Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

अलगाव और मास साइटोमेट्री द्वारा सेलुलर प्रोटीन अभिव्यक्ति के सेल चक्र विशिष्ट विश्लेषण के लिए माउस त्वचा Keratincytes के दाग

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59353
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे माउस मॉडल से त्वचा keratinocytes को अलग करने के लिए, धातु टैग एंटीबॉडी के साथ दाग के लिए, और बड़े पैमाने पर cytometry द्वारा दाग कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न सेल चक्र चरणों में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न प्रोफ़ाइल.

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य माउस त्वचा के epidermis से अलग एकल कोशिकाओं का उपयोग कर एक सेल चक्र पर निर्भर तरीके से प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए है. वहाँ सात महत्वपूर्ण कदम हैं: dermis से बाह्य त्वचा की जुदाई, बाह्य त्वचा का पाचन, cisplatin के साथ epidermal सेल आबादी के धुंधला, नमूना barcoding, सेल चक्र मार्करों और प्रोटीन के लिए धातु टैग एंटीबॉडी के साथ धुंधला ब्याज, बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री द्वारा धातु टैग एंटीबॉडी का पता लगाने, और विभिन्न सेल चक्र चरणों में अभिव्यक्ति का विश्लेषण. हिस्टोलॉजिकल तरीकों पर इस दृष्टिकोण का लाभ सेल चक्र के विभिन्न चरणों में एक एकल सेल में की अभिव्यक्ति पैटर्न परख करने की क्षमता है। यह दृष्टिकोण प्रोटीन अभिव्यक्ति के बहुचर सहसंबंध विश्लेषण के लिए भी अनुमति देता है जो हिस्टोलॉजिकल/इमेजिंग विधियों की तुलना में अधिक परिमाणात्मक है। इस प्रोटोकॉल का नुकसान यह है कि एकल कोशिकाओं के निलंबन की जरूरत है, जो ऊतक वर्गों के धुंधला द्वारा प्रदान की स्थान जानकारी के नुकसान में परिणाम है. इस दृष्टिकोण को कच्चे सेल निलंबन में विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए अतिरिक्त मार्कर ों को शामिल करने की भी आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल के आवेदन hyperplastic त्वचा रोग मॉडल के विश्लेषण में स्पष्ट है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल वंश विशेष एंटीबॉडी के अलावा द्वारा कोशिकाओं के विशिष्ट उप-प्रकार के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, स्टेम सेल)। इस प्रोटोकॉल भी अन्य प्रयोगात्मक प्रजातियों में त्वचा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

कोशिका चक्र चरणों के साथ जीन अभिव्यक्ति का सहसंबंध कैंसर जैसे हाइपरप्लास्टिक रोगों के पशु मॉडलों के विश्लेषण में एक चुनौती बनी हुई है। इस चुनौती का एक हिस्सा प्रसार के मार्करों के साथ ब्याज (पीओआई) के प्रोटीन का सह-पता लगाना है। Proliferative कोशिकाओं G1, एस, G2, और एम Ki67 सहित विभिन्न सेल चक्र चरणों में पाया जा सकता है प्रसार के सबसे अधिक इस्तेमाल किया मार्करों में से एक है और सेल चक्र के सभी चरणों में व्यक्त किया है. इसका उपयोग मानव और माउस के ऊतकों1,2,3दोनों के विश्लेषण में व्यापक रूप से किया गया है . हालांकि, अन्य सामान्य प्रसार मार्करों की तरह, Ki67 व्यक्तिगत सेल चक्र चरणों विचार नहीं है. एक अधिक सटीक दृष्टिकोण सक्रिय रूप से अपने जीनोम (यानी, एस चरण)4,5नकल कर रहे हैं कि कोशिकाओं में Bromodeoxyuridine (BrdU) की तरह थाइमिडीन न्यूक्लिओटाइड एनालॉग के निगमन का उपयोग करता है। न्यूक्लिओटाइड एनालॉग के उपयोग के लिए एक दोष विश्लेषण से पहले जानवरों घंटे रहने के लिए उन्हें प्रशासन की जरूरत है. की67 और BrdU आमतौर पर एंटीबॉडी के उपयोग से निश्चित ऊतक वर्गों पर पाया जाता है. इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि POIs के स्थान ऊतक वास्तुकला के भीतर पता लगाया जा सकता है (उदा., त्वचा epidermis के बेसल परत). इस दृष्टिकोण भी ऊतक वियोजन है कि जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की आवश्यकता नहीं है. एक नुकसान यह है कि ऊतक निर्धारण या OCT जमे हुए या पैराफिन सेक्शनिंग के लिए ऊतक के प्रसंस्करण एंटीबॉडी लक्ष्य (यानी, प्रतिजनों) को समाप्त कर सकते हैं। प्रतिजनों की पुनः प्राप्ति के लिए आम तौर पर गर्मी या ऊतक पाचन की आवश्यकता होती है। दाग तीव्रता का परिमाण भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह धुंधला, अनुभाग मोटाई, संकेत का पता लगाने, और प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह में बदलाव के कारण है. इसके अलावा, मार्करों की एक सीमित संख्या में सबसे विशिष्ट प्रयोगशाला setups में एक साथ पता लगाया जा सकता है. फिर भी, नए मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण इन सीमाओं को दूर करने का वादा करता है; उदाहरण हैं इमेजिंग द्रव्यमान साइटोमेट्री और टायरामाइड संकेत प्रवर्धन6,7.

प्रवाह साइटोमेट्री बढ़ते कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक और शक्तिशाली तकनीक है। यह एक ही कोशिकाओं में मार्करों के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, लेकिन सबसे गैर hematopoietic सेल प्रकार के लिए ऊतक वियोजन की आवश्यकता है. प्रोलिफरेटिंग कोशिकाओं का विश्लेषण नियमित रूप से डीएनए को बांधने वाले रंगों के उपयोग द्वारा किया जाता है (उदा., प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई))8। प्रवाह कोशिकामिति भी कोशिका चक्र चरणों का एक अधिक सटीक निर्धारण की अनुमति देता है जब BrdU निगमन9का पता लगाने के साथ युग्मित . हालांकि एक शक्तिशाली दृष्टिकोण, BrdU/PI प्रवाह साइटोमेट्री अपने नुकसान है. यह चरण-विशिष्ट एंटीबॉडी को शामिल किए बिना जी2/एम और जी0/जी1 चरणों को हल करने में असमर्थ है। हालांकि, एंटीबॉडी की संख्या है कि इस्तेमाल किया जा सकता सेलुलर autofluorscence द्वारा सीमित है, फ्लोरोफोर उत्सर्जन के वर्णक्रमीय spillover, और मुआवजा नियंत्रण के उपयोग. यह सीमा POIs के साथ सेल चक्र मार्करों की अभिव्यक्ति का सह-पता लगाने के लिए इसे और अधिक चुनौतीपूर्ण और कठिन चिह्नित करती है। एक अधिक सुविधाजनक दृष्टिकोण द्रव्यमान साइटोमेट्री10,11का उपयोग करने के लिए है . इस तकनीक धातु संयुग्मी एंटीबॉडी है कि एक संकीर्ण पता लगाने स्पेक्ट्रम है का उपयोग करता है. एक बार कोशिकाओं धातु टैग एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं, वे वाष्पीकृत कर रहे हैं, और कोशिका मिति समय के उड़ान (CyTOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता चला धातुओं. इन गुणों के कारण, द्रव्यमान कोशिकामिति मौजूदा प्लेटफार्मों10,11का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स का पता लगाने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यह धातुओं है कि कीमती एंटीबॉडी की बचत में परिणाम के साथ नमूने बारकोड करने के लिए संभव है, जबकि नमूना करने के लिए नमूना धुंधला परिवर्तनशीलता को कम करने. दूसरी ओर, बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री कई नुकसान है. गैर रक्त व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धातु टैग एंटीबॉडी की एक सीमित संख्या में हैं. डीएनए सामग्री की मात्रा फ्लोरोसेंट डीएनए रंगों के उपयोग की तुलना में कम संवेदनशील है और बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री फ्लोरोसेंट प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में संकेत का पता लगाने की एक कम गतिशील रेंज है।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल माउस त्वचा से नव अलग keratincytes (KCs) से सेल चक्र गतिशीलता का विश्लेषण और इन कोशिकाओं में सेल चक्र विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति की विशेषता जन साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए डिजाइन किया गया था. इस प्रोटोकॉल का उपयोग सुसंस्कृत कोशिकाओं के साथ भी किया जा सकता है या अन्य सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

कोलोराडो Anschutz मेडिकल कैम्पस 'संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय इस प्रोटोकॉल में वर्णित पशु प्रयोगों को मंजूरी दे दी.

1. तैयारी

  1. एक धातु टैग एंटीबॉडी पैनल डिजाइन. मुफ्त ऑनलाइन पैनल डिजाइन सॉफ्टवेयर12 का उपयोग करें और 127IododeoxyUridine (IdU), 164डाई (Dysprosium) विरोधी CCNB1 लेबल (CYCLIN B1), 175लू (Luteium) फॉस्फो (पी)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), और 150 शामिल हैं एन डी (Neodymium)-PRETINOBLASTOMA प्रोटीनSer807/811 (pRB)13| अतिरिक्त धातु टैग एंटीबॉडी है कि उनके चैनल संकेत14में ओवरलैप नहीं जोड़ें.
  2. एक IdU शेयर समाधान तैयार करें. IU पाउडर को 10 मिलीग्राम/एमएल पर 0.1 N NaOH में 60 डिग्री सेल्सियस पर भंग करें। अलीकोट IU स्टॉक समाधान microcentrifuge ट्यूबों में और लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
    1. उपयोग करने से ठीक पहले 12 एन एच सीएल के साथ 7.5 के लिए ILut समाधान का pH समायोजित करें। समाधान पीएच 7.5 पर है यह सुनिश्चित करने के लिए एक discard alicot पर एक पीएच पट्टी के साथ परीक्षण करें।
      नोट: पीएच 7.5 पर IDo U के लंबे समय तक समय (gt; 5 मिनट) वर्षा में परिणाम होगा और IdU की एक ताजा aliquot की जरूरत है जब ऐसा होता है.
    2. उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (उदा., दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, और सुरक्षा चश्मा) का प्रयोग करें और एक सुरक्षा कैबिनेट में काम करते हैं जब NaOH या एचसीएल समाधान से निपटने.
  3. एक 2x पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) फिक्सिंग समाधान तैयार करें। 10x पीबीएस (पीएच 7.5) के 5 एमएल और शुद्ध आणविक ग्रेड डी एच2ओ (3.2% अंतिम एकाग्रता) के 44 एमएल के साथ 16% पीएफए के 1 एमएल का मिश्रण।
    नोट: पीएफए का एक स्टॉक पहले प्रकाशित15 के रूप में तैयार किया जा सकता है या 16% शेयरों contaminating धातुओं से मुक्त खरीद.
    1. पीएफए पाउडर और समाधान से निपटने के लिए उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और एक सुरक्षा कैबिनेट में काम का उपयोग करें।
  4. बेरियम (बा2 +) मुक्त 1x पीबीएस धातु मुक्त 10x पीबीएस (पीएच 7.5) शुद्ध आणविक ग्रेड डी एच2हे के 45 एमएल के साथ संयोजन के द्वारा मुक्त 1x पीबीएस तैयार करें।
    नोट: पीबीएस और अन्य अभिकर्मकों की गुणवत्ता बड़े पैमाने पर cytometric डेटा के विश्लेषण के दौरान पृष्ठभूमि शोर पेश कर सकते हैं कि धातुओं को दूषित से बचने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।
  5. एक 100 m cisplatin शेयर समाधान तैयार करें. DMSO के 10 एमएल में 300.5 मिलीग्राम सिस्प्लैटिन पाउडर घोलें। -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट्स में स्टोर करें। 1 घ से अधिक उपयोग किए जाने वाले प्रयोगों के लिए 10 m cisplatin कार्य समाधान तैयार करें।
  6. बाह्य त्वचा/डर्मिस पृथक्करण समाधान तैयार करें। HBSS या PBS के 1 एमएल में 30 मिलीग्राम भंग करके एक 20x dispase स्टॉक समाधान तैयार करें। फ़िल्टर एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से बाँझ और -20 डिग्री सेल्सियस पर alicuots में स्टोर। HBSS S में 1 mg/mL पर एक 1x प्रकार IV collagenase स्टॉक समाधान तैयार करें, 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से नसबंदी फिल्टर करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट्स की दुकान करें।

2. IdU निगमन द्वारा एस चरण की लेबलिंग

  1. चूहों का वजन। P1-P3 नवजात पिल्ले या 8-10 सप्ताह पुराने वयस्क चूहों का प्रयोग करें और एक C57BL/6, FvB, या 129 पृष्ठभूमि से पुरुष या महिला चूहों का उपयोग करें. 0.1 मिलीग्राम IdU (pH 7.5) /g शरीर के वजन पर एक खुराक निर्धारित करें। उदाहरण के लिए, 25 ग्राम माउस को 0.25 एमएल IdU की आवश्यकता होती है.
  2. एक इंट्रापर्टोनल इंजेक्शन द्वारा आईडीयू की खुराक को प्रशासित करें और कोशिकाओं की कटाई से पहले 2 एच के लिए प्रतीक्षा करें। नवजात पिल्ले को इंजेक्ट करने के लिए ट्यूबरकुलिन सिरिंज का उपयोग करें।
    नोट: IU के 2 मिलीग्राम/एमएल की एक खुराक का उपयोग ऊतक संस्कृति कोशिकाओं के साथ किया जा सकता है जिसमें द्रव्यमान साइटोमेट्री के लिए कटाई और लेबलिंग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच ऊष्मायन के साथ उपयोग किया जा सकता है।

3. लेबलिंग के लिए कोशिकाओं का अलगाव

  1. Thaw dispase और collagenase शेयर समाधान. बाँझ HBSS या PBS में 1x (1.5 mg/mL) के लिए 20x dispase स्टॉक समाधान को दूर करें। बर्फ पर रखें जब तक उपयोग करने के लिए तैयार है.
  2. एक कुल मात्रा है कि त्वचा स्वतंत्र रूप से तैरने के लिए अनुमति देता है में collagenase के 1 मात्रा के साथ dispase के 2 संस्करणों का मिश्रण. उदाहरण के लिए, 5 नवजात माउस की खाल के पाचन एक 100 मिमी पेट्री डिश में collagenase के 4 एमएल के साथ 1x dispase के 8 एमएल पर जारी किया जा सकता है।
  3. प्रयोगात्मक चूहों को इच्छामृत्यु देने के लिए अनुमोदित विधियों का पालन करें (उदा., isoflurane overdose/toe pinch चेक या CO2 इनहेलेशन/ एक आयोडीन समाधान के साथ वयस्क कान त्वचा को साफ करें (सामग्री की तालिकादेखें) और बाँझ पानी के साथ कुल्ला जब अलग कोशिकाओं को ऊतक संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं.
  4. आधार पर कान को शल्य चिकित्सा से निकाल दें (चित्र 1क) बाँझ पीबीएस में कान कुल्ला जब अलग कोशिकाओं ऊतक संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. एक सूखी 100 मिमी पेट्री पकवान पर रखें.
  5. शुरू में ठीक संदंश का उपयोग कर कटौती क्षेत्र के बीच या किनारे में एक जेब बनाने और दो त्वचा फ्लैप अलग खींच द्वारा पीछे की त्वचा से ध्यान से पूर्वकाल अलग ( चित्र 1B-D) . दोनों पूर्वकाल और पीछे की खाल के साथ आगे बढ़ें.
    नोट: नवजात माउस त्वचा को विभाजित करने के लिए विस्तृत निर्देश Litchi एट अल द्वारा प्रदान की जाती हैं16 इसके अलावा, एक विच्छेदन गुंजाइश का उपयोग पीछे की त्वचा से पूर्वकाल के जुदाई में सहायता कर सकते हैं और विच्छेदन के epidermis / त्वचा: बाल बाह्य त्वचा की ओर दिखाई देते हैं जबकि डर्मिस में एक जिलेटिनी उपस्थिति होगी।
  6. कान की पूर्ववर्ती और पश्च कक की खाल को त्वचा के डर्मिस साइड के साथ ध्यान से रखें जो डिस्पेस/कोलेजानेस समाधान को छूते हैं ( चित्र 1E)। एक 12 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के प्रति अच्छी तरह से एक कान के पूर्वकाल और पीछे दोनों त्वचा के लिए 1 एमएल का प्रयोग करें. 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, वैकल्पिक रूप से, 16-18 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x dispase समाधान पर खाल फ्लोट 3
    नोट: बाँझ तकनीक के साथ एक ऊतक संस्कृति हुड में काम करते हैं जब कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जा रहे हैं.
  7. एक साफ पेट्री डिश की सतह को छू बाह्य त्वचा की ओर के साथ पचा त्वचा प्लेस. त्वचा को समतल करें और धीरे से एक परिपत्र पैटर्न में केंद्र से किनारों के लिए काम करके बाह्य त्वचा से dermis स्लाइड.
  8. ऊतक संवर्धन या विश्लेषण16के लिए फाइब्रोब्लास्टकोशों को मुक्त करने के लिए डर्मिस को त्याग दें या इसे और पचाएं .
    नोट: dermis उपस्थिति में गहरा हो जाएगा और एक जिलेटिन और चिपचिपा संरचना है। डर्मिस को आसानी से आना चाहिए। डर्मिस को हटाने में विफलता या कठिनाई अपर्याप्त ऊतक पाचन का सुझाव देती है। हालांकि, पाचन बफर में विस्तारित ऊष्मायन सेल व्यवहार्यता को कम करेगा। बाह्य त्वचा पेट्री डिश पर रहेगा और एक विरंजन उपस्थिति होगा.
  9. किनारों पर पकड़ कर बाह्य त्वचा को धीरे से हटा दें और पेट्री डिश की सतह से छील लें। पूर्व-वार्म्ड सेल टुकड़ी समाधान पर बाह्य त्वचा को सावधानी से रखें (सामग्री की तालिकादेखें ) आरटी पर 37 डिग्री सेल्सियस या 20 मिनट पर 5 मिनट के लिए। 2 वयस्क कान के लिए सेल टुकड़ी समाधान के 500 $L का उपयोग करें 12 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के प्रति अच्छी तरह से बाह्य त्वचा का उपयोग करें और सेल टुकड़ी के 750 $L का उपयोग करें एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के अच्छी तरह से प्रति एक नवजात बाह्य त्वचा के लिए समाधान.
  10. बाँझ संदंश का उपयोग कर के बाह्य त्वचा grasp और कोशिकाओं को अलग करने के लिए पकवान के नीचे के खिलाफ epidermis खींचकर स्क्रब. 1% FBS (0.01 एमएल) युक्त DMEM के 1 एमएल जोड़ें और एक संग्रह ट्यूब में एक 40 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से गुजरती हैं। DMEM के एक अतिरिक्त 2 एमएल के साथ अच्छी तरह से कुल्ला और सेल निलंबन में जोड़ें.
  11. 120 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज सुपरनेंट सावधानी से करें।
  12. DMEM के 1-2 एमएल में सेल गोली को पुन: निलंबित करें जिसमें 1% एफ.बी.एस. Trypan ब्लू और एक हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित गिनती डिवाइस का उपयोग कर सेल और % लाइव सेल गिनती निर्धारित करें। चरण 3.11 में वर्णित के रूप में गोली कोशिकाओं.
    नोट: कोशिकाओं चरण 3.12 के बाद उचित ऊतक संस्कृति मीडिया में सुसंस्कृत किया जा सकता है. 17

4. लाइव/डेड कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए Cisplatin लेबलिंग

  1. DMEM के प्रति 1 एमएल 1-3 x 106 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें जिसमें 25 डिग्री सेल्सियस सिसप्टिन (स्टॉक/एमएल का 2.5 डिग्री सेल्सियस) होता है। 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट और FBS के एक बराबर मात्रा के साथ pipeting द्वारा बुझाने (उदाहरण के लिए, 1 एमएल).
  2. एक कागज तौलिया पर शेष समाधान नाली के लिए पतला ब्लीच और उलटा ट्यूबयुक्त एक बीकर में 120 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। ट्यूब की गोली और साइडवॉल पर शेष समाधान को मुक्त करने के लिए धीरे से टैप करें।
  3. बा+2मुक्त पीबीएस के 2 एमएल में सेल गोली resuspend. चरण 4.2 में वर्णित के रूप में गोली कोशिकाओं.
    नोट: यह कोशिकाओं को ठीक करने के लिए सिफारिश की है, तो वे तुरंत दाग नहीं किया जा सकता है।

5. cisplatin लेबल कोशिकाओं का निर्धारण (वैकल्पिक)

  1. 1-3 x 106 cisplatin लेबल कोशिकाओं को 1 एमएल बा+2-मुक्त पीबीएस में पुन: निलंबित करें। सतत कम शक्ति के तहत भंवर कोशिकाओं और 2x पीएफए निर्धारण बफर के dropwise 1 एमएल (1 मात्रा) जोड़ें। एक कमाल मंच पर 10 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
  2. कदम 4.2 में वर्णित के रूप में गोली कोशिकाओं, लेकिन 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रण.
  3. चरण 5.2 में वर्णित के रूप में बा+2मुक्त पीबीएस और गोली कोशिकाओं के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो। चरण 5.3 को एक बार दोहराएँ.
  4. बा +2 मुक्त पीबीएसके 2 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए और lt;3 d. FBS को 3% में जोड़ें (उदाहरण के लिए, FBS/mL की 0.3 एमएल) कुल मात्रा का यदि लंबे समय तक भंडारण करता है और 3 d, तो मिश्रण और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
    नोट: फिक्सेशन कुछ epitopes का पता लगाना प्रभावित हो सकता है. एंटीबॉडी संकेत पर निर्धारण के प्रभाव अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है।

6. नमूनों की Barcoding (वैकल्पिक लेकिन सिफारिश की)

  1. चरण 5-2 में वर्णित गोली कोशिकाओं और फिर 1x फिक्सेशन बफर के 1 एमएल में 1-3 x 106 कोशिकाओं को पुन: असाइन करें (सामग्री की तालिकादेखें )। चरण 5.2 में वर्णित 10 मिनट गोली कोशिकाओं के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें।
  2. बारकोड permebilization बफर के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं (सामग्री की तालिकादेखें )। चरण 5.2 में वर्णित के रूप में गोली कोशिकाओं. चरण 6.2 को एक बार दोहराएँ.
  3. बारकोड के लिए बारकोड permebilization बफर के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)18 और तुरंत मिश्रण जबकि चरण 6.2 से कोशिकाओं छर्रे हैं.
  4. बारकोड permebilization बफर के 800 $L में सेल गोली को पुन: निलंबित. 30 मिनट के लिए आरटी में कोशिकाओं को बारकोड समाधान जोड़ें, मिश्रण और इनक्यूबेट करें। चरण 5.2 में वर्णित गोली कोशिकाओं। सेल धुंधला बफर के 2 एमएल में कोशिकाओं को धोएं (सामग्री की तालिकादेखें ) और गोली फिर से.
    नोट: अप करने के लिए 20 नमूने पैलेडियम धातुओं के विभिन्न संयोजनों के साथ लेबल किया जा सकताहै 18. अन्य barcoding रणनीतियों कहीं और15वर्णित हैं .

7. द्रव्यमान साइटोमेट्री के लिए कोशिकाओं की लेबलिंग

  1. परमाणु एंटीजन स्थायिक बफर कार्य समाधान के 1 एमएल में 1-3 x 106 कोशिकाओं को पुन: स्फूर्ति दें (सामग्री की तालिकादेखें)। बारकोड किए गए नमूनों का उपयोग करते समय बाद के चरणों के लिए एक एकल ट्यूब में नमूनों का मिश्रण। 30 मिनट गोली के लिए आरटी में इनक्यूबेट के रूप में चरण 5.2 में वर्णित है।
  2. परमाणु एंटीजन स्टेनिंग permebilization बफर के 2 एमएल में 1-3 x 106 कोशिकाओं को पुन: निलंबित (सामग्री की तालिकादेखें)। आवश्यक के रूप में स्केल करें। उदाहरण के लिए, 9 x 106 कक्षों की कक्ष संख्या के साथ 10 संयुक्त नमूनों के लिए 6 एमएल बफ़र का उपयोग करें. गोली के रूप में चरण 5.2 में वर्णित है.
  3. चरण 7.2 दोहराएँ. ट्यूब में छोड़दिया अवशिष्ट मात्रा में कोशिका गोली धीरे भंवर.
  4. 1-3 x 106 कोशिकाओं के अनुसार इंट्रासेल्यूलर एंटीबॉडी कॉकटेल का 50 $L जोड़ें। आवश्यक के रूप में स्केल करें। उदाहरण के लिए, 9 x 106 कोशिकाओं की कोशिका संख्या के साथ 10 संयुक्त नमूनों के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल के 150 $L का उपयोग करें. 45 मिनट के लिए आरटी में मिक्स और इनक्यूबेट जोड़ें 2 एमएल सेल दाग बफर और गोली के रूप में चरण 5.2 में वर्णित है।
  5. सेल धुंधला बफर के 2 एमएल में 1-3 x 106 कोशिकाओं गोली resuspend. चरण 5.2 में वर्णित के रूप में गोली कोशिकाओं. चरण 7.5 दोहराएँ एक बार.
    नोट: अन्य बफर समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है धुंधला extracellular झिल्ली या साइटोप्लाज्मिक मार्करों और प्रयोगकर्ता के लिए दाग का अनुकूलन अगर वहाँ एक अलग सेलुलर स्थानों में epitopes का पता लगाने की जरूरत है हो सकता है. दाग के लिए लाइव सेल का उपयोग करते समय सेल को चरण 7.5 के बाद पीएफए में भी ठीक किया जा सकता है।
  6. 1-3 x 106 कोशिकाओं को 1 एमएल इंटरकैलेशन विलयन में पुन: निलंबित करें तथा 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 घ के लिए संग्रह करें।
    1. DMSO में -80 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को स्टोर करें जिसमें समाधान के लिए $gt;3 d. गोली कोशिकाओं को चरण 5.2 में वर्णित किया गया है यदि कक्ष अंतर्कल्वन समाधान में हैं. चरण 5.2 में वर्णित के रूप में सेल धुंधला बफर और गोली कोशिकाओं के 1 एमएल में गोली (1-3 x 106 कोशिकाओं) को पुन: असाइन करें। 10% DMSO/90% FBS19के 1 एमएल में गोली को पुन: निलंबित करें, एक क्रायोविएल को स्थानांतरित करें, आइसोप्रोपेनोल-फ्रीजिंग कंटेनर में रखें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. चरण 5.2 में वर्णित के रूप में गोली कोशिकाओं. सेल दाग बफर के 2 एमएल के साथ 1-3 x 106 कोशिकाओं को धो लें, चरण 5.2 में वर्णित के रूप में छर्रों। 2 एमएल पानी के साथ दो अतिरिक्त washes प्रदर्शन, चरण 5.2 में वर्णित के रूप में छर्ली.
  8. पानी में EQ अंशांकन मोती 1:9 (स्टॉक समाधान पर 3.3 x 105 मोती /
  9. पतला EQ मनका समाधान के साथ 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता पर सेल गोली को पुन: निलंबित करें। 35 m छलनी टोपी प्रवाह ट्यूबों के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।
  10. द्रव्यमान साइटोमीटर पर नमूने चलाएँ और डेटा प्राप्त करें. डेटा एक फ्लो साइटोमेट्री मानक (एफसीएस) फ़ाइल स्वरूप में जमा किया जाएगा।

8. बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री डेटा फ़ाइलों का प्रसंस्करण और विश्लेषण

  1. FCS फ़ाइलें सामान्य. 20 https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest पर उपलब्ध एक नि: शुल्क कार्यक्रम का उपयोग करें
  2. Deconvolute बारकोड FCS फ़ाइलें. 18 https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest उपलब्ध एक नि: शुल्क कार्यक्रम के साथ अलग बारकोड फ़ाइलों में जमा बारकोड आबादी अलग अलग बाहर अलग
  3. सामान्यीकृत FCS फ़ाइलों का विश्लेषण करें. वाणिज्यिक21,22 या फ्रीवेयर कार्यक्रमों का उपयोग करें (web.stanford.edu/group/nolan/resources.html देखें).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

तालिका 1 वयस्क माउस कान से अपेक्षित कोशिका पैदावार और व्यवहार्यता को दर्शाता है (चित्र 1) और गैर-रोगस्थितियों के तहत नवजात त्वचा। तालिका भी एक मिश्रित C57/126 पृष्ठभूमि से जानवरों के प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है. यह उम्मीद है कि अन्य उपभेदों की त्वचा इसी तरह की सेल पैदावार और viabilities में परिणाम होगा. अनुमानित उपज त्वचा के सतह क्षेत्र पर निर्भर है और इंगित करता है कि नवजात त्वचा प्रयोगों के लिए एक बेहतर विकल्प है कि कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता होगी (तालिका 1) . कम पैदावार या कम व्यवहार्यता (lt;50%) पाचन या प्रयोगात्मक स्थितियों है कि त्वचा की अखंडता को कम करने या सेल मौत के प्रेरित के साथ मुद्दों का संकेत होगा. उचित मीडिया और पूरक के साथ कोशिकाओं को एकत्रित करने से केसी की तैयारी की गुणवत्ता का आकलन करने में मदद मिल सकतीहै 17.

एफसीएस फाइलों के सामान्यीकरण20 और deconvulation18 के बाद, डेटा की गति, ब्याज की epidermal सेल आबादी को परिभाषित करेगा और अलग-अलग सेल चक्र चरणों को चिह्नित करें (चित्र 2)। द्विचर भूखंडों में 191Ir बनाम 193Ir चैनलों की तुलना में, बरकरार कोशिकाओं ऊपरी सही वृत्त का चतुर्थ भाग में gated किया जा सकता है (चित्र 2A). प्लॉटिंग घटना लंबाई बनाम 191Ir और 191Ir अक्ष के पास कोशिकाओं की एक तंग क्लस्टर के लिए चयन एकल कोशिकाओं demarks. व्यवहार्य कोशिकाओं को कम 195पीटी स्तर के साथ कोशिकाओं के लिए gating द्वारा 195पीटी बनाम 193Ir साजिश के एक भूखंड में चयन कर रहे हैं. चित्र 2A में दिखाए गए नमूने में मलबे है और गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं को लेबल किए गए सिसप्टिन की उपस्थिति में वृद्धि हुई है। यह संकेत हो सकता है कि नमूना अधिक पचा गया था, कठोरता से संभाला, या बहुत लंबे समय के लिए बर्फ या आरटी पर छोड़ दिया बड़े पैमाने पर cytometry के लिए धुंधला करने से पहले. ऊतक-संस्कृत कोशिकाओं से प्रोफाइल आमतौर पर 195Pt नकारात्मक कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत दे (चित्र 2B). वैकल्पिक रूप से, 195पीटी सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति की उम्मीद की जा सकती है अगर प्रेरण सेल मौत प्रयोगात्मक मॉडल और /

आदर्श रूप में, मार्कर है कि ब्याज की आबादी को परिभाषित विशिष्ट सेल प्रकार के विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि कच्चे केसी निलंबन में मौजूद होने की उम्मीद कर रहे हैं एक CD4523 एंटीबॉडी के अलावा द्वारा पता लगाया जा सकता है, जो hematopoietic कोशिकाओं का पता लगाता है (चित्र 2C). प्रसार एंटीबॉडी पैनल13के संबंध में , साजिश रचने IDU बनाम CYCLIN B1 सेल चक्र चरणों को हल करता है (चित्र 2C) मानक BrdU/PI प्रवाह साजिश के समान (चित्र 2 डी), एस चरण का पता लगाने के लिए अनुमति , G0/ आबादी. IdU बनाम pHH3 भूखंडों में, उच्च pHH3 सकारात्मकता एम चरण कोशिकाओं की पहचान करता है. अंत में, उच्च pRB संकेत पर G0/G1 कोशिकाओं gating G0 में कोशिकाओं से G0 भेद कर सकते हैं (चित्र2C, सबसे पैनल छोड़ दिया).

विभिन्न सेल चक्र चरणों की पहचान करने के बाद, यह तो विभिन्न सेल प्रकार या प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए सेल चक्र प्रोफाइल की एक चित्रमय प्रतिनिधित्व का निर्माण करने के लिए संभव है. उदाहरण के लिए, चित्र 2में दर्शाए गए केसी निलंबन में CD45- बनाम CD45+ कक्ष जनसंख्या (चित्र 3क) की तुलना करते समय भिन्न कोशिका चक्र प्रोफ़ाइल उभर कर सामने आती हैं। सीडी 45 समूह में पाए जाने वाले हाइपरप्लास्टिक केसीसी में एस, जी 2 और एम चरण3में जी0 में कम कोशिकाएं थीं। इसके विपरीत, एक ही नमूने से प्रतिरक्षा कोशिकाओं G0 और G1 में उल्लेखनीय आबादी थी. सेल चक्र प्रोफाइल के अलावा, एक सेल चक्र पर निर्भर तरीके में जीन अभिव्यक्ति की विशेषता भी संभव है. उदाहरण के लिए, चित्र 3कके लिए प्रस्तुत आंकड़ों में ईजीएफआर और एम टी ओ आर/पीआई3के सिगनल को परिभाषित करने में मदद करने वाले फॉस्फो प्रोटीनका विश्लेषण किया गया। CD45- बनाम CD45 + कोशिकाओं के G1 चरणों के विश्लेषण EGFR और mTOR/PI3K संकेत प्रोटीन के लिए एक समान प्रोफ़ाइल से पता चला, हालांकि वहाँ pS6 और pEGFR सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत में मामूली अंतर दिखाई दिया (चित्र 3B). इसी तरह के दृष्टिकोण सेल चक्र के विभिन्न चरणों में अन्य संकेतन मार्ग प्रोटीन या सेलुलर प्रक्रियाओं की अभिव्यक्ति की विशेषता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1 : पाचन के लिए माउस कान त्वचा की तैयारी. (ए) सबसे पहले, जानवर से कान हटा दें और एक साफ पेट्री डिश पर फ्लैट रखना। (बी) घुमावदार परिशुद्धता संदंश का उपयोग करके मध्य या किनारे पर कान के एक तरफ की grasp. (ग) पलटें और एक अन्य जोड़ी बलप्स का उपयोग करके धीरे से कान के आधे भाग को तब तक खींच लें जब तक कि क्रीज पर कान के आँसू न आ जाए। (घ) जब तक पक्ष दो भागों में अलग न हो जाए, तब तक खींचते रहें। (ई) वियोजन मीडिया पर कान के हिस्सों को फ्लोट करें, जिसमें डर्मिस पक्ष समाधान को छूता है। स्केल बार - 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री डेटा के लिए गैटिंग रणनीति. इस चित्र का आंकड़ा एक प्रयोगात्मक जानवर से उत्पन्न हुआ था जिसे फोरबोल एस्टर टीपीए के साथ पहले वर्णित3के रूप में माना जाता था . TPA एक PKC उत्प्रेरक है कि त्वचा की सूजन24लाती है. (ए) पैनल बारकोड किए गए डेटा के सामान्यीकरण और deconvolution के बाद प्रारंभिक gating रणनीति दिखाते हैं। घटना की लंबाई, 191Ir,193Ir, और 195पीटी चैनलों पर gating द्वारा, यह बरकरार, एकल, और व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए संभव है. (ख) मानव एससीसी एसआरबी-P93 कोशिकाओं DMSO के साथ इलाज किया और फिर बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री के लिए दाग थे. डेटा के रूप में gated था (ए) और साजिश इस नमूने में जीवित कोशिकाओं के स्तर से पता चलता है. (ग) वंश मार्करों को शामिल करने से ब्याज की कोशिका जनसंख्या के चयन की अनुमति होती है। इस उदाहरण के लिए,हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं को बाहर करने के लिए इवेंट लेंथ बनाम CD45 पर व्यवहार्य कोशिकाओं को गेट किया गया था। आईडीयू बनाम CYCLIN B1 को शामिल करने के लिए CD45- कोशिकाओं को गैट िंग एस, जी0/जी1, और जी 2/एम सेल आबादी की पहचान की अनुमति देता है। pHH3 उच्च कोशिकाओं का चयन एम चरण को परिभाषित करता है, जबकि pRB सकारात्मकता के लिए G0/G1 का विश्लेषण G1 में कोशिकाओं की पहचान करता है. (घ) यह आलेख प्रतिश्रय आधारित प्रवाह साइटोमेट्री के साथ बीआरडीयू निगमन और पीआई (डीएनए सामग्री) का पता लगाने के द्वारा सेल चक्र विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है। दिखाया गया डेटा मानव Colo163 SCC कोशिकाओं से 1 एच के लिए BrdU के साथ हो के रूप में पहले3वर्णित है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : सेल चक्र प्रोफाइल और चरण विशेष प्रोटीन अभिव्यक्ति की विशेषता. (ए) सेल चक्र प्रोफाइल सीडी45- बनाम CD45 + कोशिकाओं के लिए चित्र 2 से नमूने में निर्धारित किए गए थे। (बी) सीडी45 में फॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ जी 1 चरणों के विश्लेषण- (नारंगी) और सीडी45+(ब्लू) कोशिकाओं ने ईजीएफआर और MTOR/PI3K संकेतन पथों के मार्करों के लिए इसी प्रकार की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का खुलासा किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ऊतक क्षेत्र सेल उपज व्यवहार्यता
माउस कान 225-230 मिमी3 1-2x106 70-90%
नवजात त्वचा 1000-1100 मिमी3 5-10x106 80-99%

तालिका 1: ठेठ सेल पैदावार और वयस्क माउस कान और नवजात त्वचा से व्यवहार्यता. सेल मायने रखता है और Trypan नीले बहिष्करण द्वारा व्यवहार्यता कान KCs n से काटा औसत थे 7 8-10 सप्ताह पुराने वयस्क माउस कान या n $7 P3 नवजात खाल.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस पेपर में उल्लिखित प्रोटोकॉल लगभग 8 ज में पूरा किया जा सकता है। अंतिम परिणाम KCs में समृद्ध कोशिकाओं का निलंबन है कि एक सेल चक्र पर निर्भर तरीके से प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. पिछले कई अध्ययनों में केसी को मानवऔर माउस की त्वचा से अलग करने के तरीकों की रूपरेखा तैयारकीगई है. इन अध्ययनों में प्रवाह साइटोमेट्री26के लिए केसी के पृथक्रूपन के लिए प्रोटोकॉल भी शामिल हैं . हालांकि, एक विस्तृत प्रोटोकॉल पहले वर्णित नहीं किया गया है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति और सेल चक्र गतिशीलता के विश्लेषण के साथ KCs के अलगाव को जोड़ती है बड़े पैमाने पर cytometry का उपयोग कर.

इस प्रोटोकॉल में उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम प्राप्त करने के लिए सबसे बड़ी बाधा इस्तेमाल किया लाइव कोशिकाओं की गुणवत्ता है. साहित्य में एपिडर्मस/डर्मिस पृथक्करण के लिए सुझाए गए शर्तों और एंजाइमों में बहुत भिन्न होता है16,25,26,27. हालांकि, इस प्रकार त्वचा के पाचन के समय को कम से कम संभव अवधि तक रखने की सिफारिश की जाती है जो डर्मिस से बाह्य त्वचा के प्रभावी पृथक्करण की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल dispase और प्रकार चतुर्थ collagenase के साथ पाचन प्रस्तुत करता है कि दोनों कान और माउस नवजात त्वचा के 1 एच के भीतर सुगम जुदाई की अनुमति देता है. यह उच्च सेल व्यवहार्यता के साथ पर्याप्त सेल पैदावार में परिणाम है. एक और पहलू है कि कोशिकाओं की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं पाचन के लिए चयनित त्वचा का स्थान है. यह माना जाता है कि केसीएस शरीर में विभिन्न शारीरिक स्थानों से इसी तरह व्यवहार करते हैं। तथापि, विभिन्न स्थलों पर त्वचा के विभिन्न गुण और स्टेम सेल संरचना28,29हो सकती है। फिर भी, नवजात और कानकी त्वचा 3,30 का उपयोग पसंद किया जाता है क्योंकि KCs के अलगाव बाल follicles के एक उच्च घनत्व के साथ त्वचा के क्षेत्रों से अधिक कठिन है (जैसे, वापस त्वचा). माउस26के बालों वाले क्षेत्रों से केसी के कुशल अलगाव के लिए अधिक मात्रा में हेरफेर या ऊतक वियोजन की आवश्यकता हो सकती है . केसी के अलगाव से पहले की प्रयोगात्मक स्थितियां अलग-थलग कोशिकाओं की गुणवत्ता को भी प्रभावित कर सकती हैं। त्वचा के घावों या शर्तों है कि त्वचा बाधा या त्वचा अखंडता को प्रभावित dermis से बाह्य त्वचा की जुदाई को कम कर सकते हैं. यह व्यवहार्य कोशिकाओं की कम पैदावार या गैर-केसी कोशिकाओं (उदा., प्रतिरक्षा कोशिकाओं) के बढ़ते संदूषण में परिणाम हो सकता है। अंत में, अलग KCs clumping के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. वे भी सेल व्यवहार्यता खो अगर बर्फ पर या आरटी पर बड़े पैमाने पर cytometry या अन्य एकल सेल विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण से पहले बहुत लंबा छोड़ दिया कर सकते हैं.

द्रव्यमान साइटोमेट्री के लिए धुंधला पद्धति फ्लोरोसेंट प्रवाह साइटोमेट्री के लिए उपयोग किए जाने वाले समान है लेकिन प्रमुख अंतरों के साथ। उदाहरण के लिए, डीएनए प्रतिकृति का पता लगाने के बजाय IdU के प्रत्यक्ष पता लगाने के बजाय BrdU जैसे न्यूक्लिओटाइड एनालॉग के खिलाफ एंटीबॉडी के उपयोग से पूरा किया है. IdU का प्रत्यक्ष पता लगाने बहुत एस चरण कोशिकाओं की पहचान सरल, BrdU के एंटीबॉडी का पता लगाने के रूप में एक शामिल प्रक्रिया हो सकती है. एक और अंतर मृत और जीवित कोशिकाओं के भेदभाव के लिए cisplatin का उपयोग है. Cisplatin अधिमानी मृत कोशिकाओं लेबल. यह चरण मृत/लाइव FACS प्रयोगों के लिए पीआई या अन्य दाग के उपयोग के समान है। सिस्प्लैटिन धुंधला कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि मृत कोशिकाएं एंटीबॉडी को बांध सकती हैं और इस तरह झूठी सकारात्मक संकेत उत्पन्न कर सकती हैं। डीएनए सामग्री को मापने के स्थान पर चरण-विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए मास साइटोमेट्री भी एंटीबॉडी का उपयोग करता है। यह अलग-अलग सेल चक्र चरणों के सुगम भेदभाव के लिए अनुमति देता है. अंत में, बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री डेटा (एफसीएस) फ़ाइलों को एक ही रन के दौरान और रन के बीच CyTOF साधन में समय के साथ नमूना संकेत गिरावट के कारण अंशांकन मोती में कील का उपयोग कर सामान्यीकृत करने की आवश्यकता है।

हाल ही के प्रकाशनों द्वारा 14,15केआधार पर विश्लेषण, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण की समीक्षा की गई है। hematopoietic और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए इस तकनीक के आवेदन अच्छी तरह से प्रलेखित है. यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धातु टैग एंटीबॉडी और इस तकनीक का उपयोग कर प्रतिरक्षा से संबंधित प्रकाशनों की प्रधानता का एक बड़ा संग्रह से स्पष्ट है. त्वचा में बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री का तत्काल आवेदन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए होगा। यह कैंसर जैसे रोगों में माउस त्वचा मॉडल के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है जहां सूजन एक महत्वपूर्ण भूमिका है. गैर प्रतिरक्षा सेल विश्लेषण के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धातु टैग एंटीबॉडी की कमी एक बाधा हो सकती है। वाणिज्यिक अभिकर्मकों का लाभ यह है कि वे काफी अनुकूलन के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में घर धातु टैग एंटीबॉडी में के लिए मामला होगा. हालांकि, आमतौर पर इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट टैग के खिलाफ धातु टैग एंटीबॉडी हैं (उदा., FITC, पीई, और APC) कि एक प्रयोगकर्ता उनके धुंधला पैनल के लिए अतिरिक्त मार्करों जोड़ने के लिए अनुमति देगा. इस समाधान भी विभिन्न प्रजातियों में त्वचा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है, जहां वाणिज्यिक धातु टैग एंटीबॉडी की एक सीमित संख्या है कि प्रजातियों में प्रतिक्रिया दिखाने हो सकता है. फिर भी, इस वैकल्पिक हल भी cisplatin धुंधला और कुछ अनुकूलन के बाद एक अतिरिक्त धुंधला कदम की आवश्यकता है. साहित्य14में एक सफल पैनल के निर्माण के लिए एक अतिरिक्त विचार पर चर्चा की गई है . द्रव्यमान साइटोमेट्री का एक अन्य नुकसान यह है कि द्रव्यमान साइटोमीटर की डेटा संग्रह दक्षता इनपुट सेल संख्या का 40-60% हो सकती है। इस प्रकार, दुर्लभ सेल आबादी के विश्लेषण (उदाहरण के लिए, स्टेम सेल) थोक नमूनों से कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता हो सकती है, प्रभावी पता लगाने के लिए नमूनों के पूलिंग, या अन्य दृष्टिकोण के लिए बड़े पैमाने पर cytometry के लिए धुंधला करने से पहले ब्याज की सेल आबादी को समृद्ध करने के लिए 24.

मास साइटोमेट्री एक शक्तिशाली उभरती हुई प्रौद्योगिकी है जिसका उपयोग बढ़ता रहेगा। वर्तमान में, इस तकनीक के आवेदन धातु टैग एंटीबॉडी के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन यह हाल ही में MRNA31का पता लगाने के लिए बढ़ाया गया था. इसके अलावा, वहाँ अन्य सेलुलर घटकों या धातु टैग के साथ चयापचयों लेबलिंग की क्षमता है, जो चूहों, मानव, और अन्य प्रजातियों से त्वचा और अन्य ऊतकों में बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री के लिए आवेदन की सीमा का विस्तार होगा. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल तो विभिन्न सेल चक्र चरणों में KC प्रोटीन अभिव्यक्ति सहसंबंधित करने के लिए त्वचा जीवविज्ञानियों के लिए उपलब्ध प्रयोगात्मक उपकरण का विस्तार कर सकते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के लिए समर्थन त्वचा विज्ञान विभाग से आया, कोलोराडो विश्वविद्यालय में पुनर्योजी चिकित्सा के लिए गेट्स केंद्र और कोलोराडो विश्वविद्यालय (यूसी) त्वचा रोग केंद्र Morphology और Phenotyping कोर (NIAMS P30 AR057212). लेखकों यूसी कैंसर केंद्र प्रवाह Cytometry साझा संसाधन और समर्थन अनुदान स्वीकार करते हैं (NCI P30 CA046934) बड़े पैमाने पर cytometer के संचालन के लिए और करेन हेल्म और क्रिस्टीन बच्चों के लिए आभारी हैं प्रवाह और बड़े पैमाने पर cytometric पर अपने विशेषज्ञ सलाह के लिए कोर में तकनीक.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Cell Treat 229512
Intercalator solution Fluidigm 201192A 125 µM - Ir intercalator solution
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4 16 %  PFA
Strainer cap flow tubes Fisher/Corning 352235 35 µm pore size 
Cell sieve Fisher 22363547 40 μm pore size 
Cell detatchment solution CELLnTEC CnT-ACCUTASE-100 Accutase
Iodine Solution ThermoFisher/Purdue 67618-151-17 Betadine 7.5%-iodine surgical scrub
Barcode permeabilization buffer  Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Barcodes Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH strips EMD 9590 colorpHast
DMEM Hyclone SH30022.01 Dulbecco’s Modified Eagle Media
Fine forceps Dumont & Fils 0109-5-PO Dumostar #5
Curved precision forceps Dumont & Fils 0109-7-PO Dumostar #7
Calibration Beads Fluidigm 201078 EQ Four Element Calibration Beads
HBSS Gibco 14175-095 Hank's Balanced Salt Solution
Water Fisher SH30538.03 Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine  Sigma I7125 IdU
Cryo vials ThermoFisher 366656PK internal thread
Cell Staining buffer Fluidigm 201068 Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Perm buffer Fluidigm 201067 Maxpar Fix & Perm buffer
Fix I buffer Fluidigm 201065 Maxpar Fix I buffer
Phosphate buffered saline Rockland MB-008 Metal free 10x PBS
isopropanol-freezing container ThermoFisher 5100-0001 Mr.Frosty
Sodium hydroxide Fisher BP359-500 NaOH
Petri dish Kord-Valmark 2900 Supplied by Genesee 32-107 
15 mL conical Olympus/Genesee 28-101
50 mL conical Olympus/Genesee 28-106
6-well plate Cell Treat 229506
Cisplatin Sigma 479306
Dispase II Sigma/Roche 4942078001
DMSO Sigma D2650
FBS Atlanta Biologicals S11150
Hydrochloric acid Fisher A144-212
Nuclear Antigen Staining  permeabilization buffer Fluidigm 201063
Nuclear Antigen Staining buffer Fluidigm 201063
Trypan blue Sigma T8154
Tuberculin syringe BD 309626
Type IV Collagenase  Worthington Bioscience CLSS-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  8. Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
  9. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  10. Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
  12. http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
  13. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  14. Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
  15. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
  16. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  17. Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
  18. Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  19. Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
  20. Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  21. http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
  22. http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
  23. Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
  24. Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
  25. Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
  26. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  27. Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  28. Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
  29. Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
  30. Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
  31. Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).

Tags

विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 147 सेल साइकिल Epidermis त्वचा Keratincyte अलगाव माउस मॉडल मास साइटोमेट्री प्रसार प्रोटीन अभिव्यक्ति के सहसंबंध एकल सेल विश्लेषण
अलगाव और मास साइटोमेट्री द्वारा सेलुलर प्रोटीन अभिव्यक्ति के सेल चक्र विशिष्ट विश्लेषण के लिए माउस त्वचा Keratincytes के दाग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez, J., Torchia, E. C.… More

Fernandez, J., Torchia, E. C. Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59353, doi:10.3791/59353 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter