Summary
이 프로토콜은 마우스 모델에서 피부 각질을 분리하고, 금속 태그가 달린 항체로 염색하고, 다른 세포 주기 단계에서 관심 있는 단백질의 발현 패턴을 프로파일화하기 위해 질량 세포 측정에 의해 염색된 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표는 마우스 피부의 표피로부터 단리된 단일 세포를 사용하여 세포 주기 의존적 방식으로 단백질 발현 변화를 검출하고 정량화하는 것이다. 7개의 중요한 단계가 있습니다: 진피에서 표피의 분리, 표피의 소화, 시스플라틴을 가진 표피 세포 집단의 염색, 견본 바코드, 세포 주기 마커 및 단백질을 위한 금속 태그가 붙은 항체를 가진 염색 관심, 질량 세포 분석에 의한 금속 태그 항체의 검출, 및 다양한 세포 주기 상에서발현의 분석. 조직학적 방법에 대한 이러한 접근법의 장점은 세포 주기의 상이한 단계에서 단일 세포에서 >40의 발현 패턴을 분석할 수 있는 가능성이다. 이 접근은 또한 조직학/화상 진찰 방법 보다는 더 정량화할 수 있는 단백질 발현의 다변량 상관 성 분석을 허용합니다. 이 프로토콜의 단점은 단일 세포의 현탁액이 필요하며, 이는 조직 섹션의 염색에 의해 제공되는 위치 정보의 손실을 초래한다는 것입니다. 이 접근법은 또한 조세포 현탁액에서 상이한 세포 유형을 식별하기 위해 추가 마커의 포함을 요구할 수 있다. 이 프로토콜의 적용은 과형성 피부 질환 모델의 분석에서 분명합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 계보 특이적 항체의 첨가에 의해 특정 하위 유형의 세포(예를 들어, 줄기 세포)의 분석을 위해 적응될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 다른 실험 종에서 피부 세포의 분석을 위해 적응될 수 있다.
Introduction
세포 주기 단계와 유전자 발현의 상관관계는 암과 같은 과형성 질환의 동물 모델 분석에 여전히 도전과제로 남아 있다. 이 도전의 일부는 증식의 마커를 가진 관심있는 단백질 (POI)의 공동 검출입니다. 증식 세포는 G1, S, G2 및 M. Ki67을 포함한 다양한 세포 주기 단계에서 발견될 수 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 증식 마커 중 하나이며 세포 주기의 모든 단계에서 발현된다. 그것은 광범위하게 인간과 마우스 조직 모두의 분석에사용되어왔다 1,2,3. 그러나, 다른 일반적인 증식 마커 처럼, Ki67 개별 세포 주기 단계를 분별 하지 않습니다. 보다 정밀한 접근법은 브로모데독시우리딘(BrdU)과 같은 티미딘 뉴클레오티드 유사체를 게놈(즉, S상)을적극적으로 복제하는 세포에 4,5를사용합니다. 뉴클레오티드 유사체의 사용에 대한 한 가지 단점은 분석 하기 전에 살아있는 동물에 그들을 관리 하는 필요. Ki67 및 BrdU는 항체의 사용에 의해 고정된 조직 단면도에서 일반적으로 검출됩니다. 이 접근법의 한 가지 장점은 POI의 위치가 조직 아키텍처(예를 들어, 피부 표피의 기저층) 내에서 확인될 수 있다는 것입니다. 이 접근은 또한 유전자 발현에 있는 변경으로 이끌어 낼 수 있는 조직 해리를 요구하지 않습니다. 한 가지 단점은 OCT 동결 또는 파라핀 절편을 위한 조직의 조직 고정 또는 처리가 항체 표적(즉, 항원)을 폐색시킬 수 있다는 것이다. 항원의 검색은 전형적으로 열 또는 조직 소화를 요구합니다. 염색 강도의 정량화도 어려울 수 있습니다. 이는 염색, 단면 두께, 신호 감지 및 실험자 바이어스의 변화에 기인합니다. 또한 대부분의 일반적인 실험실 설정에서 제한된 수의 마커를 동시에 감지할 수 있습니다. 그러나, 새로운 멀티플렉스 염색 접근 방식은 이러한 한계를 극복할 것을 약속합니다. 예는 이미징 질량 세포 측정 및 티라 미드신호 증폭 6,7.
유세포측정은 증식 세포를 검출하는 또 다른 강력한 기술입니다. 그것은 동일 세포에 있는 마커의 다중 검출을 허용합니다 그러나 대부분의 비 조혈 세포 모형을 위한 조직 해리를 요구합니다. 증식 세포의 분석은 DNA를 결합하는 염료(예를 들어, 프로피듐 요오드화물(PI))의사용에 의해 일상적으로 수행된다 8. 유세포측정은 또한 BrdU 법인9의검출과 결합될 때 세포 주기 단계의 보다 정확한 측정을 허용한다. 강력한 접근 방식이지만 BrdU/PI 유동 세포측정은 단점이 있습니다. 위상 특이적 항체를 포함하지 않고는 G2/M 및 G0/G1 단계를 해결할 수 없습니다. 그러나, 사용될 수 있는 항체의 수는 세포 자가형광, 불소 방출의 스펙트럼 유출, 및 보상 제어의 사용에 의해 제한된다. 이 한계는 POI를 가진 세포 주기 마커의 표현을 공동 검출하기 위하여 더 도전적이고 힘든 표시합니다. 더 허구적인 접근법은 질량 세포 분석10,11을사용하는 것입니다. 이 기술은 더 좁은 검출 스펙트럼을 가진 금속 공액 항체를 사용합니다. 일단 세포가 금속 태그가 달린 항체로 염색되면 기화되고 세포 분석 시간(CyTOF) 질량 분석법에 의해 검출된 금속이 기화됩니다. 이러한 특성으로 인해 질량 세포 분석은 기존 플랫폼10,11을사용하여 >40 다른 마커의 멀티플렉스 검출을 가능하게 한다. 또한, 귀중한 항체를 절감하는 한편 시료 간 염색 가변성을 줄이는 금속으로 시료를 바코드화할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 질량 세포측정은 몇몇 단점이 있습니다. 비혈액 유래 세포에 대한 시판되는 금속 태그항체의 수가 제한되어 있다. 형광 DNA 염료 및 질량 세포측정의 사용에 비해 DNA 함량의 정량화는 형광 유동 세포측정에 비해 신호 검출의 감소된 동적 범위를 가지고 있다.
여기에서 기술된 프로토콜은 마우스 피부로부터 새로 단리된 각질세포(KC)로부터 세포 주기 역학을 분석하고 대량 세포분석기를 사용하여 이들 세포에서 세포 주기 특정 단백질 발현을 특성화하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 또한 배양된 세포와 함께 사용되거나 다른 세포 유형에 적응될 수 있다.
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Protocol
콜로라도 안슈츠 대학 의과 대학' 기관 동물 관리 및 사용 위원회는이 프로토콜에 설명 된 동물 실험을 승인.
1. 준비
- 금속 태그가 지정된 항체 패널을 디자인합니다. 무료 온라인 패널 설계 소프트웨어(12)를 사용하고 127개의IododeoxyUridine(IdU), 164Dy(Dysprosium) 라벨이 부착된 안티 CCNB1(CYCLIN B1), 175Lu(루테리움) 인포(p)-HISTONEH3 Ser28(pHH3) 및 150을 포함합니다. Nd (네오디뮴)-pRETINOBLASTOMA 단백질Ser807/811 (pRB)13. 그들의 채널신호(14)에서겹치지 않는 추가금속 태그가 달린 항체를 추가한다.
- IdU 재고 솔루션을 준비합니다. IdU 분말을 60°C에서 0.1 N NaOH에서 10 mg/mL로 용해시면 됩니다. Aliquot IdU 스톡 솔루션을 미세 원심 분리튜브에 넣고 -20°C에서 동결하여 장기 보관합니다.
- 사용하기 직전에 12 N HCl으로 IdU 용액의 pH를 7.5로 조정합니다. 용액이 pH 7.5에 있는지 확인하기 위해 폐기 aliquot에 pH 스트립으로 테스트합니다.
참고: pH 7.5에서 IdU의 장시간(>5분)은 강수량이 발생하고 이 경우 IdU의 새로운 aliquot가 필요합니다. - 적절한 개인 보호 장비(예: 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 사용하고 NaOH 또는 HCl 솔루션을 취급할 때 안전 캐비닛에서 작업하십시오.
- 사용하기 직전에 12 N HCl으로 IdU 용액의 pH를 7.5로 조정합니다. 용액이 pH 7.5에 있는지 확인하기 위해 폐기 aliquot에 pH 스트립으로 테스트합니다.
- 2x 파라포름알데히드(PFA) 고정 용액을 준비한다. 5 mL의 10x PBS (pH 7.5) 및 1 mL의 1 mL 16% PFA와 44 mL의 순수 분자 등급 dH2O (3.2% 최종 농도)를 결합합니다.
참고 : PFA의 주식은 이전에 게시 된 대로 준비 할 수 있습니다15 또는 구매 16% 오염 금속무료 주식.- PFA 분말 및 용액을 취급할 때 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 안전 캐비닛에서 작업하십시오.
- 5 mL의 금속이 없는 10x PBS(pH 7.5)와 45 mL의 순수 분자 등급 dH2O를 결합하여 바륨(Ba2+)무료 1x PBS를 준비합니다.
참고: PBS 및 기타 시약의 품질은 질량 세포 측정 데이터를 분석하는 동안 배경 잡음을 유발할 수 있는 금속을 오염시키는 것을 방지하는 데 매우 중요합니다. - 100mM 시스플라틴 스톡 솔루션을 준비합니다. DMSO 10 mL에 시스플라틴 파우더 300.5 mg을 녹입니다. -80 °C에서 알리쿼트에 보관하십시오. 1d 이상 사용할 실험을 위해 10 mM cisplatin 작업 솔루션을 준비합니다.
- 표피/진피 분리 솔루션을 준비합니다. HBSS 또는 PBS의 1 mL에 30 mg을 용해시켜 20x 디스파스 스톡 용액을 준비합니다. 0.22 μm 필터를 통해 필터를 살균하고 -20 °C에서 알리쿼트에 보관하십시오. HBSS에서 1 mg/mL로 1x 타입 IV 콜라게나아제 스톡 용액을 준비하고 0.22 μm 필터를 통해 필터를 살균하고 -20°C에 aliquots를 저장합니다.
2. IdU 법인에 의한 S상 라벨링
- 마우스를 계량합니다. P1-P3 신생아 새끼 또는 8-10주 된 성인 마우스를 사용하고 C57BL/6, FvB 또는 129개의 배경에서 수컷 또는 암컷 마우스를 사용하십시오. 0.1 mg IdU (pH 7.5)/g 체중에서 복용량을 결정합니다. 예를 들어, 25g 마우스에는 0.25 mL의 IdU가 필요합니다.
- 복강 내 주사에 의해 IdU의 복용량을 관리하고 세포를 수확하기 전에 2 시간 동안 기다립니다. 신생아 새끼 를 주입하는 결핵 주사기를 사용합니다.
참고: IdU의 2 mg/mL의 복용량은 대량 세포 측정을 위해 수확하고 라벨링하기 전에 37 °C에서 1 시간 배양된 조직 배양 세포와 함께 사용할 수 있습니다.
3. 라벨링을위한 셀 의 격리
- 해동 디스파스 와 콜라게나제 스톡 솔루션. 멸균 HBSS 또는 PBS에서 20x 디스파스 스톡 용액을 1x(1.5 mg/mL)로 희석합니다. 사용할 준비가 될 때까지 얼음을 유지하십시오.
- 2부분량의 디스파스와 콜라게나아제 1부량을 총 부피로 결합하여 피부가 자유롭게 떠다닐 수 있도록 합니다. 예를 들어, 5개의 신생아 마우스 스킨의 소화는 100 mm 페트리 접시에 4 mL의 콜라게나아제와 함께 1x 디스파제의 8 mL에 떠있을 수 있습니다.
- 실험 마우스를 안락사시키는 승인된 방법을 따르십시오 (예를 들어, 이소플루란 과다 복용 / 발가락 핀치 검사 또는 CO2 흡입 / 자궁 경부 탈구). 요오드 용액으로 성인 귀 피부를 청소하고 (재료 표참조) 분리 된 세포가 조직 배양에 사용될 때 멸균수로 헹구어 줍니다.
- 외과적으로 기지에서 귀를 제거합니다 (그림1A). 분리된 세포가 조직 배양에 사용될 때 멸균 된 PBS에서 귀를 헹구는 다. 건조한 100mm 페트리 접시에 놓습니다.
- 미세한 집게를 사용하여 절단 영역의 중간 또는 가장자리에 포켓을 만들고 두 개의 피부 플랩을 분리하여 후방 피부로부터 조심스럽게 앞쪽으로 분리합니다(그림 1B-D). 전방 및 후방 스킨을 모두 진행합니다.
참고 : 신생아 마우스 피부를 해부하는 자세한 지침은 Litchi et al.16에 의해 제공됩니다. 또한 해부 범위의 사용은 후방 피부에서 전방을 분리하고 해부된 표피 / 진피 면을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 피부: 머리카락은 표피 측에서 볼 수 있는 반면 진피는 젤라틴 모양을 갖습니다. - 디스파제/콜라게나아제 용액을 만지는 피부의 진피 면과 함께 귀의 전방 및 후방 피부를 조심스럽게 놓습니다(그림 1E). 12웰 배양 플레이트의 웰당 단일 귀의 전방 및 후방 피부 모두에 1 mL을 사용하십시오. 37°C에서 1시간 동안 배양, 1x 디스파제 용액에 16-18h.3
참고 : 세포가 배양 될 때 멸균 기술로 조직 배양 후드에서 작동합니다. - 깨끗한 페트리 접시의 표면에 닿는 표피 쪽으로 소화 된 피부를 놓습니다. 피부를 평평하게 하고 원형 패턴으로 중앙에서 가장자리까지 작업하여 표피에서 진피를 부드럽게 밀어 냅니다.
- 진피를 버리거나 조직 배양 또는 분석을 위한 섬유아세포해방을 위해 더 소화한다16.
참고 : 진피의 외관이 어두워지고 젤라틴과 끈적 끈적한 구성이 있습니다. 진피는 쉽게 벗겨져야합니다. 진피 제거에 실패 또는 어려움은 부족한 조직 소화를 건의합니다. 그러나, 소화 버퍼에 있는 확장된 배양은 세포 생존을 감소시킬 것입니다. 표피는 페트리 접시에 남아 표백 된 모양을해야합니다. - 가장자리를 잡고 조심스럽게 표피를 들어 올리고 페트리 접시의 표면에서 벗깁니다. 미리 온난한 세포 분리 용액에 표를 조심스럽게 놓고 (재료 표참조) RT에서 37 °C 또는 20 분에서 5 분 동안 500 μL의 세포 분리 용액을 사용하여 12 웰 배양 판당 2 성인 귀 표피에 500 μL을 사용하고 750 μL의 세포 분리를 사용합니다. 6 웰 배양 판의 우물 당 하나의 신생아 표피에 대한 솔루션.
- 멸균 집게를 사용하여 표피를 잡고 표피를 접시의 바닥에 드래그하여 세포를 해리합니다. 1% FBS (0.01 mL)를 포함하는 DMEM 의 1 mL을 추가하고 수집 튜브로 40 μm 세포 체를 통과합니다. DMEM 2 mL를 추가로 헹구고 셀 서스펜션에 추가하십시오.
- 원심분리기는 120 x g에서 5 분 동안 조심스럽게 흡인합니다.
- 1% FBS를 함유하는 DMEM의 1-2 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단. Trypan Blue 및 혈세포계 또는 자동화 된 계수 장치를 사용하여 셀 및 % 라이브 셀 카운트를 결정합니다. 펠릿 세포는 단계 3.11에 기재된 바와 같이.
참고: 세포는 3.12단계 이후 적절한 조직 배양 배지에서 배양될 수 있다. 17세
4. 살아있는 / 죽은 세포를 결정하는 시스 플라틴 라벨링
- 25 μM 시스플라틴(2.5 μL의 스톡/mL)을 함유한 DMEM 1mL당 1-3 x 10 6셀을 다시 일시 중단합니다. 1 분 동안 배양하고 동일한 부피의 FBS (예 : 1 mL)로 파이펫팅하여 담금질하십시오.
- 120 x g에서 5 분 동안. 희석 표백제와 반전 튜브를 포함하는 비커에 120 x g의 원심 분리기를 종이 타월에 남은 용액을 배출합니다. 부드럽게 탭하여 튜브의 펠릿과 측벽에 남아 있는 용액을 해방시냅니다.
- Ba+2-free PBS 의 2 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 펠릿 세포는 단계 4.2에 기재된 바와 같이.
참고 : 즉시 얼룩질 수없는 경우 세포를 수정하는 것이 좋습니다.
5. 시스플라틴 라벨 셀 의 고정 (선택 사항)
- Ba+2-free PBS의 1 mL에서 1-3 x 106 시스플라틴 라벨 세포를 다시 일시 중단하십시오. 연속 저전력 하에서 와류 세포를 2x PFA 고정 버퍼의 드롭와이즈 1 mL(1 볼륨)을 추가합니다. 흔들 플랫폼에서 RT에서 10 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 펠렛 세포는 단계 4.2에 기재된 바와 같이, 500 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하였다.
- 5.2단계에서 설명한바와 같이 2 mL의 Ba+2-free PBS 및 펠릿 셀로 세포를 세척하였다. 5.3단계를 한 번 반복합니다.
- 바+2-free PBS의 2 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 4°C에서 <3 d. FBS를 3%(예: FBS/mL 셀의 0.3 mL)에 추가한 후 더 오래 저장하는 경우 >3d를 더 오래 보관한 다음 -80°C에서 혼합및 동결합니다.
참고: 고정은 특정 에피토프의 검출에 영향을 줄 수 있습니다. 항체 신호에 대한 고정의 효과는 경험적으로 결정될 필요가 있습니다.
6. 샘플의 바코드 (선택 사항이지만 권장)
- 펠렛 셀은 5.2단계에서 설명한 대로 1x 고정 버퍼의 1 mL에서 1-3 x 106 셀을 다시 일시 중단합니다(재료 표참조). 5.2단계에서 설명한 바와 같이 RT에서 10분 동안 펠릿 세포를 배양하였다.
- 바코드 투과 버퍼의 1 mL로 셀을 세척하십시오(재료 표참조). 5.2단계에서 기재된 바와 같이 펠릿 세포. 6.2단계를 한 번 반복합니다.
- 바코드에 100 μL의 바코드 투과 버퍼를 추가하고(재료 표참조)18을 넣고 6.2단계의 셀이 펠릿화되는 동안 즉시 혼합합니다.
- 바코드 투과 완충액의 800 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 5.2단계에서 설명한 바와 같이 셀에 바코드 솔루션을 추가하고 RT에서 30분 동안 혼합및 배양합니다. 세포 염색 완충제 2 mL에서 세포를 세척하고 다시 펠릿을 확인하십시오.
참고 : 최대 20 개의 샘플은 팔라듐 금속18의다양한 조합으로 표지 될 수 있습니다. 다른 바코드 전략은 다른곳에서 설명 15.
7. 질량 세포 측정을 위한 세포의 표지
- 핵 항원 염색 완충액 의 1 mL에 1-3 x 106 세포를 다시 일시 중단하십시오 (재료 표참조). 바코드 된 샘플을 사용할 때 후속 단계를 위해 샘플을 단일 튜브로 결합하십시오. 5.2단계에서 설명한 바와 같이 RT에서 30분 동안 펠렛을 배양한다.
- 핵 항원 염색 투과 완충액의 2 mL에서 1-3 x 106 세포를 다시 일시 중단하십시오 (재료 표참조). 필요에 따라 배율을 조정합니다. 예를 들어, 9 x 106 셀의 셀 카운트와 함께 10개의 결합된 샘플에 대해 6mL의 버퍼를 사용합니다. 5.2단계에서 설명한 바와 같이 펠릿.
- 7.2단계를 반복합니다. 튜브에 남아있는 잔류 부피에서 세포 펠릿을 부드럽게 소용돌이치십시오.
- 1-3 x 106 세포 당 세포 내 항체 칵테일 50 μL을 추가하십시오. 필요에 따라 배율을 조정합니다. 예를 들어, 9 x 106 세포의 세포 수와 10 결합 된 샘플에 대한 항체 칵테일의 150 μL을 사용합니다. 45 분 동안 RT에서 혼합하고 배양. 단계 5.2에 설명 된 바와 같이 세포 염색 완충제 및 펠릿의 2 mL를 추가합니다.
- 세포 염색 완충액 2 mL에 1-3 x 106 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 5.2단계에서 기재된 바와 같이 펠릿 세포. 7.5단계를 한 번 반복합니다.
참고: 다른 완충액은 세포외 막 또는 세포질 마커염색에 사용될 수 있으며, 실험자는 다른 세포 위치에서 에피토프를 검출할 필요가 있는 경우 염색을 최적화해야 할 수 있습니다. 세포는 염색을 위해 살아있는 세포를 사용하는 경우 7.5 단계 후에 PFA에서 고정될 수 있습니다. - 인터칼레이션 용액 의 1 mL에 1-3 x 106 세포를 다시 중단하고 4 °C에서 1-3 d용으로 보관하십시오.
- 세포가 인터칼레이션 용액에 있는 경우 5.2단계에서 설명한 바와 같이 펠릿 세포 >3 d. 펠렛 세포에 대한 용액을 포함하는 DMSO에서 -80°C에서 세포를 저장한다. 5.2단계에서 설명한 바와 같이 1 mL의 세포 염색 완충제 및 펠릿 세포에서 펠릿(1-3 x 106 세포)을 다시 중단시켰다. 10% DMSO/90% FBS19의1 mL에 펠릿을 다시 일시 중단하고, 극저온으로 옮기고, 이소프로판올 동결 용기에 넣고-80°C에서 보관하십시오.
- 5.2단계에서 기재된 바와 같이 펠릿 세포. 1-3 x 106 세포를 2 mL의 세포 염색 완충액으로 씻어 내고, 5.2 단계에서 설명한 바와 같이 펠릿을. 5.2단계에서 설명한 대로 2 mL 의 물로 2개의 추가 세서를 수행합니다.
- 희석 EQ 교정 비드 1:9 물에 (3.3 x 105 비드 / mL에서 재고 용액).
- 희석 된 EQ 비드 용액으로 1 x 106 세포 / mL의 농도로 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 35 μm 스트레이너 캡 흐름 튜브를 통해 세포를 필터링합니다.
- 질량 세포계에서 샘플을 실행하고 데이터를 수집합니다. 데이터는 유세포 분석 표준(FCS) 파일 형식으로 증착됩니다.
8. 대량 세포 분석 데이터 파일 처리 및 분석
- FCS 파일을 정규화합니다. https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20에서 사용할 수있는 무료 프로그램을 사용
- Deconvolute 바코드 FCS 파일. 풀된 바코드 모집단을 별도의 바코드 파일로 분리하고 https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18에서 사용할 수 있는 무료 프로그램을 제공합니다.
- 정규화된 FCS 파일을 분석합니다. 상업용21,22 또는 프리웨어 프로그램을 사용합니다(web.stanford.edu/group/nolan/resources.html 참조).
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Representative Results
표 1은 비병리학적 조건 하에서 성인마우스 귀 및 신생아 피부로부터의 예상 세포 수율 및 생존율을 나타낸다. 이 표에는 혼합 C57/126 배경에서 동물의 대표 데이터도 표시됩니다. 그것은 다른 균주의 피부가 유사한 세포 수율과 부채를 초래할 것으로 예상된다. 대략적인 수율은 피부의 표면적에 의존하며 신생아 피부가 더 많은 수의 세포를 필요로 하는 실험에 더 나은 선택이 될 것임을 나타냅니다(표 1). 낮은 수율 또는 감소된 생존율(&50%) 피부 무결성을 감소 또는 세포 죽음의 유도 소화 또는 실험 조건 문제를 나타냅니다. 적절한 매체 및 보충제로 세포를 배양하면 KC 제제의 품질을 평가하는 데 도움이 될 수있다 17.
FCS 파일의 정규화20 및 deconvulation18에 이어, 데이터의 게이팅은 관심있는 표피 세포 집단을 정의하고 개별 세포 주기 단계를 표시합니다 (그림 2). 191Ir 대 193Ir 채널을 비교하는 양변량 플롯에서, 손상되지 않은 셀은 오른쪽 상단 사분면에서 게이트될 수 있다(그림2A). 이벤트 길이 대 191Ir을 플로팅하고 191Ir 축 근처의 단단한 셀 클러스터를 선택하여 단일 셀을 표시합니다. 생존 가능한 세포는 낮은 195Pt 레벨을 가진 세포에 대한 게이팅에 의해 195 Pt 대 193Ir 플롯의 플롯에서 선택됩니다. 도 2A에 나타난 샘플은 이물질과 비생존 세포로 분류된 시스플라틴의 존재가 증가하였다. 이것은 견본이 질량 세포 측정을 위해 염색하기 전에 너무 오래 얼음 또는 RT에 너무 오래 방치된, 과잉 소화되었다는 것을 나타낼 수 있습니다. 조직 배양 세포로부터의 프로파일은 전형적으로 195Pt음성 세포의 더 높은 백분율을 준다(도2B). 대안적으로, 유도 세포 사멸이 실험 모델 및/또는 조건의 특징인 경우, 195Pt양성 세포의 존재가 예상될 수 있다.
이상적으로, 관심의 인구를 정의하는 마커는 특정 세포 모형의 분석에 포함되어야 합니다. 예를 들어, 조혈 KC 현탁액에 존재할 것으로 예상되는 면역 세포는 조혈 세포를 검출하는 CD4523 항체를 첨가하여 검출할 수 있다(도2C). 증식 항체패널(13)과관련하여, IdU 대 CYCLIN B1플로팅은 표준 BrdU/PI 플로우 플롯(그림 2D)과 유사한 세포 주기 상(그림2C)을해결하여 S상, G0/G1 및 G2/M 셀의 검출을 가능하게 합니다. 인구. IdU 대 pHH3 플롯에서 높은 pHH3 양성도는 M 상 세포를 식별합니다. 마지막으로, 높은 pRB 신호에 G0/G1 세포를 게이팅하면 G1의 세포와 G0(정지)을 구별할 수 있습니다(그림2C,대부분의 패널 왼쪽).
상이한 세포 주기 단계를 확인한 후, 상이한 세포 유형 또는 실험 조건에 대한 세포 주기 프로파일의 그래픽 표현을 구성할 수 있다. 예를 들어, 그림2에 도시된 KC 현탁액에서 CD45- 대 CD45+ 셀 모집단(그림3A)을비교할 때 뚜렷한 세포 주기 프로파일이 나타난다. 예상대로 CD45-군에서 발견되는 과형성 KCs는 G0에 있는 더 적은 세포및 S,G2 및 M 상 3에 있는 더 많은 세포가 있었다. 대조적으로, 동일한 견본에서 면역 세포는 G0와 G1에 있는 주목할 만한 인구가 있었습니다. 세포 주기 프로파일 이외에, 세포 주기 의존적 방식으로 유전자 발현의 특성화도 가능하다. 예를 들어, EGFR 및 mTOR/PI3K 시그널링을 정의하는 데 도움이 되는 인광 단백질은 도 3A에제시된 데이터에서 분석되었다. CD45- 대 CD45+ 세포의 G1 단계의 분석은 pS6 및 pEGFR 양성 세포의 백분율에 약간의 차이가 있는 것으로 나타났지만 EGFR 및 mTOR/PI3K 신호 단백질에 대한 유사한 프로파일을 밝혀냈다(그림3B). 유사한 접근법은 세포 주기의 상이한 단계에서 다른 신호 통로 단백질 또는 세포 과정의 발현을 특성화하기 위하여 적응될 수 있다.
그림 1 : 소화를 위한 마우스 귀 피부 준비. (A) 먼저, 동물에서 귀를 제거하고 깨끗한 페트리 접시에 평평하게 놓습니다. (B) 구부러진 정밀 인압을 사용하여 귀의 한쪽면을 가운데 또는 가장자리에서 잡습니다. (C) 뒤집어서 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 귀가 주름에 찢어질 때까지 귀의 절반을 부드럽게 당깁니다. (D) 측면이 두 개의 반으로 분리될 때까지 계속 당깁니다. (E) 해동 매체에 귀를 반으로 뜨고 진피 면이 용액에 닿습니다. 배율 표시줄 = 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 대량 세포분석 데이터를 위한 게이팅 전략. 이 도면의 데이터는 앞서 설명한바와같이 phorbol ester TPA로 처리된 실험 동물로부터 생성되었다 3. TPA는 피부염증을유발하는 PKC 활성제(24)이다. (A) 패널은 바코드 데이터의 정규화 및 디볼루션 후 초기 게이팅 전략을 보여줍니다. 이벤트 길이, 191Ir,193Ir 및 195Pt 채널을 게이팅함으로써, 손상되지 않은, 단일 및 생존 가능한 세포를 선택할 수 있다. (B) 인간 SCC SRB-P93 세포를 DMSO로 처리한 후 질량 세포측정을 위해 염색하였다. 데이터는 (A)에서와같이 게이트되었고 플롯은 이 샘플에서 라이브 셀의 수준을 나타낸다. (C) 계보 마커의 포함은 관심있는 세포 집단의 선택을 허용한다. 이 예에서, 생존가능한 세포(A)는 조혈 세포를 배제하기 위해 이벤트 길이 대 CD45에 대해 게이트화되었다. IDU 대 CYCLIN B1의 혼입을 위한 게이팅 CD45-셀은 S, G0/G1 및 G2/M 세포 집단의 식별을 허용한다. pHH3 높은 세포의 선택은 M 상을 정의하는 반면, pRB 양성에 대한 G0/G1의 분석은 G1의 세포를 식별합니다. (D) 플롯은 형광계 유동 세포측정을 통해 BrdU 혼입 및 PI(DNA 함량)의 검출에 의한 세포 주기 분석의 대표적인 결과를 나타낸다. 도시된 데이터는 앞서 설명한바와같이 BrdU와 함께 성장한 인간 Colo163 SCC 세포로부터 1시간 동안 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 세포 주기 프로파일의 특성화 및 상 특이적 단백질 발현. (a) 세포 주기 프로파일은 CD45-대 CD45+ 세포에 대한 도 2로부터의 샘플에서 결정되었다. (B) CD45-(주황색) 및 CD45+(파란색) 세포에서 인광 특이적 항체를 가진 G1 단계의 분석은 EGFR 및 mTOR/PI3K 신호 경로의 마커에 대한 유사한 발현 프로파일을 밝혀냈습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 조직 | 영역 | 셀 수율 | 생존 능력 |
| 마우스 귀 | 225-230 mm3 | 1-2x106 | 70-90% |
| 신생아 피부 | 1000-1100 mm3 | 5-10x106 | 80-99% |
표 1: 성인 마우스 귀및 신생아 피부에서 전형적인 세포 수율 및 생존율. 트립판 블루 배제에 의한 세포 수 및 생존력은 n=7 8-10주 령 성인 마우스 귀 또는 n=7 P3 신생아 스킨에서 수확한 귀 KC로부터 평균화되었다.
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Discussion
이 백서에 설명된 프로토콜은 약 8시간 안에 완료할 수 있습니다. 최종 결과는 세포 주기 의존적 방식으로 단백질 발현을 위해 분석될 수 있는 KC에서 농축된 세포의 현탁액이다. 몇몇 이전 연구 결과는 인간과 마우스 피부에서 PC를 격리하는 방법을 설명했습니다16,25. 이러한 연구는 또한 유세포분석26에 대한 CS의격리를 위한 프로토콜을 포함한다. 그러나, 상세한 프로토콜은 질량 세포 측정을 사용하여 단백질 발현 및 세포 주기 역학의 분석과 KC의 분리를 결합하는 이전에 기술되지 않았습니다.
이 프로토콜에서 고품질 결과를 얻는 가장 큰 장애물은 사용되는 라이브 셀의 품질입니다. 문헌에서, 표피/진피 분리에 대한 제안된 조건 및 효소는 크게 변화한다16,25,26,27. 그러나 피부 의 소화 시간을 진피로부터 표피를 효과적으로 분리 할 수있는 가능한 한 짧은 기간으로 유지하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 1 시간 안에 귀와 마우스 신생아 피부의 facile 분리를 허용하는 dispase 및 타입 IV 콜라게나아제와 소화를 제시합니다. 이것은 높은 세포 생존율을 가진 충분한 세포 수율 결과. 세포의 질에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 요인은 소화를 위해 선택된 피부의 위치입니다. 그것은 KC본문에 다른 해부학 위치에서 유사 하 게 행동 가정. 그러나, 상이한 부위의 피부는 상이한 성질과 줄기세포 조성물(28,29)을가질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 신생아 및 귀 피부(30)의 사용은 모낭의 밀도가 높은 피부 부위(예를 들어, 등 피부)로부터 KC의 분리가 더 어렵기 때문에 바람직하다. 마우스(26)의 털이 많은 부위로부터 KC를 효율적으로 분리하기 위해서는 더높은 수준의 조작 또는 조직 해리가 필요할 수 있다. KC의 격리 이전에 실험 조건은 또한 단리된 세포의 질에 영향을 미칠 수 있습니다. 피부 병변 또는 피부 무결성에 영향을 미치는 조건은 진피에서 표피의 분리를 감소시킬 수 있습니다. 이것은 실행 가능한 세포의 감소된 수율 귀착될 수 있었습니다 또는 비 KC 세포 (예를 들면, 면역 세포)의 증가한 오염. 마지막으로 격리된 CS는 응모에 취약합니다. 그(것)들은 또한 질량 세포 측정 또는 그밖 단 하나 세포 분석을 위해 가공하기 전에 얼음 또는 RT에 너무 오래 방치하는 경우에 세포 생존을 분실할 수 있습니다.
질량 세포 측정을 위한 염색 방법론은 형광 교류 세포측정을 위해 사용되지만 중요한 다름을 가진 것과 유사합니다. 예를 들어, DNA 복제의 검출은 BrdU와 같은 뉴클레오티드 유사체에 대한 항체의 사용 대신 IdU의 직접 검출에 의해 달성된다. IdU의 직접 검출은 BrdU의 항체 검출이 관련 절차일 수 있기 때문에 S상 세포의 식별을 크게 단순화한다. 또 다른 차이점은 죽은 세포와 살아있는 세포의 차별을 위해 시스플라틴을 사용하는 것입니다. 시스플라틴은 죽은 세포를 우선적으로 라벨을 붙입니다. 이 단계는 죽은/라이브 FACS 실험을 위한 PI 또는 기타 얼룩의 사용과 유사합니다. 시스플라틴 염색 단계는 죽은 세포가 항체를 결합하고 따라서 거짓 양성 신호를 생성할 수 있기 때문에 중요합니다. 질량 세포측정은 또한 DNA 내용을 측정하는 대신상 특정 마커의 표정을 검출하기 위하여 항체를 이용합니다. 이것은 개별적인 세포 주기 단계의 막다른 차별을 허용합니다. 마지막으로, 질량 세포 분석 데이터 (FCS) 파일은 동일한 실행 중 및 실행 사이에 CyTOF 계측기에서 시간이 지남에 따라 샘플 신호 열화로 인해 교정 비드의 스파이크를 사용하여 정규화해야합니다.
염색, 데이터 수집 및 질량 세포 분석에 대한 분석은 최근 간행물14,15에의해 잘 검토되었습니다. 조혈 및 면역 세포의 분석에이 기술의 응용 프로그램은 잘 문서화되어 있습니다. 이것은 상업적으로 이용 가능한 금속 tagged 항체의 큰 집합 및 이 기술을 사용하여 면역 관련 간행물의 우세에 의해 분명합니다. 피부에 있는 질량 세포측정의 즉각적인 응용은 면역 세포의 분석을 위한 것입니다. 이것은 염증이 중요한 역할이 있는 암 같이 질병에 있는 마우스 피부 모형을 위해 특히 관련이 있습니다. 비면역 세포 분석을 위해, 상업적으로 이용 가능한 금속 태그항체의 부족은 방해가 될 수 있다. 상용 시약의 장점은 금속 태그가 달린 항체의 경우와 마찬가지로 상당한 최적화 없이 사용할 수 있다는 것입니다. 그러나, 일반적으로 사용되는 형광 태그 (예를 들어, FITC, PE 및 APC)에 대한 금속 태그 항체가 있어 실험자가 염색 패널에 마커를 추가 할 수 있습니다. 이 해결 은 또한 종에 걸쳐 반응성을 보여주는 상업적인 금속 태그항체의 한정된 수가 있을 수 있는 다른 종에 있는 피부 세포의 분석에 적용될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 해결 방법은 또한 시스플라틴 염색 및 일부 최적화 후 추가 염색 단계가 필요합니다. 성공적인 패널을 구축하기위한 추가 고려 사항은 문헌14에서논의된다. 질량 세포측정의 또 다른 단점은 질량 세포계의 데이터 수집 효율이 입력 셀 수의 40-60%가 될 수 있다는 것입니다. 이와 같이, 대량 샘플에서 희귀 세포 집단 (예를 들어, 줄기 세포)의 분석은 대량 세포 측정을 위해 염색하기 전에 관심있는 세포 집단을 풍부하게하기 위해 더 많은 수의 세포, 효과적인 검출을위한 샘플 풀링 또는 기타 접근법을 요구할 수 있습니다. 24.
질량 세포측정은 그 사용이 계속 증가할 것입니다 강력한 신흥 기술입니다. 현재, 이 기술의 적용은 금속 태그가 달린 항체의 사용에 초점을 맞추고 있지만, 최근에는 mRNA31의검출을 위해 확장되었다. 더욱이, 금속 꼬리표를 가진 그밖 세포 분대 또는 대사 산물을 표지의 잠재력이 있습니다, 마우스, 인간 및 그밖 종에서 피부 그리고 그밖 조직에 있는 질량 세포 측정을 위한 신청의 범위를 확장할 것입니다. 요약하면, 이 프로토콜은 다양한 세포 주기 단계에서 KC 단백질 발현을 상관시키기 위해 피부 생물학자들이 사용할 수 있는 실험 도구를 확장할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품에 대한 지원은 피부과, 콜로라도 대학과 콜로라도 대학의 재생 의학을위한 게이츠 센터에서 왔다 (UC) 피부 질환 센터 형태학 및 표현형 코어 (NIAMS P30 AR057212). 저자는 UC 암 센터 유동 세포 측정 공유 자원 및 지원 보조금 (NCI P30 CA046934)을 인정질량 세포계의 작동에 대한 및 흐름과 질량 세포 측정에 대한 전문가의 조언에 대한 핵심 카렌 헬름과 크리스틴 어린이에 대한 감사 기술을.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM - Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
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