Dispase mit 1 Volumen Kollagenase in einem Gesamtvolumen, das die Haut frei schweben lässt. Zum Beispiel kann die Verdauung von 5 neonatalen Maushäuten auf 8 ml 1x Dispase mit 4 ml Kollagenase in einer 100 mm Petrischale schweben.
- Befolgen Sie zugelassene Methoden zur Einschläferne von Versuchsmäusen (z. B. Isofluran-Überdosierung/Zehen-Pinch-Check oder CO2-Inhalation/Zervixdislokation). Reinigen Sie die erwachsene Ohrhaut mit einer Jodlösung (siehe Materialtabelle)und spülen Sie sie mit sterilem Wasser ab, wenn isolierte Zellen für die Gewebekultur verwendet werden sollen.
- Chirurgische entfernen Sie das Ohr an der Basis (Abbildung 1A). Spülen Sie die Ohren in sterilem PBS, wenn isolierte Zellen für die Gewebekultur verwendet werden sollen. Auf eine trockene 100 mm Petrischale geben.
- Trennen Sie sorgfältig vordervon der hinteren Haut, indem Sie zunächst eine Tasche in der Mitte oder am Rand des Schnittbereichs mit feinen Zangen erstellen und die beiden Hautklappen auseinander ziehen ( Abbildung 1B-D). Fahren Sie sowohl mit den vorderen als auch mit den hinteren Skins fort.
HINWEIS: Detaillierte Anweisungen zur Zerlegung der neonatalen Maushaut werden von Litchi et al.16 Bereitgestellt. Haut: Das Haar ist auf der Epidermisseite sichtbar, während die Dermis ein gelatinöses Aussehen hat. - Legen Sie vorsichtig die vorderen und hinteren Häute des Ohres mit der Dermisseite der Haut, die die Dispase/Kollagenase-Lösung berührt ( Abbildung 1E). Verwenden Sie 1 ml sowohl für die vordere als auch für die hintere Haut eines einzelnen Ohres pro Brunnen einer 12 Brunnenkulturplatte. Bei 37 °C für 1 h inkubieren. Alternativ schwimmen Skins auf 1x Dispaselösung bei 4 °C für 16-18 h.3
HINWEIS: Arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube mit steriler Technik, wenn Zellen kultiviert werden sollen. - Legen Sie die verdaute Haut mit der Epidermisseite, die die Oberfläche einer sauberen Petrischale berührt. Glätten Sie die Haut und schieben Sie die Dermis vorsichtig von der Epidermis, indem Sie in einem kreisförmigen Muster von der Mitte bis zu den Rändern arbeiten.
- Entsorgen Sie die Dermis oder verdauen Sie sie weiter, um Fibroblasten für die Gewebekultur oder Analyse zu befreien16.
HINWEIS: Die Dermis wird dunkler aussehen und eine gelatinöse und klebrige Zusammensetzung haben. Die Dermis sollte leicht abgehen. Ein Versagen oder Schwierigkeiten bei der Entfernung der Dermis deutet auf eine unzureichende Gewebeverdauung hin. Eine erweiterte Inkubation im Verdauungspuffer verringert jedoch die Zelllebensfähigkeit. Die Epidermis bleibt auf der Petrischale und hat ein gebleichtes Aussehen. - Heben Sie die Epidermis vorsichtig ab, indem Sie sie an den Rändern greifen und von der Oberfläche der Petrischale schälen. Die Epidermis vorsichtig auf vorgewärmte Zellablösung (siehe Materialtabelle) für 5 min bei 37 °C oder 20 min bei RT. Verwenden Sie 500 l Zellablösung für 2 erwachsene Ohrepidermisen pro Bohrung einer 12-Well-Kulturplatte und verwenden Sie 750 l Zellablösung Lösung für eine einzelne neonatale Epidermis pro Brunnen einer 6-Well-Kulturplatte.
- Greifen Sie die Epidermis mit sterilen Zangen und Peeling, indem Sie die Epidermis gegen den Boden der Schale ziehen, um Zellen zu dissoziieren. Fügen Sie 1 ml DMEM mit 1% FBS (0,01 ml) hinzu und durchgeben Sie ein 40-m-Zellensieb in ein Sammelrohr. Spülen Sie gut mit einem zusätzlichen 2 ml DMEM und fügen Sie die Zellsuspension hinzu.
- Zentrifuge bei 120 x g für 5 min. Den Überstand vorsichtig ansaugen.
- Zellpellet in 1-2 ml DMEM mit 1% FBS resuspendieren. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen und % der Lebenden Zellen mit Trypan Blue und einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zählgerät. Pelletzellen, wie in Schritt 3.11 beschrieben.
HINWEIS: Zellen können nach Schritt 3.12 in geeigneten Gewebekulturmedien kultiviert werden. 17
4. Cisplatin-Kennzeichnung zur Bestimmung lebender/toter Zellen
- 1-3 x 106 Zellen pro 1 ml DMEM mit 25 M Cisplatin (2,5 l Lager/ml) wieder aufhängen. 1 min inkubieren und durch Pipettieren mit gleichem FBS-Volumen (z.B. 1 ml) abschrecken.
- Zentrifuge bei 120 x g für 5 min. Dekanatsüberstand in ein Becherglas mit verdünnten Bleich- und Inverkübelrohren, um die Restlösung auf ein Papiertuch abzutropfen. Tippen Sie sanft, um die auf Pellet und Seitenwand des Rohres verbleibende Lösung zu befreien.
- Zellpellet in 2 ml Ba+2-freier PBS aufsetzen. Pelletzellen, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
HINWEIS: Es wird empfohlen, Zellen zu fixieren, wenn sie nicht sofort gebeizt werden können.
5. Fixierung von Cisplatin-markierten Zellen (optional)
- 1-3 x 106 cisplatin markierte Zellen in 1 ml Ba+2-freier PBS wieder aufsetzen. Wirbelzellen unter kontinuierlicher geringer Leistung und fügen Tropfen1 ml (1 Volumen) des 2x PFA-Fixationspuffers hinzu. Inkubieren Sie bei RT für 10 min auf einer Schaukelplattform.
- Pelletzellen wie in Schritt 4.2 beschrieben, aber Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
- Waschen Sie Zellen mit 2 ml Ba+2-freier PBS- und Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Wiederholen Sie Schritt 5.3 einmal.
- Das Pellet in 2 ml Ba+2-frei PBS wieder aufhängen. Bei 4°C für <3 d lagern. FBS zu 3% (z. B. 0,3 ml FBS/ml der Zellen) des Gesamtvolumens hinzufügen, wenn längere >3 d gespeichert werden, dann mischen und bei -80 °C einfrieren.
HINWEIS: Die Fixierung kann die Erkennung bestimmter Epitope beeinflussen. Die Auswirkungen der Fixierung auf Antikörpersignale müssen empirisch bestimmt werden.
6. Barkodierung von Proben (optional, aber empfohlen)
- Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben, und dann 1-3 x 106 Zellen in 1 ml 1x Fixationspuffer (siehe Tabelle der Materialien) wieder aussetzen. Inkubieren Sie bei RT für 10 min. Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben.
- Waschen Sie Zellen mit 1 ml Barcode-Permeabilisierungspuffer (siehe Materialtabelle). Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Wiederholen Sie Schritt 6.2 einmal.
- Fügen Sie 100 L Barcode-Permeabilisierungspuffer zu Barcodes hinzu (siehe Tabelle der Materialien)18 und mischen Sie sofort, während die Zellen aus Schritt 6.2 pelletieren.
- Setzen Sie das Zellpellet in 800 l Barcode-Permeabilisationspuffer wieder auf. Fügen Sie Barcode-Lösung zu Zellen, mischen und inkubieren bei RT für 30 min. Pellet-Zellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Waschen Sie Zellen in 2 ml Zellfärbepuffer (siehe Materialtabelle)und pellet wieder.
HINWEIS: Bis zu 20 Proben können mit verschiedenen Kombinationen von Palladiummetallen18beschriftet werden. Andere Barcode-Strategien werden an anderer Stelle beschrieben15.
7. Kennzeichnung von Zellen für Massenzytometrie
- 1-3 x 106 Zellen in 1 ml Kernantigen-Färbungspuffer-Arbeitslösung (siehe Materialtabelle) wieder aufsetzen Kombinieren Sie Proben in einem einzigen Rohr für nachfolgende Schritte, wenn Sie Barcode-Proben verwenden. Inkubieren Bei RT für 30 min. Pellet wie in Schritt 5.2 beschrieben.
- 1-3 x 106 Zellen in 2 ml Kernantigen-Färbungspermeabilisationspuffer wieder aufsetzen (siehe Materialtabelle). Skalierung bei Bedarf. Verwenden Sie beispielsweise 6 ml Puffer für 10 kombinierte Proben mit einer Zellanzahl von 9 x 106 Zellen. Pellet, wie in Schritt 5.2 beschrieben.
- Wiederholen Sie Schritt 7.2. Wirbeln Sie das Zellpellet im Restvolumen, das in der Röhre verbleibt, sanft.
- Fügen Sie 50 l intrazellulären Antikörpercocktail pro 1-3 x 106 Zellen hinzu. Skalierung bei Bedarf. Verwenden Sie z. B. 150 l des Antikörpercocktails für 10 kombinierte Proben mit einer Zellzahl von 9 x 106 Zellen. Mischen und inkubieren bei RT für 45 min. Fügen Sie 2 ml Zellfärbung Puffer und Pellet wie in Schritt 5.2 beschrieben beschrieben.
- 1-3 x 10 6-Zellen-Pellet in 2 ml Zellfärbungspuffer wieder aufhängen. Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Wiederholen Sie Schritt 7.5 einmal.
HINWEIS: Andere Pufferlösungen können zur Färbung der extrazellulären Membran oder zytoplasmatischen Marker verwendet werden, und Experimentatoren müssen möglicherweise die Färbung optimieren, wenn Epitope an verschiedenen zellulären Standorten erkannt werden müssen. Zellen können auch in PFA nach Schritt 7.5 fixiert werden, wenn lebende Zellen für die Färbung verwendet werden. - 1-3 x 106 Zellen in 1 ml Interkalationslösung aufbewahren und 1-3 d bei 4 °C lagern.
- Speichern Sie Zellen bei -80 °C in DMSO, die die Lösung für >3 d. Pelletzellen enthalten, wie in Schritt 5.2 beschrieben, wenn zellen in Interkalationslösung sind. Pellet (1-3 x 106 Zellen) in 1 ml Zellfärbepuffer und Pelletzellen wie in Schritt 5.2 beschrieben resuspendieren. Pellet in 1 ml 10% DMSO/90% FBS19aufsetzen, in einen Isopropanol-Gefrierbehälter geben und bei -80 °C lagern.
- Pelletzellen, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Waschen Sie 1-3 x 106 Zellen mit 2 ml Zellfärbungspuffer, Pelletierung, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Führen Sie zwei zusätzliche Wähen mit 2 ml Wasser durch, wobei das Pelleten wie in Schritt 5.2 beschrieben beschrieben wird.
- Verdünnen Sie EQ-Kalibrierperlen 1:9 in Wasser (Lagerlösung bei 3,3 x 105 Perlen/ml).
- Setzen Sie das Zellpellet in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml mit verdünnter EQ-Perlenlösung wieder auf. Filtern Sie Zellen durch 35 m Siebkappendurchflussrohre.
- Führen Sie Proben auf dem Massenzytometer aus und erfassen Sie Daten. Die Daten werden im Flow Cytometry Standard (FCS)-Dateiformat hinterlegt.
8. Verarbeitung und Analyse von Massenzytometrie-Datendateien
- Normalisieren Sie FCS-Dateien. Nutzen Sie ein kostenloses Programm, das unter https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20 verfügbar ist
- Deconvolute Barcode-FCS-Dateien. Trennen Sie die gepoolte Barcode-Population in separate Barcode-Dateien mit einem kostenlosen Programm, das um18 https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest verfügbar ist.
- Analysieren Sie normalisierte FCS-Dateien. Verwenden Sie kommerzielle21,22 oder Freeware-Programme (siehe web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).
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Representative Results
Tabelle 1 zeigt die erwarteten Zellerträge und lebensfähigkeit von erwachsenen Mausohren (Abbildung 1) und neonataler Haut unter nichtpathologischen Bedingungen. Die Tabelle zeigt auch repräsentative Daten von Tieren mit gemischtem C57/126-Hintergrund. Es wird erwartet, dass die Haut anderer Stämme zu ähnlichen Zellerträgen und Viabilitäten führen würde. Die ungefähre Ausbeute hängt von der Oberfläche der Haut ab und zeigt an, dass neonatale Haut eine bessere Wahl für Experimente wäre, die eine größere Anzahl von Zellen erfordern (Tabelle 1). Geringe Erträge oder geringere Lebensfähigkeit (<50%) Probleme mit der Verdauung oder experimentelle Bedingungen, die die Hautintegrität reduzieren oder den Zelltod induzieren. Culturing Zellen mit geeigneten Medien und Ergänzungen kann helfen, die Qualität der KC-Präparate17zu beurteilen.
Nach der Normalisierung20 und der Dekonvierung18 der FCS-Dateien definiert das Gating der Daten epidermale Zellpopulationen von Interesse und demarkieren einzelne Zellzyklusphasen (Abbildung 2). In bivariaten Diagrammen, die die 191Ir vs 193Ir-Kanäle vergleichen, können intakte Zellen im oberen rechten Quadranten eingezäutt werden (Abbildung 2A). Plotten Sie die Ereignislänge vs. 191Ir und wählen Sie einen engen Cluster von Zellen in der Nähe der 191Ir-Achse, die einzelne Zellen markiert. Lebensfähige Zellen werden in einem Diagramm von 195Pt vs 193Ir-Plot durch Gating für Zellen mit niedrigen 195Pt-Spiegeln ausgewählt. Die in Abbildung 2A gezeigte Probe weist Ablagerungen auf und zeigt Cisplatin als nicht lebensfähige Zellen. Dies kann darauf hindeuten, dass die Probe überverdaut, hart behandelt oder zu lange auf Eis oder RT gelassen wurde, bevor sie für die Massenzytometrie färbte. Profile aus gewebekultivierten Zellen geben in der Regel höhere Prozentsätze von 195Pt negativen Zellen (Abbildung 2B). Alternativ kann das Vorhandensein von 195Pt-positiven Zellen erwartet werden, wenn der Induktionszelltod ein Merkmal des experimentellen Modells und/oder der Bedingungen ist.
Idealerweise sollten Marker, die die Interessenspopulation definieren, in die Analyse bestimmter Zelltypen einbezogen werden. Beispielsweise können Immunzellen, die in rohen KC-Suspensionen vorkommen sollen, durch Zugabe eines CD45 23-Antikörpers nachgewiesen werden, der hämatopoetische Zellen erkennt (Abbildung 2C). In Bezug auf das Proliferationsantikörper-Panel13löst das Plotten IdU vs CYCLIN B1 Zellzyklusphasen auf (Abbildung 2C) ähnlich wie Standard BrdU/PI-Flow-Plot (Abbildung 2D), wodurch die Erkennung von S-Phase-, G0/G1- und G2/M-Zellen ermöglicht wird Bevölkerung. In IdU- vs pHH3-Plots identifiziert eine hohe pHH3-Positivität M-Phasenzellen. Schließlich kann das Gating von G0/G1-Zellen auf hohem pRB-Signal G0 (ruhehaft) von Zellen in G1 unterscheiden (Abbildung 2C, links links).
Nachdem die verschiedenen Zellzyklusphasen identifiziert wurden, ist es dann möglich, eine grafische Darstellung von Zellzyklusprofilen für verschiedene Zelltypen oder experimentelle Bedingungen zu erstellen. Beispielsweise entstehen beim Vergleich von CD45- vs CD45+ Zellpopulationen (Abbildung3A) in der in Abbildung 2dargestellten KC-Suspension unterschiedliche Zellzyklusprofile. Wie erwartet hatten in der CD45-Gruppe gefundene hyperplastische KCs weniger Zellen in G0 und mehr Zellen in den Phasen S, G2 und M3. Im Gegensatz dazu hatten Immunzellen aus der gleichen Probe bemerkenswerte Populationen in G0 und G1. Neben Zellzyklusprofilen ist auch die Charakterisierung der Genexpression zellzyklusabhängig möglich. So wurden beispielsweise Phosphoproteine, die bei der Definition der EGFR- und mTOR/PI3K-Signalisierung helfen, in den für Abbildung 3Adargestellten Daten analysiert. Die Analyse der G1-Phasen von CD45- vs. CD45+-Zellen ergab ein ähnliches Profil für EGFR- und mTOR/PI3K-Signalproteine, obwohl es leichte Unterschiede im Prozentsatz der pS6- und pEGFR-positiven Zellen zu geben schien (Abbildung 3B). Ähnliche Ansätze können angepasst werden, um die Expression anderer Signalwegproteine oder zellulärer Prozesse in verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu charakterisieren.
Abbildung 1 : Zubereitung der Mausohrhaut für die Verdauung. (A) Zuerst das Ohr vom Tier entfernen und flach auf eine saubere Petrischale legen. (B) Greifen Sie eine Seite des Ohres entweder in der Mitte oder an der Kante mit gebogenen Präzisionszangen. (C) Umdrehen und mit einem anderen Paar Zangen und ziehen Sie sanft die Hälften des Ohres auseinander, bis das Ohr reißt auf der Falte. (D) Ziehen Sie weiter, bis sich die Seiten in zwei Hälften trennen. (E) Schweben Sie die Ohrhälften auf Dissoziationsmedien mit der Dermisseite, die die Lösung berührt. Maßstabsleiste = 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Gating-Strategie für Massenzytometriedaten. Die Daten in dieser Abbildung stammen aus einem Versuchstier, das mit dem Phorbolester TPA wie zuvor beschrieben behandelt wurde3. TPA ist ein PKC-Aktivator, der Hautentzündungen induziert24. (A) Die Panels zeigen die anfängliche Gating-Strategie nach Normalisierung und Dekonvolution von Barcode-Daten. Durch Gating auf Ereignislänge, 191Ir,193Ir und 195Pt Kanäle, ist es möglich, für intakte, einzelne und lebensfähige Zellen zu wählen. (B) Menschliche SCC SRB-P93 Zellen, die mit DMSO behandelt und dann für die Massenzytometrie gefärbt wurden. Die Daten wurden wie in (A) abgegrenzt, und das Diagramm zeigt die Ebenen der lebenden Zellen in dieser Stichprobe an. (C) Die Einbeziehung von Linienmarkierungen ermöglicht die Auswahl von Zellpopulationen von Interesse. In diesem Beispiel wurden lebensfähige Zellen aus (A) nach Ereignislänge vs. CD45 getort, um hämatopoetische Zellen auszuschließen. Gating CD45- Zellen zur Aufnahme von IdU vs CYCLIN B1 ermöglicht die Identifizierung von S-, G0/G1- und G2/M-Zellpopulationen. Die Auswahl von pHH3 hohen Zellen definiert die M-Phase, während die Analyse von G0/G1 für pRB-Positivität Zellen in G1 identifiziert. (D) Das Diagramm zeigt die repräsentativen Ergebnisse der Zellzyklusanalyse durch den Nachweis von BrdU-Inkorporation und PI (DNA-Gehalt) mit fluoreszenzbasierter Durchflusszytometrie. Die gezeigten Daten stammen aus menschlichen Colo163 SCC-Zellen, die mit BrdU für 1 h angebaut werden, wie zuvor beschrieben3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Charakterisierung von Zellzyklusprofilen und phasenspezifischer Proteinexpression. (A) Die Zellzyklusprofile wurden in der Stichprobe aus Abbildung 2 für CD45- vs CD45+ Zellen bestimmt. (B) Die Analyse der G1-Phasen mit phosphospezifischen Antikörpern in CD45-(orange) und CD45+(Blue) Zellen ergab ähnliche Expressionsprofile für Marker der EgFR- und mTOR/PI3K-Signalwege. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| gewebe | gegend | Zellertrag | durchführbarkeit |
| Mausohr | 225-230 mm3 | 1-2x106 | 70-90% |
| Neonatale Haut | 1000-1100 mm3 | 5-10x106 | 80-99% |
Tabelle 1: Typische Zellerträge und Lebensfähigkeit von erwachsenen Mausohr und neonataler Haut. Die Zellzahl und die Lebensfähigkeit durch Trypan-Blauausschluss wurden von Ohr-KCs gemittelt, die von n=7 8-10 Wochen alten erwachsenen Mausohren oder n=7 P3 neonatalen Häuten geerntet wurden.
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Discussion
Das in diesem Dokument beschriebene Protokoll kann in ca. 8 h abgeschlossen werden. Das Endergebnis ist eine Suspension von Zellen, die in KCs angereichert sind und auf zellzyklusabhängige Weise auf Proteinexpression analysiert werden können. Mehrere frühere Studien haben Methoden skizziert, um KCs von der menschlichen und Maushaut zu isolieren16,25. Diese Studien umfassen auch Protokolle zur Isolierung von KCs für die Durchflusszytometrie26. Ein detailliertes Protokoll wurde jedoch bisher nicht beschrieben, das die Isolierung von KCs mit der Analyse der Proteinexpression und der Zellzyklusdynamik mittels Massenzytometrie kombiniert.
Die größte Hürde, um qualitativ hochwertige Ergebnisse in diesem Protokoll zu erzielen, ist die Qualität der verwendeten lebenden Zellen. In der Literatur variieren die vorgeschlagenen Bedingungen und Enzyme für die Epidermis/Dermis-Trennung stark16,25,26,27. Es wird jedoch empfohlen, die Zeit der Verdauung der Haut so schnell wie möglich zu halten, was eine effektive Trennung der Epidermis von der Dermis ermöglicht. Dieses Protokoll präsentiert die Verdauung mit Dispase und Typ IV Kollagenase, die eine einfache Trennung von Ohr und Maus neonatale Haut innerhalb von 1 h ermöglicht. Dies führt zu ausreichenden Zellerträgen mit hoher Zelllebensfähigkeit. Ein weiterer Faktor, der die Qualität der Zellen beeinflussen kann, ist die Position der Haut, die für die Verdauung ausgewählt wurde. Es wird angenommen, dass kCs sich von verschiedenen anatomischen Stellen im Körper aus ähnlich verhalten. Die Haut an verschiedenen Stellen kann jedoch unterschiedliche Eigenschaften und Stammzellzusammensetzung28,29haben. Dennoch wird die Verwendung von neonataler und Ohrenhaut3,30 bevorzugt, da die Isolierung von KCs von Hautbereichen mit einer hohen Dichte von Haarfollikel (z. B. Rückenhaut) schwieriger ist. Für eine effiziente Isolierung von KCs aus haarigen Bereichen der Maus kann ein höherer Grad an Manipulation oder Gewebedissoziation erforderlich sein26. Die experimentellen Bedingungen vor der Isolierung von KCs können sich auch auf die Qualität isolierter Zellen auswirken. Hautläsionen oder Bedingungen, die die Hautbarriere oder die Hautintegrität beeinträchtigen, können die Trennung der Epidermis von der Dermis reduzieren. Dies könnte zu einer geringeren Ausbeute lebensfähiger Zellen oder einer erhöhten Kontamination von Nicht-KC-Zellen (z. B. Immunzellen) führen. Schließlich sind isolierte KCs anfällig für Klumpenbildung. Sie können auch die Zelllebensfähigkeit verlieren, wenn sie zu lange auf Demeis oder bei RT gelassen werden, bevor sie für Massenzytometrie oder andere Einzelzellanalysen verarbeitet werden.
Die Färbemethode für die Massenzytometrie ähnelt der für die Fluoreszenzflusszytometrie, jedoch mit wesentlichen Unterschieden. Beispielsweise erfolgt der Nachweis der DNA-Replikation durch den direkten Nachweis von IdU statt durch den Einsatz von Antikörpern gegen Nukleotid-Analoga wie BrdU. Die direkte Detektion von IdU vereinfacht die Identifizierung von S-Phasen-Zellen erheblich, da die Antikörperdetektion von BrdU ein beteiligtes Verfahren sein kann. Ein weiterer Unterschied ist die Verwendung von Cisplatin für die Diskriminierung von toten und lebenden Zellen. Cisplatin kennzeichnet bevorzugt abgestorbene Zellen. Dieser Schritt ähnelt der Verwendung von PI oder anderen Flecken für tote/lebende FACS-Experimente. Der Cisplatin-Färbungsschritt ist wichtig, da abgestorbene Zellen Antikörper binden und dadurch falsch positive Signale erzeugen können. Die Massenzytometrie verwendet auch Antikörper, um die Expression eines phasenspezifischen Markers anstelle der Messung des DNA-Gehalts zu erkennen. Dies ermöglicht eine einfache Diskriminierung einzelner Zellzyklusphasen. Schließlich müssen die FCS-Dateien (Mass Cytometry Data) mit hilfe der Spitze der Kalibrierperlen normalisiert werden, da das Probensignal im Laufe der Zeit im selben Lauf und zwischen den Durchläufen im Laufe der Zeit verschlechterung.
Färbung, Datenerfassung und Analyse der Massenzytometrie wurden in den jüngsten Veröffentlichungen14,15gut bewertet. Die Anwendung dieser Technologie auf die Analyse von hämatopoetischen und Immunzellen ist gut dokumentiert. Dies wird durch eine große Sammlung von handelsüblichen metallmarkierten Antikörpern und die Dominanz immunbezogener Publikationen mit dieser Technologie deutlich. Die sofortige Anwendung der Massenzytometrie in der Haut wäre für die Analyse von Immunzellen. Dies ist besonders relevant für Maushautmodelle bei Krankheiten wie Krebs, bei denen Entzündungen eine wichtige Rolle spielen. Für die Analyse von nicht-immunzelligen Zellen kann der Mangel an handelsüblichen metallmarkierten Antikörpern ein Hindernis sein. Der Vorteil kommerzieller Reagenzien besteht darin, dass sie ohne erhebliche Optimierung verwendet werden können, wie dies bei hauswirtschaftlichen metallmarkierten Antikörpern der Fall wäre. Es gibt jedoch metallmarkierte Antikörper gegen häufig verwendete Fluoreszenz-Tags (z. B. FITC, PE und APC), die es einem Experimentator ermöglichen würden, zusätzliche Marker zu ihrer Färbeplatte hinzuzufügen. Diese Problemumgehung kann auch auf die Analyse von Hautzellen in verschiedenen Arten angewendet werden, wo es eine begrenzte Anzahl von kommerziellen metallmarkierten Antikörpern geben kann, die Reaktivität über Arten hinweg zeigen. Dennoch erfordert diese Problemumgehung auch einen zusätzlichen Färbeschritt nach der Cisplatinfärbung und eine gewisse Optimierung. Eine zusätzliche Überlegung für den Aufbau einer erfolgreichen Podiumsdiskussion wird in der Literatur14diskutiert. Ein weiterer Nachteil der Massenzytometrie besteht darin, dass die Datenerfassungseffizienz von Massenzytometern 40-60% der Eingabezellenzahl betragen kann. Daher kann die Analyse seltener Zellpopulationen (z. B. Stammzellen) aus Massenproben eine größere Anzahl von Zellen, das Zusammenführen von Proben für eine effektive Detektion oder andere Ansätze zur Anreicherung der Zellpopulation von Interesse vor der Färbung der Massenzytometrie erfordern. 24.
Massenzytometrie ist eine leistungsstarke aufstrebende Technologie, deren Einsatz weiter zunehmen wird. Derzeit konzentriert sich die Anwendung dieser Technologie auf die Verwendung von metallgetaggten Antikörpern, aber sie wurde vor kurzem für den Nachweis von mRNA31erweitert. Darüber hinaus besteht das Potenzial, andere zelluläre Komponenten oder Metaboliten mit Metall-Tags zu kennzeichnen, was den Anwendungsbereich der Massenzytometrie in der Haut und anderen Geweben von Mäusen, Menschen und anderen Arten erweitern würde. Zusammenfassend kann dieses Protokoll dann die experimentellen Werkzeuge erweitern, die für Hautbiologen zur Verfügung stehen, um die KC-Proteinexpression in den verschiedenen Zellzyklusphasen zu korrelieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Unterstützung für diese Arbeit kam vom Department of Dermatology, dem Gates Center for Regenerative Medicine an der University of Colorado und der University of Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212). Die Autoren würdigen das UC Cancer Center Flow Cytometry Shared Resource and Support Grant (NCI P30 CA046934) für den Betrieb des Massenzytometers und sind Karen Helm und Christine Childs im Kern für ihre fachkundige Beratung zu Strömung und zytometrischer Masse dankbar. Techniken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM - Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
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