Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolasjon og farging av mus Skin keratinocytter for celle syklus spesifikk analyse av Cellular protein uttrykk ved Mass flowcytometri

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59353
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan å isolere huden keratinocytter fra musemodeller, å beis med metall-kodede antistoffer, og å analysere fargede celler ved masse flowcytometri for å profilen uttrykket mønster av proteiner av interesse i de ulike celle syklus faser.

Abstract

Målet med denne protokollen er å oppdage og kvantifisere protein uttrykk endringer i en celle syklus avhengig måte ved hjelp av enkeltceller isolert fra epidermis av musen huden. Det er sju viktige trinn: separasjon av epidermis fra dermis, fordøyelse av epidermis, farging av epidermal celle populasjoner med Cisplatin, sample barcoding, farging med metall merket antistoffer for celle syklus markører og proteiner av interesse, påvisning av metall-kodede antistoffer av masse flowcytometri, og analysen av uttrykket i de ulike celle syklus faser. Fordelen med denne tilnærmingen over histologiske metoder er potensialet til analysen uttrykket mønster av > 40 forskjellige markører i en enkelt celle i ulike faser av celle syklus. Denne tilnærmingen gir også mulighet for multivariabel korrelasjon analyse av protein uttrykk som er mer målbare enn histologiske/Imaging metoder. Ulempen med denne protokollen er at en suspensjon av enkeltceller er nødvendig, noe som resulterer i tap av stedsinformasjon gitt av farging av vev seksjoner. Denne tilnærmingen kan også kreve inkludering av ekstra markører for å identifisere ulike celletyper i råolje celle suspensjoner. Anvendelsen av denne protokollen er tydelig i analysen av hyperplastisk hudsykdom modeller. Videre kan denne protokollen tilpasses for analyse av spesifikke under type celler (for eksempel stamceller) ved tilsetning av avstamning-spesifikke antistoffer. Denne protokollen kan også tilpasses for analyse av hudceller i andre eksperimentelle arter.

Introduction

Korrelasjon av genuttrykk med celle syklus stadier er fortsatt en utfordring i analysen av dyremodeller av hyperplastisk sykdommer som kreft. En del av denne utfordringen er co-deteksjon av proteiner av interesse (POI) med markører for spredning. Proliferativ celler kan finnes i ulike celle syklus faser inkludert G1, S, G2, og M. Ki67 er en av de mest brukte markører for spredning og uttrykkes i alle faser av cellesyklusen. Det har vært mye brukt i analysen av både menneskelig og mus vev1,2,3. Men som andre generelle spredning markører, Ki67 ikke skjelne enkelte celle syklus faser. En mer presis tilnærming bruker inkorporering av tymidin nukleotid analogs som Bromodeoxyuridine (BrdU) i celler som er aktivt replikere sine Genova (dvs. S-fase)4,5. En ulempe for bruk av nukleotid analogs er behovet for å administrere dem til å leve dyr timer før analyse. Ki67 og BrdU blir ofte oppdaget på faste vevs deler ved bruk av antistoffer. En fordel med denne tilnærmingen er at plasseringen av POI kan fastslås innenfor vev arkitekturen (f. eks basal laget av huden epidermis). Denne tilnærmingen krever heller ikke vevs dissosiasjon som kan føre til endringer i genuttrykk. En ulempe er at vevet fiksering eller behandling av vev for OCT frosset eller para fin snitting kan tette antistoff mål (dvs. antigener). Henting av antigener krever vanligvis varme eller vevs fordøyelsen. Kvantifisering av farge intensitet kan også være utfordrende. Dette skyldes variasjoner i farging, snitt tykkelse, signal deteksjon og eksperimentator bias. Videre kan et begrenset antall markører oppdages samtidig i de fleste typiske laboratorie oppsett. Likevel, nyere multiplex flekker tilnærminger lover å overvinne disse begrensningene; Eksempler er Imaging Mass flowcytometri og Tyramide signal forsterkning6,7.

Flow flowcytometri er en annen kraftig teknologi for å oppdage voksende celler. Det gjør det mulig for multiplex deteksjon av markører i de samme cellene, men krever vev dissosiasjon for de fleste ikke-blodkreft celletyper. Analyse av voksende celler blir rutinemessig gjort ved bruk av fargestoffer som binder DNA (f. eks, Propidium iodide (PI))8. Flow flowcytometri tillater også en mer presis bestemmelse av celle syklus faser når kombinert med påvisning av BrdU innlemmelse9. Selv om en kraftig tilnærming, BrdU/PI Flow flowcytometri har sine ulemper. Det er ikke i stand til å løse de G2/M og G0/G1 fasene uten inkludering av fase-spesifikke antistoffer. Imidlertid er antall antistoffer som kan brukes begrenset av mobilnettet autofluorescence, Spectral smitteeffekter av fluoroforen utslipp, og bruk av kompensasjon kontroller. Denne begrensningen markes det mer utfordrende og arbeidskrevende å co-oppdage uttrykk for celle syklus markører med POI. En mer facile tilnærming er å bruke masse flowcytometri10,11. Denne teknologien bruker metall bøyd antistoffer som har et smalere gjenkjennings spektrum. Når cellene er farget med metall-merket antistoffer, de er fordampet, og metaller oppdages av flowcytometri tid-av-fly (CyTOF) masse massespektrometri. På grunn av disse egenskapene muliggjør masse flowcytometri den multiplex deteksjon av > 40 forskjellige markører ved hjelp av eksisterende plattformer10,11. I tillegg er det mulig å få strekkode prøver med metaller som resulterer i besparelser av dyrebare antistoffer, samtidig som fargevariasjonen i prøve-til-prøver reduseres. På den annen side, masse flowcytometri har flere ulemper. Det er et begrenset antall kommersielt tilgjengelige metall-kodede antistoffer for ikke-blod avledet celler. Kvantifisering av DNA-innhold er mindre følsom i forhold til bruk av fluorescerende DNA fargestoffer og masse flowcytometri har et redusert dynamisk område av signal deteksjon i forhold til fluorescens flyt flowcytometri.

Protokollen beskrevet her var utformet for å analysere celle syklus dynamikk fra nylig isolerte keratinocytter (KCs) fra mus hud og karakterisere celle syklus bestemt protein uttrykk i disse cellene ved hjelp av masse flowcytometri. Denne protokollen kan også brukes med kulturperler celler eller tilpasset andre celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Universitetet i Colorado Anschutz Medical campus ' institusjonelle Animal Care og use Committee godkjent dyret eksperimenter beskrevet i denne protokollen.

1. forberedelser

  1. Utform et metall merket antistoff panel. Bruk den gratis online panel design programvare 12 og inkluderer 127IododeoxyUridine (IdU), 164dy (dysprosium) merket anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) fosfat (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), og 150 ND (det)-pRETINOBLASTOMA proteinSer807/811 (pRB)13. Legg til flere metall kodede antistoffer som ikke overlapper i kanalsignalet14.
  2. Klargjør en lagerløsning for IdU. Oppløses sprøyte pulver ved 10 mg/mL i 0,1 N NaOH ved 60 ° c. Alikvot IdU lagerløsning i mikrosentrifugen rør og fryse ved-20 ° c for langtidslagring.
    1. Juster pH i IdU-løsningen til 7,5 med 12 N HCl umiddelbart før bruk. Test med en pH-stripe på en kaste alikvot for å sikre at løsningen er på pH 7,5.
      Merk: langvarig tid (> 5 min) av sprøytebruk ved pH 7,5 vil resultere i utfelling og en frisk alikvot av sprøytebruk er nødvendig når dette skjer.
    2. Bruk egnet personlig verneutstyr (f.eks. hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) og arbeid i et sikkerhetskabinett ved håndtering av NaOH-eller HCl-løsninger.
  3. Forbered en 2x paraformaldehyde (PFA) feste løsning. Kombiner 5 mL 10x PBS (pH 7,5) og 1 mL 16% PFA med 44 mL ren molekylær karakter dH2O (3,2% endelig konsentrasjon).
    Merk: en aksje av PFA kan tilberedes som tidligere utgitt15 eller kjøpe 16% aksjer fri for forurensende metaller.
    1. Bruk egnet personlig verneutstyr og arbeid i et sikkerhetskabinett ved håndtering av PFA pulver og løsninger.
  4. Forbered barium (ba2 +) gratis 1x PBS ved å kombinere 5 ml metall-fri 10x PBS (pH 7,5) med 45 ml ren molekylær karakter dH2O.
    Merk: kvaliteten på PBS og andre reagenser er svært viktig for å unngå forurensende metaller som kan innføre bakgrunnsstøy under analyse av masse analytiske data.
  5. Forbered en 100 mM Cisplatin lagerløsning. Løs opp 300,5 mg Cisplatin pulver i 10 mL DMSO. Oppbevares i alikvoter ved-80 ° c. Forbered en 10 mM Cisplatin arbeids løsning for eksperimenter som skal brukes over 1 d.
  6. Forbered epidermis/dermis separasjon løsninger. Forbered en 20x dispase lagerløsning ved å oppløse 30 mg i 1 mL HBSS eller PBS. Filteret steriliseres gjennom et 0,22 μm filter og oppbevares i alikvoter ved-20 ° c. Forbered en 1x type IV kollagenase lagerløsning ved 1 mg/mL i HBSS, Filtrer sterilisere gjennom et 0,22 μm filter, og oppbevar alikvoter ved-20 ° c.

2. merking av S-fase ved innlemmelse av sprøyte

  1. Veie mus. Bruk P1-P3 nyfødt valper eller 8-10 uker gamle voksen mus og bruke mannlige eller kvinnelige mus fra en C57BL/6, FvB, eller 129 bakgrunner. Bestem en dose ved 0,1 mg sprøyte (pH 7.5)/g kroppsvekt. En 25 g mus krever for eksempel 0,25 mL sprøyte antall.
  2. Administrere dosen av IdU med en intraperitoneal injeksjon og vente i 2 timer før høsting celler. Bruk en tuberkulin sprøyte for å injisere nyfødte valper.
    Merk: en dose på 2 mg/mL sprøytebruk kan brukes med vevs kultur celler med 1 h inkubasjons ved 37 ° c før høsting og merking for masse flowcytometri.

3. isolering av celler for merking

  1. Tin dispase og kollagenase lager løsninger. Fortynne den 20x dispase lager løsningen til 1x (1,5 mg/mL) i steril HBSS eller PBS. Hold på isen til klar til bruk.
  2. Kombiner 2 bind med dispase med 1 bind med kollagenase i et total volum som gjør at huden kan flyte fritt. For eksempel, kan fordøyelsen av 5 nyfødte mus skins bli fløt på 8 mL 1x dispase med 4 mL kollagenase i en 100 mm Petri parabolen.
  3. Følg godkjente metoder for å euthanize eksperimentelle mus (f. eks, isoflurane overdose/tå klype sjekk eller CO2 inhalasjon/cervical forvridning). Rengjør den voksne øre huden med en jod-løsning (se tabell over materialer) og skyll med sterilt vann når isolerte celler skal brukes til vevs kultur.
  4. Kirurgisk fjerning av øret ved basen (figur 1a). Skyll ørene i steril PBS når isolerte celler skal brukes til vevs kultur. Plasser på en tørr 100 mm Petri parabolen.
  5. Skill forsiktig fremre fra bakre huden ved å først lage en lomme i midten eller kanten av kuttet området ved hjelp av fine tang og trekke de to hud klaffene hverandre ( figur 1B-D). Fortsett med både fremre og bakre hud.
    Merk: detaljerte instruksjoner for å analysere nyfødt mus huden er levert av Litchi et al.16 i tillegg kan bruken av en dissekere omfang bistå i separasjon av fremre fra bakre hud og identifisering av epidermis/dermal sider av dissekert hud: håret er synlig på epidermis siden mens dermis vil ha en geléaktige utseende.
  6. Plasser forsiktig de fremre og bakre skinn av øret med dermis siden av huden berøre dispase/kollagenase løsning ( figur 1e). Bruk 1 mL for både fremre og bakre hud av et enkelt øre per brønn av en 12 brønn kultur plate. Ruge ved 37 ° c for 1 h. Alternativt kan du flyte skinn på 1x dispase løsning ved 4 ° c for 16-18 h.3
    Merk: arbeid i en vev kultur hette med steril teknikk når cellene skal kultivert.
  7. Plasser fordøyd huden med epidermis side berøre overflaten av en ren Petri parabolen. Flat ut huden og forsiktig skyver dermis av epidermis ved å jobbe fra sentrum til kantene i et sirkulært mønster.
  8. Kast dermis eller fordøye det videre til frigjøre fibroblaster for vev kultur eller analyse16.
    Merk: dermis vil være mørkere i utseende og har en geléaktige og klebrig komposisjon. Dermis skal lett komme av. Svikt eller vanskeligheter med å fjerne dermis antyder utilstrekkelig vev fordøyelsen. Men utvidet inkubasjons i fordøyelsen buffer vil redusere celle levedyktighet. Epidermis vil forbli på Petri parabolen og vil ha en bleket utseende.
  9. Løft forsiktig av epidermis ved å ta tak i kantene og skrelle den av overflaten av Petri parabolen. Forsiktig plassere epidermis på pre-varmet celle avløsning løsning (se tabell over materialer) i 5 min ved 37 ° c eller 20 min ved RT. Bruk 500 μL av celle løs øre løsning for 2 voksen øret epidermises per brønn av en 12 brønn kultur plate og bruke 750 μL av celle avløsning løsning for en enkelt nyfødt epidermis per brønn av en 6 brønn kultur plate.
  10. Ta tak i epidermis ved hjelp av steril tang og skrubb ved å dra epidermis mot bunnen av fatet for å distansere celler. Tilsett 1 mL DMEM inneholdende 1% FBS (0,01 mL) og gå gjennom en celle sil på 40 μm til et oppsamlings rør. Skyll godt med ytterligere 2 mL DMEM og Legg til celle fjæringen.
  11. Sentrifuger på 120 x g i 5 min. aspirer supernatanten forsiktig.
  12. Resuspend celle pellet i 1-2 mL DMEM inneholdende 1% FBS. Bestem cellen og% live celle tellinger ved hjelp av Trypan Blue og en hemocytometer eller automatisert telleenhet. Pellet celler som beskrevet i trinn 3,11.
    Merk: celler kan være kultivert i passende vev kultur Media etter trinn 3,12. 17 i

4. Cisplatin merking for å bestemme levende/døde celler

  1. Resuspend 1-3 x 106 celler per 1 ml DMEM inneholdende 25 μM cisplatin (2,5 μL av lager/ml). Ruge for 1 min og slukke ved pipettering med et lik volum av FBS (f. eks, 1 mL).
  2. Sentrifuger på 120 x g i 5 min. Dekanter supernatanten i et beger med fortynnet blekemiddel og Inverter rør for å drenere gjenværende løsning på et papir håndkle. Trykk forsiktig for å frigjøre løsningen som gjenstår på pellet og sidevegg av røret.
  3. Resuspend celle pellet i 2 mL ba+ 2-gratis PBS. Pellet celler som beskrevet i trinn 4,2.
    Merk: det anbefales å fikse celler hvis de ikke kan beiset umiddelbart.

5. fiksering av Cisplatin merket celler (valgfritt)

  1. Resuspend 1-3 x 106 Cisplatin merket celler i 1 ml av ba+ 2-gratis PBS. Vortex celler under kontinuerlig lav effekt og tilsett dråpevis 1 mL (1 volum) av 2x PFA fiksering buffer. Ruge på RT for 10 min på en rocking plattform.
  2. Pellet celler som beskrevet i trinn 4,2, men sentrifuge ved 500 x g i 5 min.
  3. Vask celler med 2 mL ba+ 2-gratis PBS og pellet celler som beskrevet i trinn 5,2. Gjenta trinn 5,3 én gang.
  4. Resuspend pellet i 2 mL av ba+ 2-gratis PBS. Oppbevares ved 4 ° c i < 3 d. Legg FBS til 3% (f. eks 0,3 mL FBS/mL celler) av det totale volumet hvis lagring lenger > 3 d, deretter mikse og fryse ved-80 ° c.
    Merk: fiksering kan påvirke påvisning av visse epitopes. Effekten av fiksering på antistoff signal må bestemmes empirisk.

6. barcoding av prøver (valgfritt, men anbefales)

  1. Pellet celler som beskrevet i trinn 5,2 og deretter resuspend 1-3 x 106 celler i 1 ml 1x fiksering buffer (se tabell over materialer). Ruge ved RT for 10 min. pellet celler som beskrevet i trinn 5,2.
  2. Vask celler med 1 mL strekkode permeabilization buffer (se tabell over materialer). Pellet celler som beskrevet i trinn 5,2. Gjenta trinn 6,2 én gang.
  3. Tilsett 100 μL av strekkode permeabilization buffer i strekkoder (se tabell over materialer)18 og bland umiddelbart mens cellene fra trinn 6,2 er pelleting.
  4. Resuspend celle pellet i 800, μL av strekkode permeabilization buffer. Legg strekkode løsning til celler, bland og ruge ved RT i 30 min. pellet celler som beskrevet i trinn 5,2. Vask celler i 2 mL cellefarge buffer (se tabell over materialer) og pellets igjen.
    Merk: opptil 20 prøver kan merkes med ulike kombinasjoner av Palladium metaller18. Andre barcoding strategier er beskrevet andre steder15.

7. merking av celler for masse flowcytometri

  1. Resuspend 1-3 x 106 celler i 1 ml av Nuclear antigen farging buffer arbeids løsning (se tabell over materialer). Kombiner prøvene i ett enkelt rør for påfølgende trinn når du bruker Barcoded prøver. Ruge ved RT i 30 min. pellet som beskrevet i trinn 5,2.
  2. Resuspend 1-3 x 106 celler i 2 ml Nuclear antigen farging permeabilization buffer (se tabell over materialer). Skaler etter behov. Bruk for eksempel 6 mL buffer for 10 kombinerte prøver med et celle tall på 9 x 106 -celler. Pellet som beskrevet i trinn 5,2.
  3. Gjenta trinn 7,2. Vortex celle pellet forsiktig i rest volumet igjen i røret.
  4. Tilsett 50 μL av intracellulære antistoff cocktail per 1-3 x 106 celler. Skaler etter behov. Bruk for eksempel 150 μL av antistoff cocktail i 10 kombinerte prøver med et celle tall på 9 x 106 celler. Bland og ruge ved RT i 45 min. Tilsett 2 mL cellefarge buffer og pellets som beskrevet i trinn 5,2.
  5. Resuspend 1-3 x 106 celler pellet i 2 ml cellefarge buffer. Pellet celler som beskrevet i trinn 5,2. Gjenta trinn 7,5 én gang.
    Merk: andre buffer løsninger kan brukes til farging ekstracellulære membran eller cytoplasmatiske markører og eksperimentator kan ha for å optimalisere farging hvis det er behov for å oppdage epitopes i forskjellige mobilnettet steder. Celler kan også festes i PFA etter trinn 7,5 når du bruker levende celler for farging.
  6. Resuspend 1-3 x 106 celler i 1 ml innskudds oppløsning og oppbevares for 1-3 d ved 4 ° c.
    1. Lagre celler ved-80 ° c i DMSO som inneholder løsningen for > 3 d. pellet celler som beskrevet i trinn 5,2 Hvis celler er i innskudds løsning. Resuspend pellet (1-3 x 106 celler) i 1 ml cellefarge buffer og pellet celler som beskrevet i trinn 5,2. Resuspend pellet i 1 mL av 10% DMSO/90% FBS19, overføring til en cryovial, plass i en isopropanol-fryser container, og lagre ved-80 ° c.
  7. Pellet celler som beskrevet i trinn 5,2. Vask 1-3 x 106 celler med 2 ml cellefarge buffer, pelleting som beskrevet i trinn 5,2. Utfør to ekstra vasker med 2 mL vann, pelleting som beskrevet i trinn 5,2.
  8. Fortynnet EQ kalibrering perler 1:9 i vann (lagerløsning på 3,3 x 105 perler/ml).
  9. Resuspend celle pellet ved en konsentrasjon på 1 x 106 celler/ml med fortynnet EQ perle løsning. Filtrer celler gjennom 35 μm filter deksel strømningsrør.
  10. Kjør prøver på masse flowcytometer og Hent data. Dataene vil bli deponert i et Flow flowcytometri standard (FCS) filformat.

8. bearbeiding og analyse av masse flowcytometri datafiler

  1. Normalisere FCS filer. Bruk et gratis program tilgjengelig på https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
  2. Deconvolute Barcoded FCS filer. Skill ut samlet strekkode befolkningen i separate Barcoded filer med et gratis program tilgjengelig på https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
  3. Analyser normalisert FCS filer. Bruk kommersielle21,22 eller freeware programmer (se Web.Stanford.edu/Group/Nolan/Resources.html).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tabell 1 viser forventet celle kapasitet og levedyktighet fra voksen mus øret (figur 1) og nyfødt hud under ikke-patologiske tilstander. Tabellen viser også representative data for dyr fra en blandet C57/126 bakgrunn. Det er forventet at huden av andre stammer vil resultere i tilsvarende celle gir og viabilities. Den omtrentlige avkastningen er avhengig av hudens overflateareal og indikerer at nyfødt hud vil være et bedre valg for eksperimenter som krever større antall celler (tabell 1). Lav avkastning eller redusert levedyktighet (< 50%) ville indikere problemer med fordøyelsen eller eksperimentelle forhold som reduserer hudens integritet eller indusere av celle død. Dyrking celler med egnede medier og kosttilskudd kan bidra til å vurdere kvaliteten på KC forberedelser17.

Etter normalisering20 og deconvulation18 av FCS filer, vil gating av data definere epidermal celle populasjoner av interesse og DEMARK individuelle celle syklus faser (figur 2). I bivariate tomter sammenligne 191ir vs 193IR-kanaler, kan intakte celler være gated i øvre høyre kvadrant (figur 2a). Plotting hendelsen lengde vs 191IR og velge for en stram klynge av celler i nærheten av 191IR akse demarks enkeltceller. Levedyktige celler er valgt i en tomt på 195Pt vs 193IR plot ved gating for celler med lav 195PT nivåer. Prøven vist i figur 2a har rusk og økt tilstedeværelse av Cisplatin merket ikke-levedyktige celler. Dette kan tyde på at prøven var over-fordøyd, hardt håndtert, eller venstre på isen eller RT for lenge før farging for masse flowcytometri. Profiler fra vev-kultivert celler vanligvis gir høyere prosenter av 195PT negative celler (figur 2b). Alternativt kan tilstedeværelsen av 195PT positive celler forventes hvis induksjon cellen død er en funksjon av den eksperimentelle modellen og/eller forhold.

Ideelt sett bør markører som definerer befolkningen av interesse inkluderes i analysen av bestemte celletyper. For eksempel, immunceller som forventes å være til stede i rå KC suspensjoner kan oppdages ved tilsetning av en CD4523 antistoff, som oppdager blodkreft celler (figur 2C). Når det gjelder spredningen av antistoff panel13, løser plotting IDU vs CYCLIN B1 celle syklus faser (figur 2C) som ligner på standard BrdU/PI Flow plot (figur 2D), noe som åpner for påvisning av S-Phase, G0/G1 og G2/M celle Befolkninger. I forhold til pHH3, identifiserer høy pHH3 positivitet M fase celler. Til slutt, gating G0/G1 celler på høy pRB signal kan skille G0 (Quiescent) fra celler i G1 (figur 2C, venstre de fleste panel).

Etter å ha identifisert de forskjellige celle syklus fasene, er det da mulig å konstruere en grafisk representasjon av celle syklus profiler for ulike celletyper eller eksperimentelle forhold. For eksempel oppstår forskjellige celle syklus profiler når man sammenligner CD45-vs CD45 + celle populasjoner (figur 3a) i KC-fjæringen vist i figur 2. Som forventet hyperplastisk KCs funnet i CD45-gruppen hadde færre celler i G0 og flere celler i S, G2 og M faser3. I kontrast, immunceller fra samme prøve hadde bemerkelsesverdige populasjoner i G0 og G1. I tillegg til celle syklus profiler, er karakterisering av genuttrykk i en celle syklus avhengig måte også mulig. For eksempel ble fosfat proteiner som bidrar til å definere EGFR-og mTOR/PI3K-signalering, analysert i dataene som ble presentert for figur 3a. Analyse av G1 faser av CD45-vs CD45 + celler avslørte en lignende profil for EGFR og mTOR/PI3K signalering proteiner, selv om det syntes å være små forskjeller i prosentandelen av pS6 og pEGFR positive celler (figur 3b). Lignende tilnærminger kan tilpasses til å karakterisere uttrykk for andre signalering veien proteiner eller cellulære prosesser på ulike faser av celle syklus.

Figure 1
Figur 1 : Utarbeidelse av musen øret huden for fordøyelsen. (A) først, Fjern øret fra dyret og Legg flatt på en ren Petri parabolen. (B) grip den ene siden av øret på enten midten eller kanten ved hjelp av buet presisjon tang. (C) Vend over og bruke et annet par tang og forsiktig trekke halvdelene av øret fra hverandre til øret tårer på press. (D) Fortsett å trekke til sidene er adskilt i to halvdeler. (E) float øre halvdelene på dissosiasjon Media med dermis side berøre løsningen. Scale bar = 2 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Gating strategi for masse flowcytometri data. Dataene i dette tallet ble generert fra en eksperimentell dyr behandlet med phorbol Ester TPA som tidligere beskrevet3. TPA er en PKC aktivator som induserer hud betennelse24. (A) panelene viser den første gating strategien etter normalisering og deconvolution av Barcoded data. Av gating på hendelsen lengde, 191ir,193IR, og 195PT kanaler, er det mulig å velge for intakt, singel, og levedyktige celler. (B) Human SCC SRB-P93 celler behandles med DMSO og ble deretter farget for masse flowcytometri. Data var gated som i (A) og plottet viser nivåene av levende celler i dette utvalget. (C) inkludering av avstamning markører tillater valg av celle populasjoner av interesse. For dette eksempelet, levedyktige celler fra (A) var gated på hendelsen lengde g. CD45 å utelukke blodkreft celler. Gating CD45-celler for innlemmelse av IdU vs CYCLIN B1 tillater identifisering av S, G0/G1 og G2/M celle populasjoner. Valg av pHH3 høye celler definerer M-fase, mens analysen av G0/G1 for pRB identifiserer celler i G1. (D) plottet viser representative resultatene av celle syklus analyse ved påvisning av BrdU INNLEMMELSE og PI (DNA-innhold) med fluorescens flyt flowcytometri. Dataene som vises er fra humant Colo163 SCC celler vokst med BrdU for 1 h som tidligere beskrevet3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Karakterisering av celle syklus profiler og fase spesifikke protein uttrykk. (A) celle syklus profilene ble bestemt i prøven fra figur 2 for CD45-vs CD45 + celler. (B) analyse av G1-fasene med fosfat-spesifikke ANTISTOFFER i CD45-(oransje) og CD45 + (blå) celler avslørte lignende uttrykks profiler for MARKØRER for EGFR-og MTOR/PI3K-signaler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Vev Området Celle kapasitet Levedyktighet
Mus øret 225-230 mm3 1-2x106 70-90 prosent
Nyfødt hud 1000-1100 mm3 5-10x106 80-99 prosent

Tabell 1: typisk celle gir og levedyktighet fra voksen mus øret og nyfødt hud. Celle tellinger og levedyktighet ved Trypan blå eksklusjon var gjennomsnitt fra øre KCs høstet fra n = 7 8-10 uke gamle voksen mus ører eller n = 7 P3 nyfødt skins.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som er skissert i denne utredningen kan gjennomføres i ca 8 h. Sluttresultatet er en suspensjon av celler beriket i KCs som kan analyseres for protein uttrykk i en celle syklus-avhengig måte. Flere tidligere studier har skissert metoder for å isolere KCs fra menneske og mus Skin16,25. Disse studiene inkluderer også protokoller for isolering av KCs for Flow flowcytometri26. Imidlertid har en detaljert protokoll ikke blitt tidligere beskrevet som kombinerer isolering av KCs med analyse av protein uttrykk og celle syklus dynamikk ved hjelp av masse flowcytometri.

Den største hinder for å oppnå høy kvalitet resultater i denne protokollen er kvaliteten på levende celler som brukes. I litteraturen, de foreslåtte forhold og enzymer for epidermis/dermis separasjon varierer sterkt16,25,26,27. Men, det er derfor anbefalt å holde tiden for fordøyelsen av huden til kortest mulig varighet som tillater effektiv separasjon av epidermis fra dermis. Denne protokollen presenterer fordøyelsen med dispase og type IV kollagenase som tillater facile separasjon av både øre og mus nyfødt hud innen 1 time. Dette resulterer i tilstrekkelig celle gir med høy celle levedyktighet. En annen faktor som kan påvirke kvaliteten på cellene er plasseringen av huden valgt for fordøyelsen. Det antas at KCs oppfører seg på samme måte fra ulike anatomiske steder i kroppen. Imidlertid kan huden på forskjellige steder har ulike egenskaper og stilk cellen sammensetning28,29. Likevel er bruken av nyfødt og øre hud3,30 foretrukket fordi isolering av KCs er vanskeligere fra områder av huden med en høy tetthet av hårsekkene (f. eks, rygg hud). En høyere grad av manipulasjon eller vev dissosiasjon kan være nødvendig for effektiv isolering av KCs fra hårete områder av musen26. De eksperimentelle forhold før isolering av KCs kan også påvirke kvaliteten på isolerte celler. Hudlesjoner eller tilstander som påvirker hudbarriere eller hudens integritet kan redusere separasjon av epidermis fra dermis. Dette kan resultere i redusert avkastning av levedyktige celler eller økt forurensning av ikke-KC celler (f. eks, immunceller). Til slutt, isolerte KCs er mottakelige for klumper. De kan også miste celle levedyktighet hvis igjen for lenge på isen eller på RT før behandling for masse flowcytometri eller andre enkelt celleanalyser.

Farge metoden for masse flowcytometri ligner den som brukes for fluorescens Flow flowcytometri men med viktige forskjeller. For eksempel oppnås påvisning av DNA-replikering ved direkte påvisning av IdU i stedet for ved bruk av antistoffer mot nukleotid analogs som BrdU. Direkte påvisning av sprøyte behandling forenkler identifisering av S-fase celler, ettersom antistoff deteksjon av BrdU kan være en involvert prosedyre. En annen forskjell er bruken av Cisplatin for diskriminering av døde og levende celler. Cisplatin fortrinnsvis merker døde celler. Dette trinnet er lik bruken av PI eller andre flekker for døde/Live FACS eksperimenter. Den Cisplatin farging trinn er viktig fordi døde celler kan binde antistoffer og dermed generere falske positive signaler. Mass flowcytometri bruker også antistoffer for å oppdage uttrykket av fase-spesifikke markør i stedet for å måle DNA-innhold. Dette gjør det mulig for facile diskriminering av individuelle celle syklus faser. Endelig, massen flowcytometri data (FCS) filer må bli normalisert ved hjelp av topp i kalibrering perler på grunn av prøven signal forverring over tid i CyTOF instrumentet under samme kjøre og mellom kjører.

Farging, datainnhenting, og analyse for Mass flowcytometri har blitt godt gjennomgått av nyere publikasjoner14,15. Anvendelsen av denne teknologien til analyse av blodkreft og immunceller er godt dokumentert. Dette er tydelig av en stor samling av kommersielt tilgjengelige metall-merkede antistoffer og overvekt av uimottakelig-relaterte publikasjoner ved hjelp av denne teknologien. Den umiddelbare anvendelsen av masse flowcytometri i huden ville være for analyse av immunceller. Dette er spesielt relevant for mus hud modeller i sykdommer som kreft der betennelsen har en viktig rolle. For ikke-immune celle analyse kan mangelen på kommersielt tilgjengelige metall-kodede antistoffer være en hindring. Fordelen med kommersielle reagenser er at de kan brukes uten betydelig optimalisering som ville være tilfelle for i huset metall-kodede antistoffer. Det er imidlertid metall-kodede antistoffer mot brukte fluorescerende koder (f. eks FITC, PE, og APC) som ville tillate en eksperimentator å legge til flere markører til sine flekker panel. Denne løsningen kan også brukes på analyse av hudceller i ulike arter der det kan være et begrenset antall kommersielle metall-merkede antistoffer som viser reaktivitet over arter. Ikke desto mindre, denne måte å klare det på likeledes behøver en i tillegg flekk steg etter det Cisplatin farging og noe optimering. En ytterligere vurdering for å bygge en vellykket panel er diskutert i litteraturen14. En annen ulempe med masse flowcytometri er at datainnsamling effektiviteten av masse cytometers kan være 40-60% av input celle nummer. Som sådan, analyse av sjeldne celle populasjoner (f. eks stamceller) fra bulk prøver kan kreve et større antall celler, pooling av prøver for effektiv deteksjon, eller andre tilnærminger for å berike cellen befolkning av interesse før farging for masse flowcytometri 24.

Mass flowcytometri er en kraftig ny teknologi som bruker vil fortsette å vokse. For tiden er anvendelsen av denne teknologien fokusert på bruk av metall-kodede antistoffer, men det ble nylig utvidet for påvisning av mRNA31. Videre er det potensialet for merking andre cellulære komponenter eller metabolitter med metall koder, noe som vil utvide omfanget av programmet for masse flowcytometri i huden og andre vev fra mus, menneske og andre arter. Oppsummert kan denne protokollen deretter forlenge eksperimentelle verktøy tilgjengelig for huden biologer å relatere KC protein uttrykk i de ulike celle syklus faser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Støtte for dette arbeidet kom fra Department of Dermatology, den Gates Center for regenererende medisin ved University of Colorado og University of Colorado (UC) Skin sykdom Center morfologi og bestemmelse av fenotype Cores (NIAMS P30 AR057212). Forfatterne erkjenner UC Cancer Center Flow flowcytometri delt ressurs og støtte stipend (NCI P30 CA046934) for driften av massen flowcytometer og er takknemlige for Karen Helm og Christine Childs i kjernen for deres ekspertråd om flyt og masse analytiske Teknikker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Cell Treat 229512
Intercalator solution Fluidigm 201192A 125 µM - Ir intercalator solution
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4 16 %  PFA
Strainer cap flow tubes Fisher/Corning 352235 35 µm pore size 
Cell sieve Fisher 22363547 40 μm pore size 
Cell detatchment solution CELLnTEC CnT-ACCUTASE-100 Accutase
Iodine Solution ThermoFisher/Purdue 67618-151-17 Betadine 7.5%-iodine surgical scrub
Barcode permeabilization buffer  Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Barcodes Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH strips EMD 9590 colorpHast
DMEM Hyclone SH30022.01 Dulbecco’s Modified Eagle Media
Fine forceps Dumont & Fils 0109-5-PO Dumostar #5
Curved precision forceps Dumont & Fils 0109-7-PO Dumostar #7
Calibration Beads Fluidigm 201078 EQ Four Element Calibration Beads
HBSS Gibco 14175-095 Hank's Balanced Salt Solution
Water Fisher SH30538.03 Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine  Sigma I7125 IdU
Cryo vials ThermoFisher 366656PK internal thread
Cell Staining buffer Fluidigm 201068 Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Perm buffer Fluidigm 201067 Maxpar Fix & Perm buffer
Fix I buffer Fluidigm 201065 Maxpar Fix I buffer
Phosphate buffered saline Rockland MB-008 Metal free 10x PBS
isopropanol-freezing container ThermoFisher 5100-0001 Mr.Frosty
Sodium hydroxide Fisher BP359-500 NaOH
Petri dish Kord-Valmark 2900 Supplied by Genesee 32-107 
15 mL conical Olympus/Genesee 28-101
50 mL conical Olympus/Genesee 28-106
6-well plate Cell Treat 229506
Cisplatin Sigma 479306
Dispase II Sigma/Roche 4942078001
DMSO Sigma D2650
FBS Atlanta Biologicals S11150
Hydrochloric acid Fisher A144-212
Nuclear Antigen Staining  permeabilization buffer Fluidigm 201063
Nuclear Antigen Staining buffer Fluidigm 201063
Trypan blue Sigma T8154
Tuberculin syringe BD 309626
Type IV Collagenase  Worthington Bioscience CLSS-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  8. Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
  9. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  10. Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
  12. http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
  13. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  14. Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
  15. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
  16. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  17. Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
  18. Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  19. Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
  20. Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  21. http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
  22. http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
  23. Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
  24. Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
  25. Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
  26. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  27. Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  28. Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
  29. Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
  30. Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
  31. Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).

Tags

Utviklingsbiologi celle syklus epidermis Skin Keratinocyte isolasjon Mouse modeller Mass flowcytometri spredning korrelasjon av protein uttrykk enkelt celle analyse
Isolasjon og farging av mus Skin keratinocytter for celle syklus spesifikk analyse av Cellular protein uttrykk ved Mass flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez, J., Torchia, E. C.… More

Fernandez, J., Torchia, E. C. Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59353, doi:10.3791/59353 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter