Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59353
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Ce protocole décrit comment isoler les kératinocytes cutanés des modèles de souris, les tacles avec des anticorps marqués en métal, et analyser les cellules tachées par cytométrie de masse afin de profiler le modèle d'expression des protéines d'intérêt dans les différentes phases du cycle cellulaire.

Abstract

L'objectif de ce protocole est de détecter et de quantifier les changements d'expression des protéines d'une manière dépendante du cycle cellulaire à l'aide de cellules individuelles isolées de l'épiderme de la peau de souris. Il y a sept étapes importantes : séparation de l'épiderme du derme, digestion de l'épiderme, coloration des populations épidermiques avec cisplatine, codage à barres d'échantillon, coloration avec des anticorps métalliques marqués pour les marqueurs de cycle cellulaire et les protéines de l'intérêt, la détection d'anticorps marqués par le métal par cytométrie de masse, et l'analyse de l'expression dans les différentes phases du cycle cellulaire. L'avantage de cette approche par rapport aux méthodes histologiques est le potentiel d'analyse du modèle d'expression de marqueurs différents dans une seule cellule à différentes phases du cycle cellulaire. Cette approche permet également l'analyse multivariée de corrélation de l'expression de protéine qui est plus quantifiable que les méthodes histologiques/imaging. L'inconvénient de ce protocole est qu'une suspension des cellules simples est nécessaire, ce qui entraîne la perte de l'information de localisation fournie par la coloration des sections de tissu. Cette approche peut également nécessiter l'inclusion de marqueurs supplémentaires pour identifier différents types de cellules dans les suspensions de cellules brutes. L'application de ce protocole est évidente dans l'analyse des modèles hyperplastiques de maladie de peau. En outre, ce protocole peut être adapté pour l'analyse de sous-types spécifiques de cellules (par exemple, les cellules souches) par l'ajout d'anticorps spécifiques à la lignée. Ce protocole peut également être adapté pour l'analyse des cellules de la peau chez d'autres espèces expérimentales.

Introduction

La corrélation de l'expression génique avec les stades du cycle cellulaire demeure un défi dans l'analyse des modèles animaux de maladies hyperplastiques comme le cancer. Une partie de ce défi est la co-détection des protéines d'intérêt (POI) avec des marqueurs de prolifération. Les cellules proliférantes peuvent être trouvées dans diverses phases de cycle cellulaire comprenant G1, S, G2, et M. Ki67 est l'un des marqueurs les plus couramment utilisés de la prolifération et est exprimée dans toutes les phases du cycle cellulaire. Il a été largement utilisé dans l'analyse des tissus humains et de souris1,2,3. Cependant, comme d'autres marqueurs de prolifération générale, Ki67 ne discerne pas les phases individuelles du cycle cellulaire. Une approche plus précise utilise l'incorporation d'analogues de nucléotide de thymidine comme la bromodeoxyuridine (BrdU) dans des cellules qui reproduisent activement leur génome (c.-à-d. la phase S)4,5. Un inconvénient à l'utilisation des analogues nucléotides est la nécessité de les administrer aux animaux vivants heures avant l'analyse. Ki67 et BrdU sont généralement détectés sur les sections de tissus fixes par l'utilisation d'anticorps. L'un des avantages de cette approche est que l'emplacement des points d'accès peut être déterminé dans l'architecture tissulaire (p. ex., la couche basale de l'épiderme cutané). Cette approche ne nécessite pas non plus de dissociation tissulaire qui peut conduire à des changements dans l'expression des gènes. L'un des inconvénients est que la fixation des tissus ou le traitement du tissu pour la section congelée ou paraffine de l'OCT peut obstruer les cibles des anticorps (c.-à-d. les antigènes). La récupération des antigènes nécessite généralement une digestion thermique ou tissulaire. La quantification des intensités de coloration peut également être difficile. Cela est dû aux variations de la coloration, de l'épaisseur de la section, de la détection du signal et du biais de l'expérimentateur. En outre, un nombre limité de marqueurs peut être détecté simultanément dans la plupart des configurations de laboratoire typiques. Pourtant, de nouvelles approches de coloration multiplex promettent de surmonter ces limites; exemples sont la cytométrie de masse d'imagerie et l'amplification du signal Tyramide6,7.

La cytométrie des flux est une autre technologie puissante pour détecter les cellules proliférantes. Il permet la détection multiplexe des marqueurs dans les mêmes cellules, mais nécessite une dissociation tissulaire pour la plupart des types de cellules non hématopoïétiques. L'analyse des cellules proliférantes est régulièrement effectuée par l'utilisation de colorants qui lient l'ADN (p. ex., Propidium Iodide (PI))8. La cytométrie de flux permet également une détermination plus précise des phases du cycle cellulaire lorsqu'elle est associée à la détection de l'incorporation BrdU9. Bien qu'il s'adresse avec force, la cytométrie du flux BrdU/PI a ses inconvénients. Il n'est pas en mesure de résoudre les phases G2/M et G0/G1 sans l'inclusion d'anticorps spécifiques à la phase. Cependant, le nombre d'anticorps qui peuvent être utilisés est limité par l'autofluorescence cellulaire, les retombées spectrales des émissions de fluorophore et l'utilisation de contrôles de compensation. Cette limitation indique qu'il est plus difficile et laborieux de co-détecter l'expression des marqueurs de cycle cellulaire avec des POI. Une approche plus facile est d'utiliser la cytométrie de masse10,11. Cette technologie utilise des anticorps conjugués métalliques qui ont un spectre de détection plus étroit. Une fois que les cellules sont tachées d'anticorps marqués par le métal, elles sont vaporisées et les métaux détectés par la spectrométrie de masse cytométrie (CyTOF). En raison de ces propriétés, la cytométrie de masse permet la détection multiplexe de marqueurs différents à l'aide de plates-formes existantes10,11. En outre, il est possible de coder à barres des échantillons avec des métaux qui se traduisent par des économies d'anticorps précieux tout en réduisant la variabilité des taches d'échantillon en échantillon. D'autre part, la cytométrie de masse a plusieurs inconvénients. Il existe un nombre limité d'anticorps étiquetés métalliques disponibles dans le commerce pour les cellules non dérivées du sang. La quantification de la teneur en ADN est moins sensible par rapport à l'utilisation de colorants fluorescents de l'ADN et la cytométrie de masse a une plage dynamique réduite de détection de signal par rapport à la cytométrie de flux de fluorescence.

Le protocole décrit ici a été conçu pour analyser la dynamique du cycle cellulaire des kérainocytes nouvellement isolés (KCs) de la peau de souris et caractériser l'expression protéique spécifique au cycle cellulaire dans ces cellules en utilisant la cytométrie de masse. Ce protocole peut également être utilisé avec des cellules cultivées ou adapté à d'autres types de cellules.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du campus médical anschutz de l'Université du Colorado a approuvé les expériences sur les animaux décrites dans ce protocole.

1. Préparations

  1. Concevoir un panneau d'anticorps marqué en métal. Utilisez le logiciel de conception de panneaux en ligne gratuit12 et inclure 127IododeoxyUridine (IdU), 164Dy (Dysprosium) étiqueté anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), et 150 Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA protéineSer807/811 (pRB)13. Ajoutez d'autres anticorps marqués par le métal qui ne se chevauchent pas dans leur signal de canal14.
  2. Préparer une solution d'actions IdU. Dissoudre la poudre d'IdU à 10 mg/mL en 0,1 N NaOH à 60 oC. Aliquot IdU stock de solution dans les tubes de microcentrifuge et de congeler à -20 oC pour le stockage à long terme.
    1. Ajuster le pH de la solution IdU à 7,5 avec 12 N HCl immédiatement avant utilisation. Testez avec une bande de pH sur un aliquot de rejet pour s'assurer que la solution est au pH 7.5.
      REMARQUE : Le temps prolongé (à partir de 5 min) d'IdU au pH 7,5 entraînera des précipitations et un aliquot frais d'IdU est nécessaire lorsque cela se produit.
    2. Utilisez l'équipement de protection individuelle approprié (p. ex. gants, blouse de laboratoire et lunettes de sécurité) et travaillez dans une armoire de sécurité lorsque vous manipulez des solutions NaOH ou HCl.
  3. Préparer une solution de fixation au paraformaldéhyde 2x (PFA). Combinez 5 mL de 10x PBS (pH 7,5) et 1 ml de 16% de PFA avec 44 ml de dH2O de qualité moléculaire pure (3,2% de concentration finale).
    REMARQUE : Un stock de PFA peut être préparé comme précédemment publié15 ou acheter 16% des stocks exempts de métaux contaminants.
    1. Utilisez l'équipement de protection individuelle approprié et travaillez dans une armoire de sécurité lors de la manipulation de la poudre et des solutions PFA.
  4. Préparer le baryum (Ba2)gratuit 1x PBS en combinant 5 ml de 10x PBS sans métal (pH 7,5) avec 45 ml de dH2O de qualité moléculaire pure.
    REMARQUE : La qualité du PBS et d'autres réactifs est très importante pour éviter de contaminer les métaux qui peuvent introduire le bruit de fond pendant l'analyse des données cytométriques de masse.
  5. Préparer une solution de bouillon de cisplatine de 100 mM. Dissoudre 300,5 mg de poudre de cisplatine dans 10 ml de DMSO. Conserver dans les aliquots à -80 oC. Préparer une solution de travail de 10 mM de cisplatine pour les expériences à utiliser sur 1 d.
  6. Préparer des solutions de séparation épiderme/derme. Préparer une solution de stock 20x dispase en dissolvant 30 mg dans 1 ml de HBSS ou PBS. Filtrer la stérilisation à l'intérieur d'un filtre de 0,22 m et entreposer les aliquots à -20 oC. Préparer une solution de stock de collagène de type IV de 1x à 1 mg/mL dans le HBSS, filtrer la stérilisation à l'aide d'un filtre de 0,22 m et stocker les aliquots à -20 oC.

2. Étiquetage de la phase S par incorporation De l'UI par l'Incorporation

  1. Pesez des souris. Utilisez des chiots néonatals P1-P3 ou des souris adultes de 8 à 10 semaines et utilisez des souris mâles ou femelles provenant d'un C57BL/6, d'un FvB ou de 129 milieux. Déterminer une dose de 0,1 mg d'IdU (pH 7,5)/g de poids corporel. Par exemple, une souris de 25 g nécessite 0,25 ml d'IdU.
  2. Administrer la dose d'IdU par injection intrapéritonéale et attendre 2 h avant de récolter les cellules. Utilisez une seringue de tuberculeuse pour injecter des chiots néonatals.
    REMARQUE : Une dose de 2 mg/mL d'IdU peut être utilisée avec des cellules de culture tissulaire avec une incubation de 1 h à 37 oC avant la récolte et l'étiquetage pour la cytométrie de masse.

3. Isolement des cellules pour l'étiquetage

  1. Décongeler les solutions de dépase et de collagène. Diluer la solution de stock de dériver 20x à 1x (1,5 mg/mL) dans le HBSS ou le PBS stérile. Conserver sur la glace jusqu'au moment de l'utilisation.
  2. Combinez 2 volumes de dispase avec 1 volume de collagène dans un volume total qui permet à la peau de flotter librement. Par exemple, la digestion de 5 peaux de souris néonatales peut être flottée sur 8 ml de 1x dispase avec 4 ml de collagène dans un plat Petri de 100 mm.
  3. Suivez des méthodes approuvées pour euthanasier les souris expérimentales (p. ex., surdosage d'isoflurane/pincement des orteils ou inhalation de CO 2/dislocation cervicale). Nettoyez la peau de l'oreille adulte avec une solution d'iode (voir Tableau des matériaux)et rincez à l'eau stérile lorsque des cellules isolées doivent être utilisées pour la culture tissulaire.
  4. Enlever chirurgicalement l'oreille à la base (Figure 1A). Rincer les oreilles dans le PBS stérile lorsque des cellules isolées doivent être utilisées pour la culture tissulaire. Déposer sur un plat Petri sec de 100 mm.
  5. Séparez soigneusement la peau postérieure de la peau postérieure en créant d'abord une poche au milieu ou au bord de la zone coupée à l'aide de forceps fins et en tirant les deux rabats de peau séparés (figure 1B-D). Procédez avec les peaux antérieures et postérieures.
    REMARQUE : Des instructions détaillées pour disséquer la peau néonatale de souris sont fournies par Litchi et coll.16 En outre, l'utilisation d'une portée de dissection peut aider à la séparation de la peau postérieure de la peau postérieure et à l'identification des côtés épidermiques/dermiques des peau: les cheveux sont visibles sur le côté épiderme tandis que le derme aura un aspect gélatineux.
  6. Placez soigneusement les peaux antérieures et postérieures de l'oreille avec le côté derme de la peau touchant la solution dispase/collagenase ( Figure 1E). Utilisez 1 mL pour la peau antérieure et postérieure d'une seule oreille par puits d'une plaque de 12 biens de culture. Incuber à 37 oC pendant 1 h. Alternativement, les peaux flottantes sur la solution de dispase 1x à 4 oC pour 16-18 h.3
    REMARQUE : Travaillez dans une hotte de culture de tissu avec la technique stérile quand les cellules doivent être cultivées.
  7. Placez la peau digérée avec le côté épiderme touchant la surface d'un plat Petri propre. Aplatir la peau et faire glisser doucement le derme de l'épiderme en travaillant du centre aux bords dans un motif circulaire.
  8. Jetez le derme ou digérez-le plus loin pour libérer les fibroblastes pour la culture ou l'analyse des tissus16.
    REMARQUE: Le derme sera plus foncé en apparence et ont une composition gélatineuse et collante. Le derme devrait facilement se détacher. L'échec ou la difficulté en enlevant le derme suggère la digestion insuffisante de tissu. Cependant, l'incubation prolongée dans le tampon de digestion réduira la viabilité cellulaire. L'épiderme restera sur le plat Petri et aura un aspect blanchi.
  9. Soulevez délicatement l'épiderme en saisissant les bords et épluchez-le de la surface du plat Petri. Placez soigneusement l'épiderme sur la solution de détachement cellulaire préchauffée (voir Tableau des matériaux) pendant 5 min à 37 oC ou 20 min à RT. Utilisez 500 l de solution de détachement cellulaire pour 2 épidermises d'oreilles adultes par puits d'une plaque de culture de 12 puits et utilisez 750 l de détachement cellulaire solution pour un épiderme néonatal unique par puits d'une plaque de culture de 6 puits.
  10. Saisir l'épiderme à l'aide de forceps stériles et frotter en faisant glisser l'épiderme contre le fond du plat pour dissocier les cellules. Ajouter 1 ml de DMEM contenant 1 % de FBS (0,01 ml) et passer à travers un tamis cellulaire de 40 m dans un tube de collecte. Bien rincer avec 2 ml de DMEM supplémentaires et ajouter à la suspension cellulaire.
  11. Centrifugeuse à 120 x g pendant 5 min. Aspirez soigneusement le supernatant.
  12. Resuspendre le granule de cellules dans 1-2 ml de DMEM contenant 1% FBS. Déterminez le nombre de cellules et de % de cellules vivantes à l'aide de Trypan Blue et d'un hémocytomètre ou d'un dispositif de comptage automatisé. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 3.11.
    REMARQUE : Les cellules peuvent être cultivées dans les médias appropriés de culture tissulaire après l'étape 3.12. 17 Annonces

4. Étiquetage de Cisplatin pour déterminer les cellules vivantes/mortes

  1. Resuspendre 1-3 x 106 cellules par 1 ml de DMEM contenant 25 M de cisplatine (2,5 l de stock/mL). Incuber 1 min et éteindre par pipetting avec un volume égal de FBS (p. ex., 1 ml).
  2. Centrifugeuse à 120 x g pendant 5 min. Décant supernatant dans un bécher contenant de l'eau de Javel diluée et des tubes d'inversion pour égoutter la solution restante sur un essuie-tout. Appuyez doucement pour libérer la solution restante sur le granule et la paroi latérale du tube.
  3. Resuspendre le granule de cellules dans 2 ml de Ba2-gratuit PBS. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 4.2.
    REMARQUE : Il est recommandé de fixer les cellules si elles ne peuvent pas être tachées immédiatement.

5. Fixation des cellules étiquetées cisplatine (facultatif)

  1. Resuspendre 1-3 x 106 cellules étiquetées cisplatine dans 1 ml de Ba2-free PBS. Cellules de Vortex sous faible puissance continue et ajoutez dropwise 1 mL (1 volume) du tampon de fixation 2x PFA. Incuber à RT pendant 10 min sur une plate-forme à bascule.
  2. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 4.2, mais centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min.
  3. Laver les cellules avec 2 ml de Ba2-free PBS et les cellules granulées comme décrit à l'étape 5.2. Répétez l'étape 5.3 une fois.
  4. Resuspendre la pastille en 2 ml de Ba2-gratuit PBS. Conserver à 4 oC pour 3 j. Ajouter le FBS à 3 % (p. ex., 0,3 mL de FBS/mL de cellules) du volume total si vous stockez plus longtemps, puis mélanger et congeler à -80 oC.
    REMARQUE : La fixation peut affecter la détection de certaines épitopes. Les effets de la fixation sur le signal d'anticorps doivent être déterminés empiriquement.

6. Barcodage d'échantillons (facultatif mais recommandé)

  1. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2 et puis resuspend 1-3 x 106 cellules dans 1 ml de tampon de fixation 1x (voir tableau des matériaux). Incuber à RT pendant 10 min. Cellules pelletées telles que décrites à l'étape 5.2.
  2. Laver les cellules avec 1 ml de tampon de perméabilisation du code à barres (voir Tableau des matériaux). Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2. Répétez l'étape 6.2 une fois.
  3. Ajouter 100 l de tampon de perméabilisation de code à barres aux codes-barres (voir Tableau des matériaux)18 et mélanger immédiatement pendant que les cellules de l'étape 6.2 sont granulées.
  4. Resuspendre le granule de cellule dans 800 'L de tampon de perméabilisation de code à barres. Ajouter la solution de code à barres aux cellules, mélanger et incuber à RT pendant 30 min. Cellules pelletées telles que décrites à l'étape 5.2. Laver les cellules dans 2 ml de tampon de coloration cellulaire (voir Tableau des matériaux) et pelletàez à nouveau.
    REMARQUE: Jusqu'à 20 échantillons peuvent être étiquetés avec diverses combinaisons de métaux Palladium18. D'autres stratégies de codage à barres sont décrites ailleurs15.

7. Étiquetage des cellules pour la cytométrie de masse

  1. Resuspendre 1-3 x 106 cellules dans 1 ml de solution de travail tampon de coloration de l'antigène nucléaire (voir Tableau des matériaux). Combinez les échantillons dans un seul tube pour les étapes suivantes lors de l'utilisation d'échantillons codés à barres. Incuber à RT pendant 30 min. Pellet tel que décrit à l'étape 5.2.
  2. Resuspendre 1-3 x 106 cellules dans 2 ml de tampon de perméabilisation de la coloration de l'antigène nucléaire (voir Tableau des matériaux). Échelle au besoin. Par exemple, utilisez 6 ml de tampon pour 10 échantillons combinés avec un nombre cellulaire de 9 x 106 cellules. Pellet tel que décrit à l'étape 5.2.
  3. Répétez l'étape 7.2. Vortex doucement la pastille cellulaire dans le volume résiduel laissé dans le tube.
  4. Ajouter 50 l de cocktail d'anticorps intracellulaires par 1-3 x 106 cellules. Échelle au besoin. Par exemple, utilisez 150 l de cocktail d'anticorps pour 10 échantillons combinés avec un nombre cellulaire de 9 x 106 cellules. Mélanger et incuber à RT pendant 45 min. Ajouter 2 ml de tampon de coloration cellulaire et de granule tel que décrit à l'étape 5.2.
  5. Resuspendre 1-3 x 106 cellules granulés dans 2 ml de tampon cellule de coloration. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2. Répétez l'étape 7.5 une fois.
    REMARQUE : D'autres solutions tampons peuvent être utilisées pour tacher la membrane extracellulaire ou les marqueurs cytoplasmiques et l'expérimentateur peut avoir à optimiser la coloration s'il est nécessaire de détecter les épitopes dans différents endroits cellulaires. Les cellules peuvent également être fixées en PFA après l'étape 7.5 lors de l'utilisation de cellules vivantes pour la coloration.
  6. Resuspendre 1-3 x 106 cellules dans 1 ml de solution d'intercalation et conserver 1-3 d à 4 oC.
    1. Entreposez les cellules à -80 oC dans le DMSO contenant la solution pour les cellules de granule d. telles que décrites à l'étape 5.2 si les cellules sont dans la solution d'intercalation. Resuspendre les granulés (1-3 x 106 cellules) dans 1 ml de tampon de coloration cellulaire et de cellules granulées telles que décrites à l'étape 5.2. Resuspendre le granule dans 1 ml de 10 % DMSO/90 % FBS19, le transférer dans un cryovial, le placer dans un contenant de congélation à l'isopropanol et le conserver à -80 oC.
  7. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2. Laver 1-3 x 106 cellules avec 2 ml de tampon de coloration cellulaire, granulement tel que décrit à l'étape 5.2. Effectuer deux lavages supplémentaires avec 2 ml d'eau, granulecomme comme décrit à l'étape 5.2.
  8. Diluer les perles d'étalonnage EQ 1:9 dans l'eau (solution de stock à 3,3 x 105 perles/mL).
  9. Resuspendre la pastille cellulaire à une concentration de 1 x 106 cellules/mL avec une solution diluée de perles d'Égalisation. Filtrer les cellules à travers des tubes d'écoulement de bouchon de passoire de 35 m.
  10. Exécuter des échantillons sur le cytomètre de masse et acquérir des données. Les données seront déposées dans un format de fichier Flow Cytometry Standard (FCS).

8. Traitement et analyse des fichiers de données de cytométrie de masse

  1. Normaliser les fichiers FCS. Utiliser un programme gratuit disponible au20 https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest
  2. Fichiers FCS décongestionné à barres. Séparez la population de codes à barres mis en commun en fichiers codés à barres distincts avec un programme gratuit disponible au18 https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest
  3. Analyser les fichiers FCS normalisés. Utilisez des programmes commerciaux21,22 ou freeware (voir web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le tableau 1 montre les rendements cellulaires et la viabilité attendus de l'oreille de souris adulte (figure 1) et de la peau néonatale dans des conditions non pathologiques. Le tableau montre également des données représentatives d'animaux provenant d'un fond mixte C57/126. On s'attend à ce que la peau d'autres souches entraîne des rendements cellulaires et des viabilities similaires. Le rendement approximatif dépend de la surface de la peau et indique que la peau néonatale serait un meilleur choix pour les expériences qui nécessitent un plus grand nombre de cellules (tableau 1). Faibles rendements ou viabilité réduite (lt;50%) indiquerait des problèmes avec la digestion ou des conditions expérimentales qui réduisent l'intégrité de peau ou induisaient la mort cellulaire. Les cellules de culture avec les médias et les suppléments appropriés peuvent aider à évaluer la qualité des préparations de KC17.

Après la normalisation20 et la déconvulation18 des fichiers FCS, le gating des données définira les populations épidermiques d'intérêt et marquera les phases individuelles du cycle cellulaire (figure 2). Dans les parcelles bivariées comparant les 191canaux Ir vs 193Ir, les cellules intactes peuvent être fermées dans le quadrant supérieur droit (Figure 2A). Tracer la longueur de l'événement vs 191Ir et la sélection d'un groupe serré de cellules près de l'axe 191Ir marque les cellules simples. Les cellules viables sont sélectionnées dans une parcelle de 195Pt vs 193Ir parcelle en gating pour les cellules avec de faibles niveaux de 195Pt. L'échantillon montré à la figure 2A présente des débris et une présence accrue de cellules non viables étiquetées cisplatine. Cela peut indiquer que l'échantillon a été sur-digéré, sévèrement manipulé, ou laissé sur la glace ou RT pendant trop longtemps avant de coloration pour la cytométrie de masse. Les profils des cellules cultivées en tissu donnent généralement des pourcentages plus élevés de 195cellules négatives Pt (figure 2B). Alternativement, la présence de 195cellules positives de Pt peut être prévue si la mort de cellules d'induction est une caractéristique du modèle expérimental et/ou des conditions.

Idéalement, les marqueurs qui définissent la population d'intérêt devraient être inclus dans l'analyse de types de cellules spécifiques. Par exemple, les cellules immunitaires qui devraient être présentes dans les suspensions KC brutes peuvent être détectées par l'ajout d'un anticorps CD4523, qui détecte les cellules hématopoïétiques (Figure 2C). En ce qui concerne le panneau d'anticorps de prolifération13, tracer IdU vs CYCLIN B1 résout les phases du cycle cellulaire (Figure 2C) similaires à la parcelle de flux BrdU/PI standard (Figure 2D), permettant la détection de la phase S, G0/G1 et G2/M cellule Populations. Dans les parcelles IdU vs pHH3, une positivité élevée au pHH3 identifie les cellules de phase M. Enfin, le fait de proxéncer des cellules G0/G1 sur un signal pRB élevé peut distinguer G0 (quiescent) des cellules de G1 (figure2C, à gauche la plupart des panneaux).

Après avoir identifié les différentes phases du cycle cellulaire, il est alors possible de construire une représentation graphique des profils de cycle cellulaire pour différents types de cellules ou conditions expérimentales. Par exemple, des profils distincts du cycle cellulaire apparaissent lorsqu'on compare les populations de cellules CD45- vs CD45MD (figure 3A) dans la suspension KC indiquée à la figure 2. Comme prévu KChyper trouvé dans le CD45- groupe avait moins de cellules dans G0 et plus de cellules dans Les phases S, G2 et M3. En revanche, les cellules immunitaires du même échantillon avaient des populations notables dans G0 et G1. En plus des profils de cycle cellulaire, la caractérisation de l'expression génique d'une manière dépendante du cycle cellulaire est également possible. Par exemple, les protéines phospho qui aident à définir la signalisation EGFR et mTOR/PI3K ont été analysées dans les données présentées pour la figure 3A. L'analyse des phases G1 des cellules CD45- vs CD45MD a révélé un profil similaire pour les protéines de signalisation EGFR et mTOR/PI3K, bien qu'il semble y avoir de légères différences dans le pourcentage de cellules positives pS6 et pEGFR (figure 3B). Des approches similaires peuvent être adaptées pour caractériser l'expression d'autres protéines de voie de signalisation ou de processus cellulaires à différentes phases du cycle cellulaire.

Figure 1
Figure 1 : Préparation de la peau d'oreille de souris pour la digestion. (A) Tout d'abord, retirer l'oreille de l'animal et poser à plat sur un plat Petri propre. (B) Saisir un côté de l'oreille au milieu ou au bord à l'aide de forceps de précision courbes. (C) Retournez-vous et utilisez une autre paire de forceps et tirez doucement les moitiés de l'oreille à part jusqu'à ce que l'oreille se déchire sur le pli. (D) Continuer à tirer jusqu'à ce que les côtés se séparent en deux moitiés. (E) Flottez les moitiés d'oreille sur le support de dissociation avec le côté derme touchant la solution. Barre d'échelle de 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Stratégie de gating pour les données de cytométrie de masse. Les données de cette figure ont été générées à partir d'un animal expérimental traité avec le phorbol ester TPA comme décrit précédemment3. TPA est un activateur PKC qui induit l'inflammation de la peau24. (A) Les panneaux montrent la stratégie initiale de gating après la normalisation et la déconvolution des données codées à barres. En gating sur la longueur de l'événement, 191Ir,193Ir, et 195canaux Pt, il est possible de sélectionner pour les cellules intactes, simples et viables. (B) SCC humain SRB-P93 cellules traitées avec DMSO et ont ensuite été tachées pour la cytométrie de masse. Les données ont été fermées comme dans (A) et l'intrigue montre les niveaux de cellules vivantes dans cet échantillon. (C) L'inclusion de marqueurs de lignée permet de sélectionner les populations cellulaires d'intérêt. Pour cet exemple, les cellules viables de (A) ont été fermées sur la longueur de l'événement par rapport à CD45 pour exclure les cellules hématopoïétiques. Le fait de gating CD45- cellules pour l'incorporation de l'UI vs CYCLIN B1 permet l'identification des populations de cellules S, G0/G1 et G2/M. La sélection des cellules hautes de pHH3 définit la phase de M, tandis que l'analyse de G0/G1 pour la positivité de pRB identifie des cellules dans G1. (D) L'intrigue montre les résultats représentatifs de l'analyse du cycle cellulaire par la détection de l'incorporation de BrdU et de l'IP (contenu d'ADN) avec la cytométrie de flux basée sur la fluorescence. Les données montrées proviennent de cellules humaines Colo163 SCC cultivées avec BrdU pendant 1 h comme décrit précédemment3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Caractérisation des profils de cycle cellulaire et expression protéique spécifique à la phase. (A) Les profils du cycle cellulaire ont été déterminés dans l'échantillon de la figure 2 pour les cellules CD45- vs CD45MD. (B) L'analyse des phases G1 avec des anticorps spécifiques au phospho dans les cellules CD45-(orange) et CD45 (Bleu) a révélé des profils d'expression similaires pour les marqueurs des voies de signalisation EGFR et mTOR/PI3K. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

mouchoir région Rendement cellulaire viabilité
Oreille de souris 225-230 mm3 1-2x106 Annonces 70 à 90 %
Peau néonatale 1000-1100 mm3 5-10x106 Annonces 80 à 99 %

Tableau 1 : Rendements et viabilité des cellules typiques à partir de l'oreille de souris adulte et de la peau néonatale. Les numérations cellulaires et la viabilité par l'exclusion bleue de Trypan ont été moyennes des KC d'oreille récoltés des oreilles adultes de souris de 8-10 semaines de n-7 ou des peaux néonatales de P3 n-7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le protocole décrit dans ce document peut être complété en environ 8 h. Le résultat final est une suspension des cellules enrichies en KCs qui peuvent être analysés pour l'expression des protéines d'une manière cellulaire dépendante du cycle. Plusieurs études antérieures ont décrit des méthodes pour isoler les KCde la peau humaine et de la souris16,25. Ces études comprennent également des protocoles pour l'isolement des KC spour la cytométrie du débit26. Cependant, un protocole détaillé n'a pas été précédemment décrit qui combine l'isolement des KCs avec l'analyse de l'expression de protéine et de la dynamique de cycle cellulaire utilisant la cytométrie de masse.

Le plus grand obstacle à l'obtention de résultats de haute qualité dans ce protocole est la qualité des cellules vivantes utilisées. Dans la littérature, les conditions et les enzymes suggérées pour la séparation d'épiderme/derme varient considérablement16,25,26,27. Cependant, il est donc recommandé de garder le temps de digestion de la peau à la plus courte durée possible qui permet une séparation efficace de l'épiderme du derme. Ce protocole présente la digestion avec la collagène de dispase et de type IV qui permet la séparation facile de la peau néonatale d'oreille et de souris dans un délai de 1 h. Il en résulte des rendements cellulaires suffisants avec une viabilité cellulaire élevée. Un autre facteur qui peut affecter la qualité des cellules est l'emplacement de la peau sélectionnée pour la digestion. On suppose que les KCsese de la même façon à partir de différents endroits anatomiques dans le corps. Cependant, la peau à différents sites peut avoir des propriétés différentes et la composition des cellules souches28,29. Néanmoins, l'utilisation de la peau néonatale et de l'oreille3,30 est préférable parce que l'isolement des KCs est plus difficile à partir de zones de la peau avec une forte densité de follicules pileux (par exemple, la peau du dos). Un degré plus élevé de manipulation ou de dissociation des tissus peut être nécessaire pour l'isolement efficace des KC des zones poilues de la souris26. Les conditions expérimentales avant l'isolement des KC peuvent également affecter la qualité des cellules isolées. Les lésions cutanées ou les conditions qui affectent la barrière cutanée ou l'intégrité de la peau peuvent réduire la séparation de l'épiderme du derme. Cela pourrait entraîner une réduction des rendements des cellules viables ou une contamination accrue des cellules non-KC (p. ex., les cellules immunitaires). Enfin, les KC isolés sont sensibles à l'agglutination. Ils peuvent également perdre la viabilité cellulaire s'ils sont laissés trop longtemps sur la glace ou à la RT avant le traitement de la cytométrie de masse ou d'autres analyses de cellules individuelles.

La méthode de coloration pour la cytométrie de masse est similaire à celle utilisée pour la cytométrie de flux de fluorescence, mais avec des différences clés. Par exemple, la détection de la réplication de l'ADN est réalisée par la détection directe de l'IdU au lieu de l'utilisation d'anticorps contre les analogues des nucléotides comme BrdU. La détection directe des IdU simplifie considérablement l'identification des cellules de phase S, car la détection des anticorps du BrdU peut être une procédure impliquée. Une autre différence est l'utilisation du cisplatine pour la discrimination des cellules mortes et vivantes. Cisplatin étiquette de préférence les cellules mortes. Cette étape est similaire à l'utilisation de PI ou d'autres taches pour les expériences FACS mortes/vivantes. L'étape de coloration de cisplatine est importante parce que les cellules mortes peuvent lier des anticorps et ainsi produire de faux signaux positifs. La cytométrie de masse utilise également des anticorps pour détecter l'expression d'un marqueur spécifique à la phase au lieu de mesurer la teneur en ADN. Cela permet une discrimination facile des phases individuelles du cycle cellulaire. Enfin, les fichiers de données de cytométrie de masse (FCS) doivent être normalisés à l'aide du pic de perles d'étalonnage due à la détérioration du signal d'échantillon au fil du temps dans l'instrument CyTOF pendant la même course et entre les courses.

La coloration, l'acquisition de données et l'analyse de la cytométrie de masse ont été bien examinées par les publications récentes14,15. L'application de cette technologie à l'analyse des cellules hématopoïétiques et immunitaires est bien documentée. Cela est évident par une vaste collection d'anticorps étiquetés métalliques disponibles dans le commerce et la prédominance des publications liées au système immunitaire utilisant cette technologie. L'application immédiate de la cytométrie de masse dans la peau serait pour l'analyse des cellules immunitaires. Ceci est particulièrement pertinent pour les modèles de peau de souris dans des maladies comme le cancer où l'inflammation a un rôle important. Pour l'analyse cellulaire non immunisée, l'absence d'anticorps étiquetés métalliques disponibles dans le commerce peut constituer un obstacle. L'avantage des réactifs commerciaux est qu'ils peuvent être utilisés sans optimisation considérable comme ce serait le cas pour les anticorps métalliques de maison. Cependant, il existe des anticorps marqués en métal contre les étiquettes fluorescentes couramment utilisées (p. ex. FITC, PE et APC) qui permettraient à un expérimentateur d'ajouter des marqueurs supplémentaires à son panneau de coloration. Cette protection de la nature peut également être appliquée à l'analyse des cellules de la peau chez différentes espèces où il peut y avoir un nombre limité d'anticorps commerciaux marqués par des métaux qui montrent une réactivité entre les espèces. Néanmoins, cette comcontour nécessite également une étape de coloration supplémentaire après la coloration cisplatine et une certaine optimisation. Une considération supplémentaire pour la construction d'un panel réussi sont discutées dans la littérature14. Un autre inconvénient de la cytométrie de masse est que l'efficacité de collecte de données des cytomètres de masse peut être de 40-60% du nombre de cellules d'entrée. Par conséquent, l'analyse des populations de cellules rares (p. ex., les cellules souches) à partir d'échantillons en vrac peut nécessiter un plus grand nombre de cellules, la mise en commun d'échantillons pour une détection efficace ou d'autres approches visant à enrichir la population cellulaire d'intérêt avant de les tacher pour la cytométrie de masse. 24.

La cytométrie de masse est une technologie émergente puissante dont l'utilisation continuera de croître. Actuellement, l'application de cette technologie est axée sur l'utilisation d'anticorps marqués en métal, mais elle a récemment été étendue pour la détection de l'ARNm31. En outre, il y a le potentiel d'étiqueter d'autres composants cellulaires ou métabolites avec des étiquettes en métal, qui élargiraient la gamme d'application pour la cytométrie de masse dans la peau et d'autres tissus des souris, des humains, et d'autres espèces. En résumé, ce protocole peut ensuite étendre les outils expérimentaux disponibles pour les biologistes de la peau pour corréler l'expression des protéines KC dans les différentes phases du cycle cellulaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Le département de dermatologie, le Gates Center for Regenerative Medicine de l'Université du Colorado et l'Université du Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212) ont apporté leur soutien à ce travail. Les auteurs reconnaissent l'UC Cancer Center Flow Cytometry Shared Resource and support grant (NCI P30 CA046934) pour le fonctionnement du cytomètre de masse et sont reconnaissants pour Karen Helm et Christine Childs au cœur de leurs conseils d'experts sur le débit et la masse cytométrique techniques.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Cell Treat 229512
Intercalator solution Fluidigm 201192A 125 µM - Ir intercalator solution
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4 16 %  PFA
Strainer cap flow tubes Fisher/Corning 352235 35 µm pore size 
Cell sieve Fisher 22363547 40 μm pore size 
Cell detatchment solution CELLnTEC CnT-ACCUTASE-100 Accutase
Iodine Solution ThermoFisher/Purdue 67618-151-17 Betadine 7.5%-iodine surgical scrub
Barcode permeabilization buffer  Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Barcodes Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH strips EMD 9590 colorpHast
DMEM Hyclone SH30022.01 Dulbecco’s Modified Eagle Media
Fine forceps Dumont & Fils 0109-5-PO Dumostar #5
Curved precision forceps Dumont & Fils 0109-7-PO Dumostar #7
Calibration Beads Fluidigm 201078 EQ Four Element Calibration Beads
HBSS Gibco 14175-095 Hank's Balanced Salt Solution
Water Fisher SH30538.03 Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine  Sigma I7125 IdU
Cryo vials ThermoFisher 366656PK internal thread
Cell Staining buffer Fluidigm 201068 Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Perm buffer Fluidigm 201067 Maxpar Fix & Perm buffer
Fix I buffer Fluidigm 201065 Maxpar Fix I buffer
Phosphate buffered saline Rockland MB-008 Metal free 10x PBS
isopropanol-freezing container ThermoFisher 5100-0001 Mr.Frosty
Sodium hydroxide Fisher BP359-500 NaOH
Petri dish Kord-Valmark 2900 Supplied by Genesee 32-107 
15 mL conical Olympus/Genesee 28-101
50 mL conical Olympus/Genesee 28-106
6-well plate Cell Treat 229506
Cisplatin Sigma 479306
Dispase II Sigma/Roche 4942078001
DMSO Sigma D2650
FBS Atlanta Biologicals S11150
Hydrochloric acid Fisher A144-212
Nuclear Antigen Staining  permeabilization buffer Fluidigm 201063
Nuclear Antigen Staining buffer Fluidigm 201063
Trypan blue Sigma T8154
Tuberculin syringe BD 309626
Type IV Collagenase  Worthington Bioscience CLSS-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  8. Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
  9. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  10. Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
  12. http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
  13. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  14. Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
  15. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
  16. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  17. Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
  18. Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  19. Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
  20. Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  21. http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
  22. http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
  23. Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
  24. Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
  25. Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
  26. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  27. Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  28. Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
  29. Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
  30. Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
  31. Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).

Tags

Biologie du développement Numéro 147 Cycle cellulaire Epiderme Peau Isolement des kératinocytes Modèles de souris cytométrie de masse Prolifération Corrélation de l'expression protéique Analyse des cellules uniques
Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez, J., Torchia, E. C.… More

Fernandez, J., Torchia, E. C. Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59353, doi:10.3791/59353 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter