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Developmental Biology

Aislamiento y tinción de queratinocitos de piel de ratón para el análisis específico del ciclo celular de la expresión de proteínacelular espora

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59353
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Este protocolo describe cómo aislar los queratinocitos de la piel de los modelos de ratón, para manchar con anticuerpos etiquetados con metal, y analizar las células manchadas por citometría de masa para perfilar el patrón de expresión de proteínas de interés en las diferentes fases del ciclo celular.

Abstract

El objetivo de este protocolo es detectar y cuantificar los cambios en la expresión de proteínas de una manera dependiente del ciclo celular utilizando células individuales aisladas de la epidermis de la piel del ratón. Hay siete pasos importantes: separación de la epidermis de la dermis, digestión de la epidermis, tinción de las poblaciones de células epidérmicas con cisplatino, código de barras de muestra, tinción con anticuerpos metálicos etiquetados para marcadores de ciclo celular y proteínas de interés, la detección de anticuerpos marcados con metal por citometría de masas y el análisis de la expresión en las distintas fases del ciclo celular. La ventaja de este enfoque sobre los métodos histológicos es el potencial de probar el patrón de expresión de >40 marcadores diferentes en una sola celda en diferentes fases del ciclo celular. Este enfoque también permite el análisis de correlación multivariante de la expresión de proteínas que es más cuantificable que los métodos histológicos/imágenes. La desventaja de este protocolo es que se necesita una suspensión de células individuales, lo que resulta en la pérdida de información de ubicación proporcionada por la tinción de secciones de tejido. Este enfoque también puede requerir la inclusión de marcadores adicionales para identificar diferentes tipos de células en suspensiones de células brutas. La aplicación de este protocolo es evidente en el análisis de modelos de enfermedades hiperplásticas de la piel. Además, este protocolo se puede adaptar para el análisis de un subtipo específico de células (por ejemplo, células madre) mediante la adición de anticuerpos específicos de linaje. Este protocolo también se puede adaptar para el análisis de células de la piel en otras especies experimentales.

Introduction

La correlación de la expresión génica con las etapas del ciclo celular sigue siendo un desafío en el análisis de modelos animales de enfermedades hiperplásicas como el cáncer. Parte de este desafío es la co-detección de proteínas de interés (PDI) con marcadores de proliferación. Células proliferativas se pueden encontrar en varias fases del ciclo celular incluyendo G1, S, G2, y M. Ki67 es uno de los marcadores más utilizados de proliferación y se expresa en todas las fases del ciclo celular. Ha sido ampliamente utilizado en el análisisde tejidos humanos y ratón 1,2,3. Sin embargo, al igual que otros marcadores de proliferación general, Ki67 no discerne las fases individuales del ciclo celular. Un enfoque más preciso utiliza la incorporación de análogos de nucleótido de timidina como la bromodeoxiuridina (BrdU) en células que están replicando activamente su genoma (es decir, fase S)4,5. Un inconveniente para el uso de análogos de nucleótidos es la necesidad de administrarlos a animales vivos horas antes del análisis. Ki67 y BrdU se detectan comúnmente en secciones de tejido fijo mediante el uso de anticuerpos. Una ventaja de este enfoque es que la ubicación de los PDI se puede determinar dentro de la arquitectura tisular (por ejemplo, la capa basal de la epidermis cutánea). Este enfoque tampoco requiere disociación tisular que pueda conducir a cambios en la expresión génica. Una desventaja es que la fijación tisular o el procesamiento del tejido para la congelación de PTO o la sección de parafina pueden ocluir objetivos de anticuerpos (es decir, antígenos). La recuperación de antígenos generalmente requiere calor o digestión de los tejidos. La cuantificación de las intensidades de tinción también puede ser un desafío. Esto se debe a variaciones en la tinción, el grosor de la sección, la detección de señal y el sesgo del experimentador. Además, un número limitado de marcadores se puede detectar simultáneamente en la mayoría de las configuraciones típicas de laboratorio. Sin embargo, los nuevos enfoques de tinción múltiple x prometen superar estas limitaciones; ejemplos son la citometría de masa de imágenes y la amplificación de señal de tyramida6,7.

La citometría de flujo es otra tecnología poderosa para detectar células que proliferan. Permite la detección múltiple x de marcadores en las mismas células, pero requiere disociación de tejido para la mayoría de los tipos de células no hematopoyéticas. El análisis de las células que proliferan se realiza rutinariamente mediante el uso de disteados que unen el ADN (por ejemplo, yoduro propidum (PI))8. La citometría de flujo también permite una determinación más precisa de las fases del ciclo celular cuando se combina con la detección de la incorporación de BrdU9. Aunque es un enfoque poderoso, la citometría de flujo BrdU/PI tiene sus desventajas. Es incapaz de resolver las fases G2/M y G0/G1 sin la inclusión de anticuerpos específicos de fase. Sin embargo, el número de anticuerpos que se pueden utilizar está limitado por la autofluorescencia celular, el derrame espectral de emisiones de fluoróforos y el uso de controles de compensación. Esta limitación marca más difícil y laborioso codetectar la expresión de marcadores de ciclo celular con PDI. Un enfoque más fácil es utilizar la citometría de masas10,11. Esta tecnología utiliza anticuerpos conjugados metálicos que tienen un espectro de detección más estrecho. Una vez que las células se tiñen con anticuerpos etiquetados con metal, se vaporizan y los metales detectan por espectrometría de masas de tiempo de vuelo (CyTOF) de citometría. Debido a estas propiedades, la citometría de masas permite la detección múltiplex de >40 marcadores diferentes utilizando las plataformas existentes10,11. Además, es posible descontrolar muestras con metales que resultan en el ahorro de anticuerpos preciosos al tiempo que se reduce la variabilidad de las manchas de muestra a muestra. Por otro lado, la citometría de masas tiene varias desventajas. Hay un número limitado de anticuerpos etiquetados con metal es el país para células derivadas de la sangre. La cuantificación del contenido de ADN es menos sensible en comparación con el uso de tintes fluorescentes de ADN y la citometría de masa sin efecto tiene un rango dinámico reducido de detección de señal en comparación con la citometría de flujo de fluorescencia.

El protocolo descrito aquí fue diseñado para analizar la dinámica del ciclo celular de los queratinocitos recientemente aislados (KCs) de la piel del ratón y caracterizar la expresión de proteína específica del ciclo celular en estas células utilizando citometría de masa. Este protocolo también se puede utilizar con células cultivadas o adaptada a otros tipos de células.

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Protocol

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus aprobó los experimentos con animales descritos en este protocolo.

1. Preparativos

  1. Diseñe un panel de anticuerpos con etiqueta metálica. Utilice el software gratuito de diseño de paneles en línea12 e incluya 127IododeoxyUridine (IdU), 164Dy (Dysprosium) con la etiqueta anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) fosfo (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3) y 150 Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA proteínaSer807/811 (pRB)13. Añadir anticuerpos adicionales etiquetados con metal que no se superponen en su señal de canal14.
  2. Prepare una solución de stock de IdU. Disolver el idu en polvo a 10 mg/ml en 0,1 N NaOH a 60 oC. Solución de stock de Aliquot IdU en tubos de microcentrífuga y congelación a -20 oC para almacenamiento a largo plazo.
    1. Ajuste el pH de la solución de IdU a 7.5 con 12 N HCl inmediatamente antes de su uso. Pruebe con una tira de pH en una alícuota de descarte para asegurarse de que la solución está en pH 7.5.
      NOTA: El tiempo prolongado (>5 min) de IdU a pH 7.5 dará lugar a precipitación y se necesita una nueva alícuota de IdU cuando esto suceda.
    2. Utilice el equipo de protección personal adecuado (por ejemplo, guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad) y trabaje en un gabinete de seguridad cuando manipule soluciones NaOH o HCl.
  3. Prepare una solución de fijación de 2x paraformaldehyde (PFA). Combinar 5 ml de 10pbs (pH 7,5) y 1 mL de 16% PFA con 44 ml de grado molecular puro dH2O (3,2% de concentración final).
    NOTA: Un stock de PFA se puede preparar como publicado anteriormente15 o comprar 16% de existencias libres de metales contaminantes.
    1. Utilice el equipo de protección personal adecuado y trabaje en un armario de seguridad cuando manipule polvo y soluciones PFA.
  4. Preparar bario (Ba2+) libre 1x PBS combinando 5 mL de 10x PBS sin metal (pH 7.5) con 45 mL de grado molecular puro dH2O.
    NOTA: La calidad de PBS y otros reactivos es muy importante para evitar la contaminación de metales que pueden introducir ruido de fondo durante el análisis de datos citométricos de masa.
  5. Prepare una solución de stock de cisplatino de 100 mM. Disolver 300,5 mg de cisplatino en polvo en 10 ml de DMSO. Conservar en alícuotas a -80oC. Preparar una solución de trabajo de cisplatino de 10 mM para experimentos que se utilizarán a lo largo de 1 d.
  6. Preparar soluciones de separación de epidermis/dermis. Preparar una solución de stock de dosificación 20veces disolviendo 30 mg en 1 ml de HBSS o PBS. El filtro esteriliza a través de un filtro de 0,22 m y guárdelos en alícuotas a -20 oC. Preparar una solución de stock de colagenasa de 1x tipo IV a 1 mg/ml en HBSS, filtrar el esterilizado a través de un filtro de 0,22 m y almacenar alícuotas a -20 oC.

2. Etiquetado de la fase S por incorporación de IdU

  1. Pesar ratones. Use cachorros neonatales P1-P3 o ratones adultos de 8-10 semanas de edad y use ratones machos o hembras de un fondo C57BL/6, FvB o 129. Determinar una dosis a 0,1 mg de IdU (pH 7,5)/g de peso corporal. Por ejemplo, un ratón de 25 g requiere 0,25 ml de IdU.
  2. Administrar la dosis de IdU mediante una inyección intraperitoneal y esperar 2 horas antes de cosechar células. Utilice una jeringa de tuberculina para inyectar cachorros neonatales.
    NOTA: Se puede utilizar una dosis de 2 mg/ml de IdU con células de cultivo tisular con una incubación de 1 h a 37 oC antes de la cosecha y el etiquetado para la citometría de masa.

3. Aislamiento de celdas para el etiquetado

  1. Soluciones de descongelación y stock de colagenasa. Diluir la solución de 20x para dosis en 1x (1,5 mg/ml) en HBSS estéril o PBS. Mantener en hielo hasta que esté listo para usar.
  2. Combina 2 volúmenes de pisase con 1 volumen de colagenasa en un volumen total que permite que la piel flote libremente. Por ejemplo, la digestión de 5 pieles de ratón neonatal se puede flotar en 8 ml de 1x prescindir con 4 ml de colagenasa en un plato de Petri de 100 mm.
  3. Siga los métodos aprobados para eutanasiar ratones experimentales (por ejemplo, sobredosis de isoflurano/pellizco de los dedos de los dedos o inhalación de CO2/dislocación cervical). Limpie la piel del oído adulto con una solución de yodo (ver Tabla de materiales)y enjuague con agua estéril cuando las células aisladas se utilicen para el cultivo de tejidos.
  4. Extirpación quirúrgica de la oreja en la base (Figura1A). Enjuague las orejas en PBS estéril cuando las células aisladas se utilicen para el cultivo de tejidos. Colocar sobre un plato Petri seco de 100 mm.
  5. Separe cuidadosamente la piel posterior de la piel posterior creando inicialmente un bolsillo en el centro o borde del área de corte usando fórceps finos y tirando de las dos aletas de la piel separadas (Figura 1B-D). Proceda con las pieles anterior y posterior.
    NOTA: Litchi et al. 16 Además, litchi et al.16 Además, el uso de un visor de disección puede ayudar a separar la piel anterior de la piel posterior y a la identificación de la epidermis/lados dérmicos de piel: el cabello es visible en el lado de la epidermis, mientras que la dermis tendrá un aspecto gelatinoso.
  6. Coloque cuidadosamente las pieles anterior y posterior del oído con el lado de la dermis de la piel tocando la solución de dispensación/colagenasa (Figura 1E). Utilice 1 ml para la piel anterior y posterior de una sola oreja por poc. Incubar a 37oC durante 1 h. Alternativamente, flotar las pieles en 1sa solución de dosificación a 4oC durante 16-18 h.3
    NOTA: Trabaje en una campana de cultivo de tejido con técnica estéril cuando las células deben ser cultivadas.
  7. Coloque la piel digerida con el lado de la epidermis tocando la superficie de un plato Petri limpio. Aplanar la piel y deslizar suavemente la dermis fuera de la epidermis trabajando desde el centro hasta los bordes en un patrón circular.
  8. Deseche la dermis o digerirla aún más para liberar fibroblastos para el cultivo o análisis de tejidos16.
    NOTA: La dermis será más oscura en apariencia y tendrá una composición gelatinosa y pegajosa. La dermis debería desprenderse fácilmente. La insuficiencia o dificultad para extirpar la dermis sugiere una digestión de tejido insuficiente. Sin embargo, la incubación prolongada en el tampón de digestión reducirá la viabilidad celular. La epidermis permanecerá en el plato de Petri y tendrá una apariencia blanqueada.
  9. Levante suavemente la epidermis agarrando los bordes y despegándola de la superficie del plato Petri. Colocar cuidadosamente la epidermis en la solución de desprendimiento celular precalentada (ver Tabla de Materiales)durante 5 min a 37oC o 20 min a RT. Use 500 sl de solución de desprendimiento celular para 2 epidermis de oído adulto por pozo de una placa de cultivo de 12 pocillos y utilice 750 s de desprendimiento celular solución para una sola epidermis neonatal por pozo de una placa de cultivo de 6 pozos.
  10. Agarre la epidermis usando fórceps estériles y frote arrastrando la epidermis contra la parte inferior del plato para disociar las células. Añadir 1 ml de DMEM que contenga 1% de FBS (0,01 ml) y pasar a través de un tamiz celular de 40 m a un tubo de recogida. Enjuague bien con 2 ml adicionales de DMEM y agréguelo a la suspensión celular.
  11. Centrífuga a 120 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con cuidado.
  12. Resuspenda el pellet celular en 1-2 ml de DMEM que contenga 1% DE FBS. Determine el número de celdas y porcentajes de celdas vivas usando Trypan Blue y un hemocitómetro o dispositivo de conteo automatizado. Células de pellet como se describe en el paso 3.11.
    NOTA: Las células se pueden cultivar en medios de cultivo de tejidoapropiados apropiados después del paso 3.12. 17

4. Etiquetado de cisplatino para determinar células vivas/muertas

  1. Resuspenda 1-3 x 106 células por 1 ml de DMEM que contengan 25 m de cisplatino (2,5 ml de stock/ml). Incubar durante 1 min y apagar por pipeteo con un volumen igual de FBS (por ejemplo, 1 mL).
  2. Centrífuga a 120 x g durante 5 min. Decant sobrenadante en un vaso de precipitados que contiene lejía diluida y tubos invertidos para drenar la solución restante en una toalla de papel. Toque suavemente para liberar la solución restante en el pellet y la pared lateral del tubo.
  3. Resuspenda el pellet celular en 2 ml de PBS libre de Ba+2. Células de pellet como se describe en el paso 4.2.
    NOTA: Se recomienda fijar las celdas si no se pueden manchar inmediatamente.

5. Fijación de celdas etiquetadas con cisplatino (opcional)

  1. Resuspenda 1-3 x 106 células etiquetadas con cisplatino en 1 ml de PBS libre de Ba+2. Células vórtice bajo baja potencia continua y añadir gotas 1 mL (1 volumen) del búfer de fijación 2x PFA. Incubar a RT durante 10 minutos en una plataforma de balanceo.
  2. Células de pellet como se describe en el paso 4.2, pero centrífuga a 500 x g durante 5 min.
  3. Lave las células con 2 ml de células PBS y pellets libres de Ba+2como se describe en el paso 5.2. Repita el paso 5.3 una vez.
  4. Resuspenda el pellet en 2 mL de Ba+2-pbS libre. Almacenar a 4 oC durante <3 d. Añadir FBS al 3% (por ejemplo, 0,3 ml de FBS/ml de celdas) del volumen total si almacena más tiempo >3 d, luego mezcle y congele a -80 oC.
    NOTA: La fijación puede afectar a la detección de ciertos epítopos. Los efectos de la fijación en la señal de anticuerpos deben determinarse empíricamente.

6. Codificación de barras de muestras (opcional pero recomendada)

  1. Células de pelet como se describe en el paso 5.2 y luego resuspenden 1-3 x 106 celdas en 1 mL de 1x búfer de fijación (consulte Tabla de materiales). Incubar a RT durante 10 min. Células de pellets como se describe en el paso 5.2.
  2. Lavar las celdas con 1 ml de búfer de permeabilización de código de barras (ver Tabla de Materiales). Células de pellet como se describe en el paso 5.2. Repita el paso 6.2 una vez.
  3. Agregue 100 l de búfer de permeabilización de código de barras a los códigos de barras (consulte Tabla de materiales)18 y mezcle inmediatamente mientras las celdas del paso 6.2 se están peletando.
  4. Resuspenda el gránulo celular en 800 ml de búfer de permeabilización de código de barras. Agregue la solución de código de barras a las células, mezcle e incuba a RT durante 30 min. Lave las células en 2 ml del tampón de tinción celular (ver Tabla de materiales)y repleta de pellets de nuevo.
    NOTA: Se pueden etiquetar hasta 20 muestras con varias combinaciones de metales de paladio18. Otras estrategias de codificación de barras se describen en otro lugar15.

7. Etiquetado de células para citometría de masa

  1. Resuspenda 1-3 x 106 células en 1 ml de solución de trabajo tampón de tinción de antígeno nuclear (ver Tabla de materiales). Combine las muestras en un solo tubo para los pasos posteriores cuando utilice muestras con códigos de barras. Incubar a RT durante 30 min. Pellet como se describe en el paso 5.2.
  2. Resuspenda 1-3 x 106 células en 2 ml del búfer de permeabilización de tinción de antígeno nuclear (ver Tabla de materiales). Escale según sea necesario. Por ejemplo, utilice 6 ml de búfer para 10 muestras combinadas con un recuento de celdas de 9 x 106 celdas. Pellet como se describe en el paso 5.2.
  3. Repita el paso 7.2. Reórtca suavemente el pellet de celda en el volumen residual que queda en el tubo.
  4. Añadir 50 s de cóctel intracelular de anticuerpos por 1-3 x 106 células. Escale según sea necesario. Por ejemplo, utilice 150 l del cóctel de anticuerpos para 10 muestras combinadas con un recuento celular de 9 x 106 células. Mezclar e incubar a RT durante 45 min. Añadir 2 ml de tampón de tinción celular y pellet como se describe en el paso 5.2.
  5. Resuspenda 1-3 x 106 células pellet en 2 mL de tampón de tinción celular. Células de pellet como se describe en el paso 5.2. Repita el paso 7.5 una vez.
    NOTA: Otras soluciones tampón se pueden utilizar para la tinción de la membrana extracelular o marcadores citoplasma y el experimentador puede tener que optimizar la tinción si hay una necesidad de detectar epítopos en diferentes ubicaciones celulares. Las células también se pueden fijar en PFA después del paso 7.5 cuando se utilizan células vivas para la tinción.
  6. Resuspenda 1-3 x 106 células en 1 ml de solución de intercalación y guárdelas durante 1-3 d a 4oC.
    1. Almacene las células a -80 oC en DMSO que contiene la solución para >3 d. Células de pellets como se describe en el paso 5.2 si las células están en solución de intercalación. Resuspenda el pellet (1-3 x 106 células) en 1 ml de tampón de tinción celular y células de pellets como se describe en el paso 5.2. Resuspender el pellet en 1 mL de 10% DMSO/90% FBS19,transferir a un criovial, colocar en un recipiente de congelación de isopropanol, y almacenar a -80 oC.
  7. Células de pellet como se describe en el paso 5.2. Lave 1-3 x 106 células con 2 ml de tampón de tinción celular, peletización como se describe en el paso 5.2. Realice dos lavados adicionales con 2 ml de agua, peletización como se describe en el paso 5.2.
  8. Perlas de calibración de ecualización diluidas 1:9 en agua (solución en stock a 3,3 x 105 perlas/ml).
  9. Resuspenda el pellet celular a una concentración de 1 x 106 células/ml con solución de perlas EQ diluida. Filtrar las células a través de tubos de flujo de tapa de colador de 35 m.
  10. Ejecute muestras en el citómetro de masa y adquiera datos. Los datos se depositarán en un formato de archivo Flow Cytometry Standard (FCS).

8. Procesamiento y análisis de archivos de datos de citometría masiva

  1. Normalizar archivos FCS. Utilice un programa gratuito disponible a las https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
  2. Deconvolute archivos FCS con código de barras. Separe la población de códigos de barras agrupados en archivos de códigos de barras separados con un programa gratuito disponible en https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
  3. Analice los archivos FCS normalizados. Utiliceprogramascomerciales 21,22 o freeware (ver web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).

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Representative Results

La Tabla 1 muestra los rendimientos celulares esperados y la viabilidad del oído adulto del ratón (Figura1)y la piel neonatal en condiciones no patológicas. La tabla también muestra datos representativos de animales de un fondo mixto C57/126. Se espera que la piel de otras cepas resultaría en rendimientos celulares similares y vihabilidades. El rendimiento aproximado depende de la superficie de la piel e indica que la piel neonatal sería una mejor opción para experimentos que requieren un mayor número de células (Tabla1). Bajos rendimientos o viabilidad reducida (<50%) indicaría problemas con la digestión o condiciones experimentales que reducen la integridad de la piel o inducen la muerte celular. Cultivar células con medios y suplementos apropiados puede ayudar a evaluar la calidad de los preparados de KC17.

Después de la normalización20 y la desconvullación18 de los archivos FCS, la puntuación de los datos definirá las poblaciones de células epidérmicas de interés y desmarcará las fases del ciclo celular individual (Figura2). En las gráficas bivariadas que comparan los canales 191Ir vs 193Ir, las celdas intactas se pueden agarlar en el cuadrante superior derecho (Figura2A). Trazar la longitud del evento frente a 191Ir y seleccionar para un clúster estrecho de celdas cerca del eje 191Ir desmarca celdas individuales. Las celdas viables se seleccionan en una gráfica de 195Pt frente a 193Ir parcela por gating para celdas con niveles bajos de 195Pt. La muestra que se muestra en la Figura 2A tiene escombros y una mayor presencia de cisplatino etiquetado sin células viables. Esto puede indicar que la muestra fue sobre-digerida, manejada duramente, o dejada en hielo o RT durante demasiado tiempo antes de manchar para la citometría de masa. Los perfiles de células cultivadas en tejidos suelen dar porcentajes más altos de 195células negativas (Figura2B). Alternativamente, la presencia de 195células positivas Pt puede esperarse si la muerte celular de inducción es una característica del modelo experimental y / o condiciones.

Idealmente, los marcadores que definen la población de interés deben incluirse en el análisis de tipos de celdaespecíficos. Por ejemplo, las células inmunitarias que se espera que estén presentes en las suspensiones brutas de KC se pueden detectar mediante la adición de un anticuerpo CD4523, que detecta células hematopoyéticas (Figura2C). Con respecto al panel de anticuerpos de proliferación13, el trazado de IdU vs CYCLIN B1 resuelve las fases del ciclo celular (Figura2C) similares a la gráfica de flujo estándar BrdU/PI (Figura2D),lo que permite la detección de células de fase S, G0/G1 y G2/M Poblaciones. En las gráficas IdU vs pHH3, la alta positividad pHH3 identifica las celdas de fase M. Por último, las células gating G0/G1 en la señal de alta er. PRB pueden distinguir G0 (en reposo) de las células en G1 (Figura2C,izquierda más panel).

Una vez identificadas las diferentes fases del ciclo celular, es posible construir una representación gráfica de los perfiles de ciclo celular para diferentes tipos de celdas o condiciones experimentales. Por ejemplo, surgen perfiles de ciclo celular distintos al comparar las poblaciones de células CD45- vs CD45+ (Figura3A)en la suspensión KC que se muestra en la Figura2. Como se esperaba que los KC hiperplásticos encontrados en el grupo CD45- tenían menoscélulas en G0 y más células en las fases S, G2 y M 3. Por el contrario, las células inmunitarias de la misma muestra tenían poblaciones notables en G0 y G1. Además de los perfiles del ciclo celular, también es posible la caracterización de la expresión génica de una manera dependiente del ciclo celular. Por ejemplo, las proteínas fosfo que ayudan a definir la señalización EGFR y mTOR/PI3K se analizaron en los datos presentados para la Figura 3A. El análisis de las fases G1 de las células CD45- vs CD45+ reveló un perfil similar para las proteínas de señalización EGFR y mTOR/PI3K, aunque parecía haber ligeras diferencias en el porcentaje de células positivas pS6 y pEGFR (Figura3B). Se pueden adaptar enfoques similares para caracterizar la expresión de otras proteínas de la vía de señalización o procesos celulares en diferentes fases del ciclo celular.

Figure 1
Figura 1 : Preparación de la piel del oído del ratón para la digestión. (A) En primer lugar, retire la oreja del animal y acostécela sobre un plato petri limpio. (B) Sujete un lado de la oreja en el centro o en el borde utilizando fórceps de precisión curvos. (C) Voltee y use otro par de fórceps y tire suavemente de las mitades de la oreja hasta que la oreja se desgarre en el pliegue. (D) Continúe tirando hasta que los lados se separen en dos mitades. (E) Flotar las mitades de la oreja en los medios de disociación con el lado de la dermis tocando la solución. Barra de escala de 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Estrategia de gating para datos de citometría de masas. Los datos en esta figura se generaron a partir de un animal experimental tratado con el éster de phorbol TPA como se describió anteriormente3. TPA es un activador PKC que induce inflamación de la piel24. (A) Los paneles muestran la estrategia de gating inicial después de la normalización y la desconvolución de los datos con códigos de barras. Al realizar una longitud de evento, 191canales Ir,193Ir y 195Pt, es posible seleccionar celdas intactas, individuales y viables. (B) SCC humano SRB-P93 células tratadas con DMSO y luego se teñiron para la citometría de masas. Los datos se agarró como en (A) y la gráfica muestra los niveles de celdas vivas en esta muestra. (C) La inclusión de marcadores de linaje permite la selección de poblaciones celulares de interés. En este ejemplo, las celdas viables de (A) se agargarron en la longitud del evento frente a CD45 para excluir las células hematopoyéticas. La ampliación de células CD45- para la incorporación de IdU vs CYCLIN B1 permite la identificación de las poblaciones de células S, G0/G1 y G2/M. La selección de células altas pHH3 define la fase M, mientras que el análisis de G0/G1 para la positividad del PRB identifica las células en G1. ( D ) La gráfica muestra los resultados representativos del análisis del ciclo celular mediante la detección de la incorporación de BrdU y PI (contenidodeADN) con citometría de flujo basada en fluorescencia. Los datos mostrados proceden de células humanas Colo163 SCC cultivadas con BrdU durante 1 h como se describió anteriormente3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Caracterización de perfiles de ciclo celular y expresión proteica específica de fase. (A) Los perfiles de ciclo celular se determinaron en la muestra de la Figura 2 para las celdas CD45- vs CD45+. (B) El análisis de las fases G1 con anticuerpos fosfo-específicos en células CD45-(naranja) y CD45+(azul) reveló perfiles de expresión similares para los marcadores de las vías de señalización EGFR y mTOR/PI3K. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tejido Área Rendimiento celular Viabilidad
Oreja de ratón 225-230 mm3 1-2x106 70-90%
Piel neonatal 1000-1100 mm3 5-10x106 80-99%

Tabla 1: Rendimiento típico de las células y viabilidad del oído adulto del ratón y de la piel neonatal. El recuento de células y la viabilidad por exclusión azul trypan se promediaron de los KCs de oído cosechados de las orejas de ratón adultas de n.o 7 a 10 semanas de edad o de las pieles neonatales n.o 7 P3.

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Discussion

El protocolo descrito en este documento puede completarse en aproximadamente 8 h. El resultado final es una suspensión de células enriquecidas en KCs que se pueden analizar para la expresión de proteínas de una manera dependiente del ciclo celular. Varios estudios previos han esbozado métodos para aislar los KCs de la piel humana y del ratón16,25. Estos estudios también incluyen protocolos para el aislamiento de los KCs para la citometría de flujo26. Sin embargo, no se ha descrito previamente un protocolo detallado que combine el aislamiento de los C.con el análisis de la expresión de proteínas y la dinámica del ciclo celular utilizando citometría de masa.

El mayor obstáculo para obtener resultados de alta calidad en este protocolo es la calidad de las células vivas utilizadas. En la literatura, las condiciones sugeridas y enzimas para la separación de epidermis/dermis varían en gran medida16,25,26,27. Sin embargo, se recomienda así mantener el tiempo de digestión de la piel a la menor duración posible que permita la separación efectiva de la epidermis de la dermis. Este protocolo presenta digestión con dosis y colagenasa tipo IV que permite la separación fácil de la piel neonatal del oído y del ratón dentro de 1 h. Esto da como resultado rendimientos de celda suficientes con alta viabilidad celular. Otro factor que puede afectar la calidad de las células es la ubicación de la piel seleccionada para la digestión. Se supone que los KCs se comportan de manera similar desde diferentes ubicaciones anatómicas en el cuerpo. Sin embargo, la piel en diferentes sitios puede tener diferentes propiedades y composición de células madre28,29. Sin embargo, se prefiere el uso de piel neonatal y de oído3,30 porque el aislamiento de KCs es más difícil de áreas de la piel con una alta densidad de folículos pilosos (por ejemplo, piel de espalda). Puede ser necesario un mayor grado de manipulación o disociación tisular para el aislamiento eficiente de los KCs de las zonas peludas del ratón26. Las condiciones experimentales antes del aislamiento de los KC también pueden afectar la calidad de las células aisladas. Las lesiones cutáneas o las afecciones que afectan la barrera cutánea o la integridad de la piel pueden reducir la separación de la epidermis de la dermis. Esto podría resultar en rendimientos reducidos de células viables o una mayor contaminación de células que no son de KC (por ejemplo, células inmunitarias). Por último, los Kaislados son susceptibles a aglutinarse. También pueden perder viabilidad celular si se dejan demasiado tiempo en hielo o en RT antes de procesarse para citometría de masas u otros análisis de una sola célula.

La metodología de tinción para la citometría de masa es similar a la utilizada para la citometría de flujo de fluorescencia pero con diferencias clave. Por ejemplo, la detección de la replicación del ADN se logra mediante la detección directa de IdU en lugar de mediante el uso de anticuerpos contra análogos de nucleótidos como BrdU. La detección directa de IdU simplifica en gran medida la identificación de células de fase S, ya que la detección de anticuerpos de BrdU puede ser un procedimiento implicado. Otra diferencia es el uso de cisplatino para la discriminación de células muertas y vivas. Cisplatino etiqueta preferentemente las células muertas. Este paso es similar al uso de PI u otras manchas para experimentos FACS muertos/vivos. El paso de tinción de cisplatino es importante porque las células muertas pueden unir anticuerpos y así generar señales falsas positivas. La citometría de masas también utiliza anticuerpos para detectar la expresión de un marcador específico de fase en lugar de medir el contenido de ADN. Esto permite una discriminación fácil de las fases individuales del ciclo celular. Por último, los archivos de datos de citometría de masa (FCS) deben normalizarse utilizando el pico de las perlas de calibración debido al deterioro de la señal de muestra con el tiempo en el instrumento CyTOF durante la misma ejecución y entre corridas.

La tinción, la adquisición de datos y el análisis de la citometría masiva han sido bien revisados por publicaciones recientes14,15. La aplicación de esta tecnología al análisis de células hematopoyéticas e inmunitarias está bien documentada. Esto es evidente por una gran colección de anticuerpos etiquetados con metales disponibles comercialmente y el predominio de publicaciones relacionadas con el sistema inmunitario que utilizan esta tecnología. La aplicación inmediata de citometría de masa en la piel sería para el análisis de las células inmunitarias. Esto es particularmente relevante para los modelos de piel de ratón en enfermedades como el cáncer donde la inflamación tiene un papel importante. Para el análisis de células no inmunes, la falta de anticuerpos etiquetados con metal es comercialmente puede ser un obstáculo. La ventaja de los reactivos comerciales es que se pueden utilizar sin una optimización considerable como sería el caso de los anticuerpos con etiqueta de metal de la casa. Sin embargo, hay anticuerpos etiquetados con metal contra etiquetas fluorescentes de uso común (por ejemplo, FITC, PE y APC) que permitirían a un experimentador agregar marcadores adicionales a su panel de tinción. Esta solución alternativa también se puede aplicar al análisis de células de la piel en diferentes especies donde puede haber un número limitado de anticuerpos comerciales etiquetados con metal que muestran reactividad entre especies. Sin embargo, esta solución alternativa también requiere un paso de tinción adicional después de la tinción de cisplatino y cierta optimización. En la literatura14se examina una consideración adicional para la construcción de un panel exitoso. Otra desventaja de la citometría de masas es que la eficiencia de recopilación de datos de los citometros de masa puede ser del 40-60% del número de celda de entrada. Como tal, el análisis de poblaciones de células raras (por ejemplo, células madre) a partir de muestras a granel puede requerir un mayor número de células, agrupación de muestras para la detección efectiva u otros enfoques para enriquecer la población celular de interés antes de la tinción para la citometría masiva 24.

La citometría de masas es una potente tecnología emergente cuyo uso seguirá creciendo. Actualmente, la aplicación de esta tecnología se centra en el uso de anticuerpos etiquetados metálicos, pero recientemente se amplió para la detección de ARNm31. Además, existe el potencial de etiquetar otros componentes celulares o metabolitos con etiquetas metálicas, lo que ampliaría el rango de aplicación de la citometría de masas en la piel y otros tejidos de ratones, humanos y otras especies. En resumen, este protocolo puede extender las herramientas experimentales disponibles para que los biólogos de la piel correlacionen la expresión de proteína KC en las distintas fases del ciclo celular.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El apoyo a este trabajo provino del Departamento de Dermatología, el Centro Gates de Medicina Regenerativa de la Universidad de Colorado y el Centro de Enfermedades de la Piel de la Universidad de Colorado (UC) Morfología y Fenotipado (NIAMS P30 AR057212). Los autores reconocen la subvención UC Cancer Center Flow Cytometry Shared Resource and support (NCI P30 CA046934) para el funcionamiento del citómetro de masas y agradecen a Karen Helm y Christine Childs en el centro por su asesoramiento experto sobre flujo y citometría masiva Técnicas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Cell Treat 229512
Intercalator solution Fluidigm 201192A 125 µM - Ir intercalator solution
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4 16 %  PFA
Strainer cap flow tubes Fisher/Corning 352235 35 µm pore size 
Cell sieve Fisher 22363547 40 μm pore size 
Cell detatchment solution CELLnTEC CnT-ACCUTASE-100 Accutase
Iodine Solution ThermoFisher/Purdue 67618-151-17 Betadine 7.5%-iodine surgical scrub
Barcode permeabilization buffer  Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Barcodes Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH strips EMD 9590 colorpHast
DMEM Hyclone SH30022.01 Dulbecco’s Modified Eagle Media
Fine forceps Dumont & Fils 0109-5-PO Dumostar #5
Curved precision forceps Dumont & Fils 0109-7-PO Dumostar #7
Calibration Beads Fluidigm 201078 EQ Four Element Calibration Beads
HBSS Gibco 14175-095 Hank's Balanced Salt Solution
Water Fisher SH30538.03 Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine  Sigma I7125 IdU
Cryo vials ThermoFisher 366656PK internal thread
Cell Staining buffer Fluidigm 201068 Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Perm buffer Fluidigm 201067 Maxpar Fix & Perm buffer
Fix I buffer Fluidigm 201065 Maxpar Fix I buffer
Phosphate buffered saline Rockland MB-008 Metal free 10x PBS
isopropanol-freezing container ThermoFisher 5100-0001 Mr.Frosty
Sodium hydroxide Fisher BP359-500 NaOH
Petri dish Kord-Valmark 2900 Supplied by Genesee 32-107 
15 mL conical Olympus/Genesee 28-101
50 mL conical Olympus/Genesee 28-106
6-well plate Cell Treat 229506
Cisplatin Sigma 479306
Dispase II Sigma/Roche 4942078001
DMSO Sigma D2650
FBS Atlanta Biologicals S11150
Hydrochloric acid Fisher A144-212
Nuclear Antigen Staining  permeabilization buffer Fluidigm 201063
Nuclear Antigen Staining buffer Fluidigm 201063
Trypan blue Sigma T8154
Tuberculin syringe BD 309626
Type IV Collagenase  Worthington Bioscience CLSS-4

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References

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Aislamiento y tinción de queratinocitos de piel de ratón para el análisis específico del ciclo celular de la expresión de proteínacelular espora
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Fernandez, J., Torchia, E. C. Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59353, doi:10.3791/59353 (2019).

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