Summary
Dit protocol beschrijft hoe de huid keratinocyten van Muismodellen te isoleren, te vlekken met metaal-gelabelde antilichamen, en om bevlekte cellen te analyseren door massa cytometrie om het patroon van de expressie van eiwitten van belang in de verschillende celcyclus fasen profiel.
Abstract
Het doel van dit protocol is om te detecteren en te kwantificeren eiwit expressie veranderingen in een cel cyclus-afhankelijke manier met behulp van enkelvoudige cellen geïsoleerd uit de epidermis van de muis huid. Er zijn zeven belangrijke stappen: scheiding van de epidermis van de dermis, vertering van de epidermis, kleuring van de epidermale celpopulaties met cisplatine, monster barcodering, kleuring met metalen gelabelde antilichamen voor celcyclus markers en eiwitten van belang, detectie van met metaal gelabelde antilichamen door massa cytometrie en de analyse van de expressie in de verschillende fasen van de celcyclus. Het voordeel van deze benadering over histologische methoden is het potentieel om het expressie patroon van > 40 verschillende markers in een enkele cel in verschillende fasen van de celcyclus te testen. Deze aanpak maakt het ook mogelijk voor de multivariate correlatieanalyse van eiwit expressie die meer kwantificeerbaar is dan histologische/beeldvormingsmethoden. Het nadeel van dit protocol is dat een schorsing van afzonderlijke cellen nodig is, wat resulteert in het verlies van locatie-informatie die wordt verstrekt door de kleuring van weefsel secties. Deze aanpak kan ook vereisen dat extra markeringen worden opgenomen om verschillende celtypen in de suspensies van ruwe cellen te identificeren. De toepassing van dit protocol is duidelijk in de analyse van hyperplastische huidziekte modellen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor de analyse van specifieke subtypen van cellen (bv. stamcellen) door toevoeging van Lineage-specifieke antilichamen. Dit protocol kan ook worden aangepast voor de analyse van huidcellen in andere experimentele soorten.
Introduction
Correlatie van genexpressie met celcyclus fasen blijft een uitdaging in de analyse van diermodellen van hyperkunststof ziekten zoals kanker. Een deel van deze uitdaging is de co-detectie van eiwitten van belang (POI) met markers van proliferatie. Proliferatieve cellen kunnen worden gevonden in verschillende fasen van de cyclus van de cel, met inbegrip van G1, S, G2, en M. Ki67 is een van de meest gebruikte markers van proliferatie en wordt uitgedrukt in alle fasen van de celcyclus. Het is uitgebreid gebruikt in de analyse van zowel menselijke als muis weefsels1,2,3. Echter, net als andere algemene proliferatie markers, Ki67 niet onderscheiden individuele celcyclus fasen. Een preciezere aanpak maakt gebruik van de opname van thymidine nucleotide-analogen zoals bromodeoxyuridine (Brdu) in cellen die hun genoom actief repliceren (d.w.z. S-fase)4,5. Een nadeel van het gebruik van nucleotide-analogen is de noodzaak om ze te beheren tot levende dieren uren vóór de analyse. Ki67 en BrdU worden vaak aangetroffen op vaste weefsel gedeelten door het gebruik van antilichamen. Een voordeel van deze aanpak is dat de locatie van Poi's kan worden vastgesteld binnen de weefsel architectuur (bijv. de basale laag huid epidermis). Deze aanpak vereist ook geen weefsel dissociatie die kan leiden tot veranderingen in genexpressie. Een nadeel is dat de weefsel fixatie of de verwerking van het weefsel voor LGO bevroren of paraffine snijden de doelen van antilichamen kan occlude (d.w.z. antigenen). Het ophalen van antigenen meestal vereist warmte of weefsel spijsvertering. Kwantificering van kleurings intensiteiten kan ook een uitdaging zijn. Dit is te wijten aan variaties in kleuring, sectie dikte, signaaldetectie en experimenterbias. Bovendien kan een beperkt aantal markers tegelijkertijd worden gedetecteerd in de meeste typische laboratorium opstellingen. Toch, nieuwere multiplex kleuring benaderingen beloven om deze beperkingen te overwinnen; voorbeelden zijn beeldvormings massa cytometrie en tyramide signaalversterking6,7.
Flow flowcytometrieonderzoeken is een andere krachtige technologie om prolifererende cellen op te sporen. Het zorgt voor multiplex detectie van markers in dezelfde cellen, maar vereist weefsel dissociatie voor de meeste niet-hematopoietische celtypen. De analyse van prolifererende cellen wordt routinematig gedaan door het gebruik van kleurstoffen die DNA binden (bijv. Propidium jodide (PI))8. Flow cytometrie maakt ook een nauwkeuriger bepaling van de fasen van de celcyclus mogelijk in combinatie met de detectie van BrdU-opname9. Hoewel een krachtige aanpak, Brdu/Pi flow flowcytometrieonderzoeken heeft zijn nadelen. Het is niet in staat om de G2/M-en G0/G1-fasen op te lossen zonder de toevoeging van fasespecifieke antilichamen. Het aantal antilichamen dat kan worden gebruikt, wordt echter beperkt door cellulaire auto fluorescentie, spectrale overloop van de-emissies en het gebruik van compensatie controles. Deze beperking markt het uitdagender en bewerkelijk om de uitdrukking van celcyclus markeringen met Poi's te co-detecteren. Een meer facile aanpak is het gebruik van massa flowcytometrieonderzoeken10,11. Deze technologie maakt gebruik van metaal geconjugeerde antilichamen die een smaller detectie spectrum hebben. Zodra cellen zijn gekleurd met metaal-gelabelde antilichamen, ze zijn verdampt, en de metalen gedetecteerd door cytometrie tijd-van-vlucht (CyTOF) massaspectrometrie. Door deze eigenschappen, massa cytometrie maakt de multiplex detectie van > 40 verschillende markers met behulp van bestaande platformen10,11. Daarnaast is het mogelijk om stalen streepjescodes met metalen die resulteren in de besparingen van kostbare antilichamen, terwijl het verminderen van monster-naar-monster kleuring variabiliteit. Aan de andere kant, massa cytometrie heeft verschillende nadelen. Er zijn een beperkt aantal commercieel verkrijgbare antilichamen met metaal-Tags voor niet-bloed afgeleide cellen. Kwantificering van DNA-inhoud is minder gevoelig in vergelijking met het gebruik van fluorescerende DNA-kleurstoffen en massa cytometrie heeft een verminderd dynamisch bereik van signaaldetectie in vergelijking met fluorescentie flow cytometrie.
Het protocol dat hier wordt beschreven, is ontworpen om de dynamiek van de celcyclus van nieuw geïsoleerde keratinocyten (KCs) van de muis skin te analyseren en celcyclus specifieke eiwit expressie in deze cellen te karakteriseren met behulp van massa cytometrie. Dit protocol kan ook worden gebruikt met gekweekte cellen of aangepast aan andere celtypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Universiteit van Colorado Anschutz Medical campus ' institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité heeft de dierproeven goedgekeurd die in dit protocol worden beschreven.
1. preparaten
- Ontwerp een met metaal gelabeld antilichaam paneel. Gebruik de gratis online panel design software12 en omvatten 127iododeoxyuridine (idu), 164dy (dysprosium) GELABELD anti-CCNB1 (cyclin B1), 175Lu (lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), en 150 ND (neodymium)-pRETINOBLASTOMA proteïneSer807/811 (PRB)13. Voeg extra met metaal gelabelde antilichamen toe die niet overlappen in hun kanaal signaal14.
- Bereid een IdU stockoplossing voor. Los IdU poeder op 10 mg/mL in 0,1 N NaOH bij 60 °C. Aliquot IdU voorraadoplossing in micro centrifugebuizen en Vries bij-20 °C voor lange termijn opslag.
- Pas de pH van de IdU-oplossing direct voor gebruik aan op 7,5 met 12 N HCl. Test met een pH-strip op een weggooi aliquot om de oplossing te controleren op pH 7,5.
Opmerking: verlengde tijd (> 5 min) IdU bij pH 7,5 resulteert in neerslag en een vers aliquot van IdU is nodig wanneer dit gebeurt. - Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. handschoenen, Labcoat en veiligheidsbril) en werk in een veiligheidskast bij het hanteren van NaOH-of HCl-oplossingen.
- Pas de pH van de IdU-oplossing direct voor gebruik aan op 7,5 met 12 N HCl. Test met een pH-strip op een weggooi aliquot om de oplossing te controleren op pH 7,5.
- Bereid een 2x Paraformaldehyde (PFA) fixatie oplossing. Combineer 5 mL 10x PBS (pH 7,5) en 1 mL 16% PFA met 44 mL zuivere moleculaire kwaliteit dH2O (3,2% eindconcentratie).
Opmerking: een voorraad van PFA kan worden bereid zoals eerder gepubliceerd15 of kopen 16% aandelen vrij van verontreinigende metalen.- Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een veiligheidskast bij het hanteren van PFA-poeder en-oplossingen.
- Maak barium (BA2 +) gratis 1x PBS met een combinatie van 5 ml metaalvrije 10x PBS (pH 7,5) met 45 ml zuivere moleculaire kwaliteit DH2O.
Opmerking: de kwaliteit van PBS en andere reagentia is erg belangrijk om contaminerende metalen te voorkomen die achtergrondruis kunnen introduceren tijdens de analyse van massa-cytometrische gegevens. - Bereid een 100 mM cisplatine stockoplossing voor. Los 300,5 mg cisplatine poeder op in 10 mL DMSO. Bewaren in aliquots bij-80 °C. Bereid een 10 mM cisplatine werkoplossing voor experimenten te gebruiken over 1 d.
- Voorbereiding epidermis/dermis scheidingsoplossingen. Bereid een 20x dispase stockoplossing voor door 30 mg in 1 mL HBSS of PBS op te lossen. Filter steriliseren door een 0,22 μm filter en bewaar in aliquots bij-20 °C. Maak een 1x type IV Collagenase stockoplossing met 1 mg/mL in HBSS, filter steriliseren door een 0,22 μm filter en bewaar aliquots bij-20 °C.
2. etikettering van de S-fase door IdU-integratie
- Weeg muizen. Gebruik P1-P3 neonatale pups of 8-10 weken oude volwassen muizen en gebruik mannelijke of vrouwelijke muizen van een C57BL/6, FvB of 129 achtergronden. Bepaal een dosis bij 0,1 mg IdU (pH 7,5)/g lichaamsgewicht. Een muis van 25 g vereist bijvoorbeeld 0,25 mL IdU.
- Dien de dosis IdU toe door een intraperitoneale injectie en wacht 2 uur voor het oogsten van cellen. Gebruik een tuberculine spuit om neonatale pups te injecteren.
Opmerking: een dosis van 2 mg/mL IdU kan worden gebruikt met weefselkweek cellen met een incubatie van 1 uur bij 37 °C vóór het oogsten en labelen voor massa cytometrie.
3. isolatie van cellen voor het labelen
- Voorraadoplossingen van dispase en Collagenase ontdooien. Verdun de 20x dispase stockoplossing tot 1x (1,5 mg/mL) in steriele HBSS of PBS. Blijf op ijs tot het klaar is voor gebruik.
- Combineer 2 volumes dispase met 1 volume Collagenase in een totaal volume dat de huid vrij laat zweven. Zo kan de vertering van 5 neonatale muizen skins worden zweven op 8 mL 1x dispase met 4 mL Collagenase in een 100 mm Petri schaaltje.
- Volg goedgekeurde methoden om experimentele muizen te euthaniteren (bijv. een overdosis Isofluraan/teen knijp controle of CO2 inademing/cervicale dislocatie). Reinig de volwassen oorhuid met een jodiumoplossing (Zie tabel met materialen) en spoel met steriel water af wanneer geïsoleerde cellen worden gebruikt voor weefselkweek.
- Verwijder chirurgisch het oor aan de basis (Figuur 1a). Spoel oren in steriele PBS wanneer geïsoleerde cellen moeten worden gebruikt voor weefselkweek. Plaats op een droge 100 mm Petri schaal.
- Scheid voorzichtig van de achterste huid door een zakje in het midden of de rand van het snijgebied te maken met behulp van een fijne Tang en de twee huid kleppen uit elkaar te trekken ( Figuur 1b-D). Ga verder met zowel de voorste als de achterste huid.
Opmerking: gedetailleerde instructies voor het ontleden van de neonatale muis huid worden geleverd door Litchi et al.16 Bovendien kan het gebruik van een dissectie bereik helpen bij de scheiding van voorste van de achterste huid en de identificatie van de epidermis/dermale zijde van ontleed huid: haar is zichtbaar op de epidermis kant, terwijl de dermis een gelatineuze verschijning zal hebben. - Plaats de voorste en achterste huid van het oor zorgvuldig met de dermis-kant van de skin die de oplossing van de dispase/Collagenase ( Figuur 1e) aanraakt. Gebruik 1 mL voor zowel de voorste als achterste huid van een enkel oor per put van een 12-put cultuur plaat. Inincuberen bij 37 °C gedurende 1 uur. als alternatief, float skins op 1x dispase oplossing bij 4 °C voor 16-18 h.3
Opmerking: werk in een weefselkweek-kap met steriele techniek wanneer cellen moeten worden gekweekt. - Plaats de verteerde huid met de epidermis zijde die het oppervlak van een schone Petri schaal aanraakt. Afvlakken van de huid en schuif de dermis voorzichtig van de epidermis door te werken van Midden naar de randen in een cirkelvormig patroon.
- Gooi de dermis weg of verwerk het verder om fibroblasten te bevrijden voor weefselkweek of analyse16.
Opmerking: de dermis is donkerder van uiterlijk en heeft een gelatineuze en kleverige samenstelling. De dermis moet gemakkelijk af te komen. Falen of moeilijkheden bij het verwijderen van de dermis suggereert onvoldoende weefsel spijsvertering. Een verlengde incubatie in de verterings buffer zal echter de levensvatbaarheid van de cellen verminderen. De epidermis zal blijven op de Petri schaal en zal een gebleekt uiterlijk hebben. - Til de epidermis voorzichtig op door te grijpen aan de randen en schil het van het oppervlak van de Petri schaal. Plaats de epidermis voorzichtig op een voorverwarmde celloslating oplossing (Zie tabel met materialen) gedurende 5 min bij 37 °c of 20 min bij RT. gebruik 500 μl cel loslating oplossing voor 2 volwassen oor epidermises per put van een 12-put cultuur plaat en gebruik 750 μL celloslating oplossing voor een enkele neonatale epidermis per put van een 6-put cultuur plaat.
- Pak de epidermis met behulp van steriele Tang en scrub door de epidermis tegen de bodem van het gerecht te slepen om cellen te ontkoppelen. Voeg 1 mL DMEM toe met 1% FBS (0,01 mL) en door een celzeef van 40 μm in een opvang buisje. Spoel goed met een extra 2 mL DMEM en voeg toe aan de celsuspensie.
- Centrifugeer bij 120 x g gedurende 5 min. aspirate de supernatant zorgvuldig.
- Rethese celpellet in 1-2 mL DMEM met 1% FBS. Bepaal de cel en het aantal% levende cellen met Trypan Blue en een hemocytometer of geautomatiseerd telapparaat. Pelletcellen zoals beschreven in stap 3,11.
Opmerking: cellen kunnen na stap 3,12 worden gekweekt in geschikte weefselkweek media. 17
4. cisplatine labeling om levende/dode cellen te bepalen
- Respenderen 1-3 x 106 cellen per 1 ml DMEM met 25 μM cisplatine (2,5 μL voorraad/ml). Inbroed gedurende 1 minuut en dorst lessen door pipetteren met een gelijk volume FBS (bijv. 1 ml).
- Centrifugeer bij 120 x g gedurende 5 min. decanteer supernatant in een bekerglas met verdunde bleekwater en invertsbuizen om de resterende oplossing op een papieren handdoek af te tappen. Tik zachtjes om de oplossing te bevrijden die overblijft op de pellet en de zijwand van de buis.
- Resuspend celpellet in 2 mL ba+ 2-vrije PBS. Pelletcellen zoals beschreven in stap 4,2.
Opmerking: het wordt aanbevolen om cellen te repareren als ze niet onmiddellijk kunnen worden gekleurd.
5. fixatie van cisplatine gelabelde cellen (facultatief)
- Resuspend 1-3 x 106 cisplatine gelabelde cellen in 1 ml ba+ 2-vrije PBS. Vortex cellen onder continue laag vermogen en toevoegen druppelsgewijs 1 ml (1 volume) van de 2x PFA fixatie buffer. Incuberen bij RT gedurende 10 minuten op een schommel platform.
- Pellet cellen zoals beschreven in stap 4,2, maar Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten.
- Was cellen met 2 mL ba+ 2-vrije PBS-en pellet cellen zoals beschreven in stap 5,2. Herhaal stap 5,3 eenmaal.
- Respendeer de pellet in 2 mL ba+ 2-vrije PBS. Bewaren bij 4 °C voor < 3 d. Voeg FBS toe aan 3% (bijv. 0,3 mL FBS/mL cellen) van het totale volume als u langer > 3 d bewaart, meng en Vries dan bij-80 °C.
Opmerking: fixatie kan de detectie van bepaalde epitopen beïnvloeden. De effecten van fixatie op het antilichaam signaal moeten empirisch worden bepaald.
6. barcoding van monsters (facultatief maar aanbevolen)
- Pellet cellen zoals beschreven in stap 5,2 en vervolgens respenderen 1-3 x 106 cellen in 1 ml 1x fixatie buffer (Zie tabel met materialen). Incuberen bij RT gedurende 10 min. Pelletcellen zoals beschreven in stap 5,2.
- Was cellen met 1 mL barcode permeabilization buffer (Zie tabel met materialen). Pelletcellen zoals beschreven in stap 5,2. Herhaal stap 6,2 eenmaal.
- Voeg 100 μL barcode permeabilization buffer toe aan barcodes (Zie tabel met materialen)18 en meng onmiddellijk terwijl de cellen uit stap 6,2 pelleteren.
- Respendeer de celpellet in 800 μL barcode permeabilization buffer. Voeg barcode oplossing toe aan cellen, meng en inbroed bij RT voor 30 min. pellet cellen zoals beschreven in stap 5,2. Spoel cellen in 2 mL Celkleurings buffer (Zie tabel met materialen) en pellet opnieuw.
Opmerking: tot 20 samples kunnen worden gelabeld met verschillende combinaties van Palladium-metalen18. Andere barcoderende strategieën worden elders beschreven15.
7. etikettering van cellen voor massa cytometrie
- Respendeer 1-3 x 106 cellen in 1 ml kern antigeen kleurings buffer werkoplossing (Zie tabel van de materialen). Combineer samples in een enkele buis voor volgende stappen bij het gebruik van barcode monsters. Inincuberen bij RT gedurende 30 min. pellet zoals beschreven in stap 5,2.
- Respendeer 1-3 x 106 cellen in 2 ml nucleaire antigeen kleuring permeabilization buffer (Zie tabel met materialen). Schalen indien nodig. Gebruik bijvoorbeeld 6 mL buffer voor 10 gecombineerde samples met een celtelling van 9 x 106 cellen. Pellet zoals beschreven in stap 5,2.
- Herhaal stap 7,2. Draai de celpellet zachtjes in het restvolume dat in de buis is achtergebleven.
- Voeg 50 μL van de cocktail van het intracellulaire antilichaam toe per 1-3 x 106 cellen. Schalen indien nodig. Gebruik bijvoorbeeld 150 μL van de antilichaam cocktail voor 10 gecombineerde monsters met een celtelling van 9 x 106 cellen. Meng en incuberen bij RT gedurende 45 min. Voeg 2 mL Celkleurings buffer en pellet toe zoals beschreven in stap 5,2.
- Respendeer 1-3 x 106 cellen pellet in 2 ml Celkleurings buffer. Pelletcellen zoals beschreven in stap 5,2. Herhaal stap 7,5 eenmaal.
Opmerking: andere bufferoplossingen kunnen worden gebruikt voor het kleuren van extracellulaire membraan of cytoplasma markers en experiteerder wellicht om te optimaliseren van kleuring als er een noodzaak om te detecteren epitopen in verschillende cellulaire locaties. Cellen kunnen ook worden opgelost in PFA na stap 7,5 bij het gebruik van levende cellen voor vlekken. - Respendeer 1-3 x 106 cellen in 1 ml intercalatie oplossing en bewaar deze voor 1-3 d bij 4 °c.
- Bewaarcellen bij-80 °c in DMSO met de oplossing voor > 3 d. pellet cellen zoals beschreven in stap 5,2 als cellen in intercalatie oplossing. Respendeer pellet (1-3 x 106 cellen) in 1 ml celkleuring buffer en pellet cellen zoals beschreven in stap 5,2. Respendeer pellet in 1 mL 10% DMSO/90% FBS19, breng over naar een cryovial, plaats in een container voor het bevriezen van isopropanol en bewaar bij-80 °c.
- Pelletcellen zoals beschreven in stap 5,2. Was 1-3 x 106 cellen met 2 ml celkleurings buffer, omhullingen zoals beschreven in stap 5,2. Voer twee extra Wassers uit met 2 ml water, omhullingen zoals beschreven in stap 5,2.
- Verdun EQ-kalibratie kralen 1:9 in water (stockoplossing bij 3,3 x 105 kralen/ml).
- Respendeer de celpellet met een concentratie van 1 x 106 cellen/ml met verdunde EQ kraal oplossing. Filter cellen tot en met 35 μm zeef buizen.
- Voer samples uit op de Mass cytometer en verkrijg gegevens. De gegevens worden gedeponeerd in een FCS-bestandsindeling (flow Cytometry Standard).
8. verwerking en analyse van massacytometrie gegevensbestanden
- FCS-bestanden normaliseren. Gebruik een gratis programma beschikbaar op https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
- Deconvolute met FCS-bestanden. Scheid de gepoolde streepjescode populatie in afzonderlijke barcode bestanden met een gratis programma beschikbaar op https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
- Analyseer genormaliseerde FCS-bestanden. Gebruik commerciële21,22 of freeware programma's (Zie Web.Stanford.edu/Group/Nolan/resources.html).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1 toont de verwachte celopbrengsten en levensvatbaarheid van volwassen muizen oor (Figuur 1) en neonatale huid onder niet-pathologische omstandigheden. De tabel toont ook representatieve gegevens van dieren uit een gemengde C57/126 achtergrond. Verwacht wordt dat de huid van andere stammen zou resulteren in vergelijkbare celopbrengsten en vivaardigheden. De geschatte opbrengst is afhankelijk van het oppervlak van de huid en geeft aan dat de neonatale huid een betere keuze zou zijn voor experimenten waarvoor grotere aantallen cellen nodig zijn (tabel 1). Lage opbrengsten of verminderde levensvatbaarheid (< 50%) zou duiden op problemen met de spijsvertering of experimentele omstandigheden die de huid integriteit verminderen of induceren van celdood. Culturing cellen met de juiste media en supplementen kunnen helpen bij het beoordelen van de kwaliteit van KC preparaten17.
Na normalisatie20 en ontstuiving18 van FCS-bestanden, zal het geren van gegevens de epidermale celpopulaties van belang bepalen en de individuele celcyclus fasen demarkeren (Figuur 2). In bivariate plots die de 191ir versus 193IR-kanalen vergelijken, kunnen intacte cellen in het rechterbovenkwadrant worden gesloten (Figuur 2a). Het uitzetten van de lengte van de gebeurtenis versus 191IR en het selecteren van een strak cellen cluster bij de 191IR-as markeert afzonderlijke cellen. Levensvatbare cellen worden geselecteerd in een plot van 195pt VS 193IR plot door te gating voor cellen met lage 195PT niveaus. Het in Figuur 2a getoonde monster heeft puin en verhoogde aanwezigheid van cisplatine gelabeld niet-levensvatbare cellen. Dit kan erop duiden dat het monster overdreven verteerd, hard behandeld of op ijs of RT te lang voordat vlekken voor massa cytometrie. Profielen uit weefsel-gekweekte cellen geven doorgaans hogere percentages van 195PT negatieve cellen (Figuur 2b). Als alternatief kan de aanwezigheid van 195PT positieve cellen worden verwacht als de inductie celdood een kenmerk is van het experimentele model en/of de voorwaarden.
Idealiter moeten markers die de populatie van belang definiëren worden opgenomen in de analyse van specifieke celtypen. Bijvoorbeeld, immuuncellen die naar verwachting aanwezig zijn in ruwe KC-suspensies kunnen worden opgespoord door de toevoeging van een CD4523 -antilichaam, dat hematopoietische cellen detecteert (figuur 2c). Met betrekking tot de proliferatie antilichamen panel13, plotten Idu VS cyclin B1 lost celcyclus fasen (figuur 2c) vergelijkbaar met standaard Brdu/Pi flow plot (figuur 2D), waardoor de detectie van S-fase, G0/G1 en G2/M cel Bevolking. In IdU versus pHH3 plots identificeert hoog pHH3 positiviteit M fase cellen. Ten slotte kunnen gating G0/G1-cellen op een hoog pRB-signaal G0 (stilst) onderscheiden van cellen in G1 (figuur 2c, het meeste paneel links).
Na de verschillende fasen van de celcyclus te hebben geïdentificeerd, is het dan mogelijk om een grafische weergave van celcyclus profielen te construeren voor verschillende celtypen of experimentele omstandigheden. Bijvoorbeeld, afzonderlijke celcyclus profielen ontstaan bij het vergelijken van CD45-VS CD45 + celpopulaties (Figuur 3a) in de KC-suspensie zoals weergegeven in Figuur 2. Zoals verwacht hyperplastische KCS gevonden in de CD45-groep had minder cellen in G0 en meer cellen in S, G2, en M fasen3. Immuuncellen uit hetzelfde monster hadden daarentegen opmerkelijke populaties in G0 en G1. Naast celcyclus profielen is ook de karakterisering van genexpressie in een celcyclus afhankelijke manier mogelijk. Bijvoorbeeld, phospho eiwitten die helpen definiëren EGFR en mTOR/PI3K signalering werden geanalyseerd in de gegevens gepresenteerd voor Figuur 3a. Analyse van de G1-fasen van CD45-VS CD45 +-cellen onthulde een soortgelijk profiel voor EGFR-en mTOR/PI3K-signalering van eiwitten, hoewel er kleine verschillen bleken te zijn in het percentage van pS6-en pEGFR-positieve cellen (Figuur 3b). Vergelijkbare benaderingen kunnen worden aangepast aan de uitdrukking van andere signalering traject eiwitten of cellulaire processen in verschillende fasen van de celcyclus karakteriseren.
Figuur 1 : Voorbereiding van de muis oor huid voor de spijsvertering. (A) Verwijder eerst het oor van het dier en leg plat op een schone Petri schaal. B) pak een zijde van het oor aan het midden of de rand met behulp van gebogen precisie Tang. (C) flip over en gebruik een ander paar tang en trek voorzichtig de helften van het oor uit elkaar tot het oor scheurt op de plooi. D) doorgaan met trekken tot de zijkanten in twee helften worden gescheiden. (E) drijf de oorhelften op dissociatie media met de dermis-zijde die de oplossing aanraakt. Schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Gating strategie voor massa cytometrie gegevens. De gegevens in dit cijfer werd gegenereerd uit een experimenteel dier behandeld met de forbol Ester TPA zoals eerder beschreven3. TPA is een PKC Activator die ontsteking van de huid induceert24. A) de panelen tonen de initiële gating-strategie na normalisatie en deconvolutie van met een barcode gecodeerde gegevens. Door te gating op gebeurtenis lengte, 191ir,193IR en 195PT kanalen, is het mogelijk om te selecteren voor intact, single, en levensvatbare cellen. B) menselijke SCC SRB-P93 -cellen behandeld met DMSO en werden vervolgens gekleurd voor massa cytometrie. Gegevens werden afgesloten als in (a) en het plot toont de niveaus van levende cellen in dit voorbeeld. C) de opneming van Lineage markers maakt het mogelijk om de celpopulaties van belang te selecteren. Voor dit voorbeeld zijn levensvatbare cellen van (a) afgesloten op gebeurtenis lengte versus CD45 om hematopoietische cellen uit te sluiten. Gating CD45-cellen voor de opname van IdU VS CYCLIN B1 maakt het mogelijk om de celpopulaties S, G0/G1 en G2/M te identificeren. Selectie van pHH3 hoge cellen definieert M-fase, terwijl de analyse van G0/G1 voor positiviteit van pRB cellen identificeert in G1. D) het waarnemingspunt toont de representatieve resultaten van de celcyclus analyse door de detectie van Brdu-opname en Pi (DNA-gehalte) met fluorescentie-gebaseerde stromings cytometrie. De getoonde gegevens zijn afkomstig van humane Colo163 SCC-cellen die zijn gekweekt met Brdu voor 1 uur, zoals eerder beschreven3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Karakterisering van celcyclus profielen en fase-specifieke eiwit expressie. A) de celcyclus profielen werden bepaald in het monster uit Figuur 2 voor CD45-VS CD45 + cellen. B) analyse van de G1-fasen met fosho-specifieke antilichamen in CD45-(oranje) en CD45 + (blauwe) cellen onthulde vergelijkbare uitdrukkings profielen voor markers van de EGFR-en mtor/PI3K-signalerings trajecten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Weefsel | Gebied | Celopbrengst | Levensvatbaarheid |
| Muis oor | 225-230 mm3 | 1-2x106 | 70-90% |
| Neonatale huid | 1000-1100 mm3 | 5-10x106 | 80-99% |
Tabel 1: typische celopbrengsten en levensvatbaarheid van volwassen muizen oor en neonatale huid. Celtellingen en levensvatbaarheid door Trypan blauwe uitsluiting werden gemiddeld van Oorkcs geoogst van n = 7 8-10 week oude volwassen muis oren of n = 7 P3 neonatale huiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het in dit document beschreven protocol kan in ongeveer 8 uur worden ingevuld. Het eindresultaat is een suspensie van cellen verrijkt in KCs die kunnen worden geanalyseerd voor eiwit expressie in een celcyclus-afhankelijke manier. Verschillende eerdere studies hebben methoden beschreven om KCS te isoleren van de menselijke en muis huid16,25. Deze studies omvatten ook protocollen voor de isolatie van KCS voor flow flowcytometrieonderzoeken26. Echter, een gedetailleerd protocol is niet eerder beschreven dat de isolatie van KCs combineert met de analyse van eiwit expressie en celcyclus dynamiek met behulp van massa cytometrie.
De grootste hindernis voor het verkrijgen van kwalitatief hoogstaande resultaten in dit protocol is de kwaliteit van de gebruikte levende cellen. In de literatuur, de voorgestelde voorwaarden en enzymen voor epidermis/dermis scheiding variëren sterk16,25,26,27. Echter, het is daarom aanbevolen om de tijd van de vertering van de huid te houden tot de kortst mogelijke duur die effectieve scheiding van de epidermis van de dermis mogelijk maakt. Dit protocol presenteert de spijsvertering met dispase en type IV Collagenase, waarmee de neonatale huid van zowel ear als muis binnen 1 uur kan worden gescheiden. Dit resulteert in voldoende celopbrengsten met een hoge cellevens vatbaarheid. Een andere factor die van invloed kan zijn op de kwaliteit van de cellen is de locatie van de huid geselecteerd voor de spijsvertering. Men gaat ervan uit dat de KCs zich op dezelfde manier gedragen van verschillende anatomische locaties in het lichaam. De huid op verschillende plaatsen kan echter verschillende eigenschappen hebben en de samenstelling van de stamcel28,29. Niettemin heeft het gebruik van neonatale en oorhuid3,30 de voorkeur omdat de isolatie van KCS moeilijker is uit gebieden van de huid met een hoge dichtheid van haarfollikels (bijv. rughuid). Een hogere mate van manipulatie of weefsel dissociatie kan nodig zijn voor een efficiënte isolatie van KCs uit harige gebieden van de muis26. De experimentele omstandigheden voorafgaand aan de isolatie van KCs kunnen ook de kwaliteit van geïsoleerde cellen beïnvloeden. Huidlaesies of aandoeningen die de huidbarrière of huid integriteit beïnvloeden, kunnen de scheiding van epidermis van de dermis verminderen. Dit kan resulteren in verminderde opbrengsten van levensvatbare cellen of verhoogde verontreiniging van niet-KC-cellen (bijv. immuuncellen). Tot slot zijn geïsoleerde KCs vatbaar voor klonteren. Ze kunnen ook de levensvatbaarheid van de cel verliezen als ze te lang op ijs of bij RT achterblijven voordat ze worden verwerkt voor massa cytometrie of andere analyses van één cel.
De kleurings methodiek voor massa cytometrie is vergelijkbaar met die gebruikt voor fluorescentie flow cytometrie maar met belangrijke verschillen. De detectie van DNA-replicatie wordt bijvoorbeeld bewerkstelligd door directe detectie van IdU in plaats van door het gebruik van antilichamen tegen nucleotide-analogen zoals BrdU. De directe detectie van de IdU vereenvoudigt de identificatie van S-fase cellen, omdat de detectie van antilichamen van BrdU een betrokken procedure kan zijn. Een ander verschil is het gebruik van cisplatine voor de discriminatie van dode en levende cellen. Cisplatine etiketten preferentieel dode cellen. Deze stap is vergelijkbaar met het gebruik van PI of andere vlekken voor Dead/Live FACS experimenten. De cisplatine kleurings stap is belangrijk omdat dode cellen antilichamen kunnen binden en daardoor vals positieve signalen genereren. Mass cytometrie gebruikt ook antilichamen om de uitdrukking van de fasespecifieke marker te detecteren in plaats van het meten van DNA-inhoud. Dit maakt een faciele discriminatie van individuele celcyclus fasen mogelijk. Ten slotte moeten de massacytometry data (FCS)-bestanden worden genormaliseerd met behulp van de piek in ijkkralen als gevolg van het monster signaal verslechtering na verloop van tijd in het CyTOF instrument tijdens dezelfde run en tussen runs.
Kleuring, gegevensverzameling en analyse voor massa-cytometrie is goed beoordeeld door recente publicaties14,15. De toepassing van deze technologie op de analyse van hematopoietische en immuuncellen is goed gedocumenteerd. Dit blijkt uit een grote verzameling commercieel verkrijgbare, met metaal gelabelde antilichamen en het overwicht van immuungerelateerde publicaties met behulp van deze technologie. De onmiddellijke toepassing van massa cytometrie in de huid zou zijn voor de analyse van immuuncellen. Dit is met name relevant voor muizen huid modellen in ziekten zoals kanker waar ontsteking een belangrijke rol heeft. Voor niet-immuuncelanalyse kan het ontbreken van commercieel verkrijgbare met metaal gelabelde antilichamen een belemmering vormen. Het voordeel van commerciële reagentia is dat ze zonder aanzienlijke optimalisatie kunnen worden gebruikt, zoals in huis met metaal gelabelde antilichamen. Er zijn echter met metaal gelabelde antilichamen tegen veelgebruikte fluorescerende Tags (bijv. FITC, PE en APC) die een experimenteerder in staat stellen om extra markeringen toe te voegen aan hun kleurings paneel. Deze oplossing kan ook worden toegepast op de analyse van huidcellen in verschillende soorten waar er een beperkt aantal commerciële metaal-gelabelde antilichamen kan zijn die reactiviteit tussen verschillende soorten vertonen. Niettemin vereist deze oplossing ook een extra kleurings stap na de kleuring van cisplatine en enige optimalisatie. Een extra overweging voor het opbouwen van een succesvol panel wordt besproken in de literatuur14. Een ander nadeel van massa cytometrie is dat het verzamelen van de gegevens efficiëntie van massa-Cytometers 40-60% van het invoercel nummer kan zijn. Als zodanig kan de analyse van zeldzame celpopulaties (bijv. stamcellen) uit bulk monsters een groter aantal cellen vereisen, bundeling van monsters voor effectieve opsporing, of andere benaderingen om de celpopulatie van belang te verrijken voorafgaand aan kleuring voor massa cytometrie 24.
Mass cytometrie is een krachtige opkomende technologie waarvan het gebruik zal blijven groeien. Op dit moment is de toepassing van deze technologie gericht op het gebruik van metaal-gelabelde antilichamen, maar het werd onlangs uitgebreid voor de detectie van mRNA31. Bovendien, er is het potentieel van het labelen van andere cellulaire componenten of metabolieten met metalen labels, die zou uitbreiden het bereik van de toepassing voor massa cytometrie in de huid en andere weefsels van muizen, menselijke, en andere soorten. Samenvattend kan dit protocol de experimentele gereedschappen die voor huid biologen beschikbaar zijn, uitbreiden om KC-eiwit expressie in de verschillende celcyclus fasen te correleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ondersteuning voor dit werk kwam van het departement Dermatologie, het Gates Center for regeneratieve geneeskunde aan de Universiteit van Colorado en de Universiteit van Colorado (UC) huidziekte centrum morfologie en Fenotyping cores (NIAMS P30 AR057212). De auteurs erkennen de UC Cancer Center flow Cytometrie Shared resource en ondersteuning Grant (NCI P30 CA046934) voor de werking van de Mass cytometer en zijn dankbaar voor Karen helm en Christine Childs in de kern voor hun deskundig advies over flow en Mass flowcytometrische Technieken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM - Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
- http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
