Summary

Isolasjon og farging av mus Skin keratinocytter for celle syklus spesifikk analyse av Cellular protein uttrykk ved Mass flowcytometri

Published: May 09, 2019
doi:

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan å isolere huden keratinocytter fra musemodeller, å beis med metall-kodede antistoffer, og å analysere fargede celler ved masse flowcytometri for å profilen uttrykket mønster av proteiner av interesse i de ulike celle syklus faser.

Abstract

Målet med denne protokollen er å oppdage og kvantifisere protein uttrykk endringer i en celle syklus avhengig måte ved hjelp av enkeltceller isolert fra epidermis av musen huden. Det er sju viktige trinn: separasjon av epidermis fra dermis, fordøyelse av epidermis, farging av epidermal celle populasjoner med Cisplatin, sample barcoding, farging med metall merket antistoffer for celle syklus markører og proteiner av interesse, påvisning av metall-kodede antistoffer av masse flowcytometri, og analysen av uttrykket i de ulike celle syklus faser. Fordelen med denne tilnærmingen over histologiske metoder er potensialet til analysen uttrykket mønster av > 40 forskjellige markører i en enkelt celle i ulike faser av celle syklus. Denne tilnærmingen gir også mulighet for multivariabel korrelasjon analyse av protein uttrykk som er mer målbare enn histologiske/Imaging metoder. Ulempen med denne protokollen er at en suspensjon av enkeltceller er nødvendig, noe som resulterer i tap av stedsinformasjon gitt av farging av vev seksjoner. Denne tilnærmingen kan også kreve inkludering av ekstra markører for å identifisere ulike celletyper i råolje celle suspensjoner. Anvendelsen av denne protokollen er tydelig i analysen av hyperplastisk hudsykdom modeller. Videre kan denne protokollen tilpasses for analyse av spesifikke under type celler (for eksempel stamceller) ved tilsetning av avstamning-spesifikke antistoffer. Denne protokollen kan også tilpasses for analyse av hudceller i andre eksperimentelle arter.

Introduction

Korrelasjon av genuttrykk med celle syklus stadier er fortsatt en utfordring i analysen av dyremodeller av hyperplastisk sykdommer som kreft. En del av denne utfordringen er co-deteksjon av proteiner av interesse (POI) med markører for spredning. Proliferativ celler kan finnes i ulike celle syklus faser inkludert G1, S, G2, og M. Ki67 er en av de mest brukte markører for spredning og uttrykkes i alle faser av cellesyklusen. Det har vært mye brukt i analysen av både menneskelig og mus vev1,2,3. Men som andre generelle spredning markører, Ki67 ikke skjelne enkelte celle syklus faser. En mer presis tilnærming bruker inkorporering av tymidin nukleotid analogs som Bromodeoxyuridine (BrdU) i celler som er aktivt replikere sine Genova (dvs. S-fase)4,5. En ulempe for bruk av nukleotid analogs er behovet for å administrere dem til å leve dyr timer før analyse. Ki67 og BrdU blir ofte oppdaget på faste vevs deler ved bruk av antistoffer. En fordel med denne tilnærmingen er at plasseringen av POI kan fastslås innenfor vev arkitekturen (f. eks basal laget av huden epidermis). Denne tilnærmingen krever heller ikke vevs dissosiasjon som kan føre til endringer i genuttrykk. En ulempe er at vevet fiksering eller behandling av vev for OCT frosset eller para fin snitting kan tette antistoff mål (dvs. antigener). Henting av antigener krever vanligvis varme eller vevs fordøyelsen. Kvantifisering av farge intensitet kan også være utfordrende. Dette skyldes variasjoner i farging, snitt tykkelse, signal deteksjon og eksperimentator bias. Videre kan et begrenset antall markører oppdages samtidig i de fleste typiske laboratorie oppsett. Likevel, nyere multiplex flekker tilnærminger lover å overvinne disse begrensningene; Eksempler er Imaging Mass flowcytometri og Tyramide signal forsterkning6,7.

Flow flowcytometri er en annen kraftig teknologi for å oppdage voksende celler. Det gjør det mulig for multiplex deteksjon av markører i de samme cellene, men krever vev dissosiasjon for de fleste ikke-blodkreft celletyper. Analyse av voksende celler blir rutinemessig gjort ved bruk av fargestoffer som binder DNA (f. eks, Propidium iodide (PI))8. Flow flowcytometri tillater også en mer presis bestemmelse av celle syklus faser når kombinert med påvisning av BrdU innlemmelse9. Selv om en kraftig tilnærming, BrdU/PI Flow flowcytometri har sine ulemper. Det er ikke i stand til å løse de G2/M og G0/G1 fasene uten inkludering av fase-spesifikke antistoffer. Imidlertid er antall antistoffer som kan brukes begrenset av mobilnettet autofluorescence, Spectral smitteeffekter av fluoroforen utslipp, og bruk av kompensasjon kontroller. Denne begrensningen markes det mer utfordrende og arbeidskrevende å co-oppdage uttrykk for celle syklus markører med POI. En mer facile tilnærming er å bruke masse flowcytometri10,11. Denne teknologien bruker metall bøyd antistoffer som har et smalere gjenkjennings spektrum. Når cellene er farget med metall-merket antistoffer, de er fordampet, og metaller oppdages av flowcytometri tid-av-fly (CyTOF) masse massespektrometri. På grunn av disse egenskapene muliggjør masse flowcytometri den multiplex deteksjon av > 40 forskjellige markører ved hjelp av eksisterende plattformer10,11. I tillegg er det mulig å få strekkode prøver med metaller som resulterer i besparelser av dyrebare antistoffer, samtidig som fargevariasjonen i prøve-til-prøver reduseres. På den annen side, masse flowcytometri har flere ulemper. Det er et begrenset antall kommersielt tilgjengelige metall-kodede antistoffer for ikke-blod avledet celler. Kvantifisering av DNA-innhold er mindre følsom i forhold til bruk av fluorescerende DNA fargestoffer og masse flowcytometri har et redusert dynamisk område av signal deteksjon i forhold til fluorescens flyt flowcytometri.

Protokollen beskrevet her var utformet for å analysere celle syklus dynamikk fra nylig isolerte keratinocytter (KCs) fra mus hud og karakterisere celle syklus bestemt protein uttrykk i disse cellene ved hjelp av masse flowcytometri. Denne protokollen kan også brukes med kulturperler celler eller tilpasset andre celletyper.

Protocol

Universitetet i Colorado Anschutz Medical campus ‘ institusjonelle Animal Care og use Committee godkjent dyret eksperimenter beskrevet i denne protokollen. 1. forberedelser Utform et metall merket antistoff panel. Bruk den gratis online panel design programvare 12 og inkluderer 127IododeoxyUridine (IdU), 164dy (dysprosium) merket anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) fosfat (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), og 150</…

Representative Results

Tabell 1 viser forventet celle kapasitet og levedyktighet fra voksen mus øret (figur 1) og nyfødt hud under ikke-patologiske tilstander. Tabellen viser også representative data for dyr fra en blandet C57/126 bakgrunn. Det er forventet at huden av andre stammer vil resultere i tilsvarende celle gir og viabilities. Den omtrentlige avkastningen er avhengig av hudens overflateareal og indikerer at nyfødt hud vil være et bedre valg for eksper…

Discussion

Protokollen som er skissert i denne utredningen kan gjennomføres i ca 8 h. Sluttresultatet er en suspensjon av celler beriket i KCs som kan analyseres for protein uttrykk i en celle syklus-avhengig måte. Flere tidligere studier har skissert metoder for å isolere KCs fra menneske og mus Skin16,25. Disse studiene inkluderer også protokoller for isolering av KCs for Flow flowcytometri26. Imidlertid har en detaljert protokoll ikke blitt ti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Støtte for dette arbeidet kom fra Department of Dermatology, den Gates Center for regenererende medisin ved University of Colorado og University of Colorado (UC) Skin sykdom Center morfologi og bestemmelse av fenotype Cores (NIAMS P30 AR057212). Forfatterne erkjenner UC Cancer Center Flow flowcytometri delt ressurs og støtte stipend (NCI P30 CA046934) for driften av massen flowcytometer og er takknemlige for Karen Helm og Christine Childs i kjernen for deres ekspertråd om flyt og masse analytiske Teknikker.

Materials

12-well plate Cell Treat 229512
Intercalator solution Fluidigm 201192A 125 µM – Ir intercalator solution
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4 16 %  PFA
Strainer cap flow tubes Fisher/Corning 352235 35 µm pore size 
Cell sieve Fisher 22363547 40 μm pore size 
Cell detatchment solution CELLnTEC CnT-ACCUTASE-100 Accutase
Iodine Solution ThermoFisher/Purdue 67618-151-17 Betadine 7.5%-iodine surgical scrub
Barcode permeabilization buffer  Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Barcodes Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH strips EMD 9590 colorpHast
DMEM Hyclone SH30022.01 Dulbecco’s Modified Eagle Media
Fine forceps Dumont & Fils 0109-5-PO Dumostar #5
Curved precision forceps Dumont & Fils 0109-7-PO Dumostar #7
Calibration Beads Fluidigm 201078 EQ Four Element Calibration Beads
HBSS Gibco 14175-095 Hank's Balanced Salt Solution
Water Fisher SH30538.03 Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine  Sigma I7125 IdU
Cryo vials ThermoFisher 366656PK internal thread
Cell Staining buffer Fluidigm 201068 Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Perm buffer Fluidigm 201067 Maxpar Fix & Perm buffer
Fix I buffer Fluidigm 201065 Maxpar Fix I buffer
Phosphate buffered saline Rockland MB-008 Metal free 10x PBS
isopropanol-freezing container ThermoFisher 5100-0001 Mr.Frosty
Sodium hydroxide Fisher BP359-500 NaOH
Petri dish Kord-Valmark 2900 Supplied by Genesee 32-107 
15 mL conical Olympus/Genesee 28-101
50 mL conical Olympus/Genesee 28-106
6-well plate Cell Treat 229506
Cisplatin Sigma 479306
Dispase II Sigma/Roche 4942078001
DMSO Sigma D2650
FBS Atlanta Biologicals S11150
Hydrochloric acid Fisher A144-212
Nuclear Antigen Staining  permeabilization buffer Fluidigm 201063
Nuclear Antigen Staining buffer Fluidigm 201063
Trypan blue Sigma T8154
Tuberculin syringe BD 309626
Type IV Collagenase  Worthington Bioscience CLSS-4

References

  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  8. Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
  9. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  10. Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
  12. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  13. Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
  14. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
  15. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  16. Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
  17. Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  18. Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
  19. Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  20. Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
  21. Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
  22. Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
  23. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  24. Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  25. Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
  26. Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
  27. Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
  28. Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).

Play Video

Cite This Article
Fernandez, J., Torchia, E. C. Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59353, doi:10.3791/59353 (2019).

View Video