Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering og farvning af mus hud keratinocytter for celle cyklus specifik analyse af cellulært protein ekspression ved Massecytometri

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59353
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man isolerer hudens keratinocytter fra musemodeller, til farvning med metal mærkede antistoffer, og til at analysere farvede celler ved massecytometri for at profilere udtryks mønstret af proteiner af interesse i de forskellige celle cyklus faser.

Abstract

Målet med denne protokol er at detektere og kvantificere ændringer i protein ekspression i en celle cyklus-afhængig måde ved hjælp af enkeltceller isoleret fra epidermis af mus hud. Der er syv vigtige trin: adskillelse af epidermis fra dermis, fordøjelsen af epidermis, farvning af epidermal cellepopulationer med Cisplatin, prøve barkodning, farvning med metal mærkede antistoffer for celle cyklus markører og proteiner af interesse, påvisning af metal mærkede antistoffer ved massecytometri og analyse af ekspression i de forskellige celle cyklus faser. Fordelen ved denne tilgang over histologiske metoder er potentialet til at assay udtryks mønsteret af > 40 forskellige markører i en enkelt celle i forskellige faser af cellecyklussen. Denne fremgangsmåde giver også mulighed for multivariat korrelationsanalyse af protein ekspression, der er mere kvantificerbare end histologiske/billedbehandlings metoder. Ulempen ved denne protokol er, at en suspension af enkeltceller er nødvendig, hvilket resulterer i tab af lokaliseringsoplysninger fra farvning af vævs sektioner. Denne fremgangsmåde kan også kræve medtagelse af yderligere markører for at identificere forskellige celletyper i rå celle suspensioner. Anvendelsen af denne protokol er tydelig i analysen af hyperplastiske hudsygdoms modeller. Desuden kan denne protokol tilpasses til analyse af specifikke undertyper af celler (f. eks. stamceller) ved tilsætning af Lineage specifikke antistoffer. Denne protokol kan også tilpasses til analyse af hudceller i andre forsøgs arter.

Introduction

Korrelation af genekspression med celle cyklus faser er fortsat en udfordring i analysen af dyremodeller af hyperplastiske sygdomme som kræft. En del af denne udfordring er co-påvisning af proteiner af interesse (POI) med markører for spredning. Proliferative celler kan findes i forskellige celle cyklus faser herunder G1, S, G2, og M. Ki67 er en af de mest almindeligt anvendte markører for spredning og udtrykkes i alle faser af cellen cyklus. Det er blevet flittigt anvendt i analysen af både humane og mus væv1,2,3. Men ligesom andre generelle spredning markører, Ki67 ikke skelne individuelle celle cyklus faser. En mere præcis tilgang bruger inkorporering af thymidinnukleotid analogerne som bromodeoxyuridine (brdu) i celler, der aktivt Repliker deres genomet (dvs. S-fase)4,5. En ulempe ved brugen af nukleotidanaloner er behovet for at administrere dem til levende dyr timer før analyse. Ki67 og BrdU er almindeligt detekteret på faste vævs sektioner ved brug af antistoffer. En fordel ved denne fremgangsmåde er, at placeringen af POI'er kan fastslås inden for vævs arkitekturen (f. eks. det basale lag hud epidermis). Denne fremgangsmåde kræver heller ikke vævs dissociation, der kan føre til ændringer i genekspression. En ulempe er, at vævs fiksering eller behandling af vævet til OLT-frosset eller paraffin-skæring kan medføre antistofmål (dvs. antigener). Genfinding af antigener kræver typisk varme-eller vævs fordøjelse. Kvantificering af farvnings intensiteter kan også være udfordrende. Dette skyldes variationer i farvning, snittykkelse, signaldetektering, og eksperimententer bias. Desuden kan et begrænset antal markører detekteres samtidigt i de fleste typiske laboratorie opsætninger. Endnu, nyere multiplex farvning tilgange lover at overvinde disse begrænsninger; Eksempler herpå er billedbehandlings massecytometri og tyramid-signal forstærkning6,7.

Flow cytometri er en anden kraftfuld teknologi til at detektere prolifererende celler. Det giver mulighed for multiplex påvisning af markører i de samme celler, men kræver vævs dissociation for de fleste ikke-hæmatopoietiske celletyper. Analyse af prolifererende celler sker rutinemæssigt ved brug af farvestoffer, der binder DNA (f. eks Propidium iodide (PI))8. Flowcytometri giver også mulighed for en mere præcis bestemmelse af celle cyklus faser, når det kombineres med påvisning af BrdU inkorporering9. Selv om en stærk tilgang, brdu/pi flow flowcytometri har sine ulemper. Det er ikke i stand til at løse de G2/M og G0/G1 faser uden inddragelse af fase-specifikke antistoffer. Antallet af antistoffer, der kan anvendes, er dog begrænset af cellulær autofluorescens, spektral afsmittende virkninger af fluoroforet-emissioner og brug af kompensations kontrol. Denne begrænsning Marcus det mere udfordrende og omstændelig at co-detektere udtrykket af celle cyklus markører med POI'er. En mere facile tilgang er at bruge massecytometri10,11. Denne teknologi bruger metal konjugeret antistoffer, der har en smallere detekterings spektrum. Når cellerne er plettet med metal mærkede antistoffer, er de fordampet, og metallerne detekteres ved flowcytometri Time-of-Flight (cytof) massespektrometri. På grund af disse egenskaber muliggør massecytometri multiplex-detektion af > 40 forskellige markører ved hjælp af eksisterende platforme10,11. Desuden er det muligt at stregkode prøver med metaller, der resulterer i besparelser af dyrebare antistoffer og samtidig reducere prøve-til-prøve farvning variation. På den anden side har masse cytometri flere ulemper. Der er et begrænset antal kommercielt tilgængelige metal mærkede antistoffer for ikke-blod afledte celler. Kvantificering af DNA-indholdet er mindre følsomt sammenlignet med brugen af fluorescerende DNA-farvestoffer, og massecytometri har et reduceret dynamisk spektrum af signaldetektering i forhold til fluorescens flow cytometri.

Den protokol, der er beskrevet her, er designet til at analysere celle cyklus dynamik fra nyligt isolerede keratinocytter (KCs) fra mus hud og karakterisere celle cyklus specifikke protein udtryk i disse celler ved hjælp af massecytometri. Denne protokol kan også bruges med dyrkede celler eller tilpasset andre celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

University of Colorado Anschutz Medical campus ' institutionelle Dyrebehandlings-og anvendelses udvalg godkendte de dyreforsøg, der er beskrevet i denne protokol.

1. præparater

  1. Design en metal-Tagged antistof panel. Brug den gratis online panel design software12 og omfatter 127iododeoxyuridine (IDU), 164dy (dysprosium) mærket anti-CCNB1 (cyclin B1), 175Lu (lutetium) fosfo enheder (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), og 150 ND (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA proteinSer807/811 (prb)13. Tilføj yderligere metal mærkede antistoffer, der ikke overlapper hinanden i deres kanal signal14.
  2. Forbered en IdU-stamopløsning. IdU-pulveret opløses ved 10 mg/mL i 0,1 N NaOH ved 60 °C. Aliquot IdU stamopløsning til mikrocentrifuge glas og fryse ved-20 °C ved langtidsopbevaring.
    1. PH-værdien af IdU-opløsningen justeres til 7,5 med 12 N HCl umiddelbart før brug. Test med en pH-strimmel på en alikvot for at sikre, at opløsningen er på pH 7,5.
      Bemærk: forlænget tid (> 5 min) af IdU ved pH 7,5 vil resultere i nedbør og en frisk alikvot af IdU er nødvendig, når dette sker.
    2. Brug passende personlige værnemidler (f. eks. handsker, laboratorie beklædning og sikkerhedsbriller), og Arbejd i et sikkerhedskabinet, når du håndterer NaOH-eller HCl-opløsninger.
  3. Forbered en 2x PARAFORMALDEHYD (PFA) fikserings løsning. 5 mL 10x PBS (pH 7,5) og 1 mL 16% PFA kombineres med 44 mL ren molekyl grad dH2O (3,2% slutkoncentration).
    NOTE: en bestand af PFA kan tilberedes som tidligere offentliggjort15 eller købe 16% bestande fri for kontaminerende metaller.
    1. Brug passende personlige værnemidler og Arbejd i et sikkerhedskabinet, når du håndterer PFA-pulver og-opløsninger.
  4. Lav barium (BA2 +) gratis 1x PBS ved at kombinere 5 ml metalfri 10X PBS (pH 7,5) med 45 ml ren molekyl klasse DH2O.
    Bemærk: kvaliteten af PBS og andre reagenser er meget vigtig for at undgå kontaminerende metaller, der kan introducere baggrundsstøj under analyse af masse cytometriske data.
  5. Forbered en 100 mM Cisplatin stamopløsning. 300,5 mg Cisplatin pulver opløses i 10 mL DMSO. Opbevares i aliquoter ved-80 °C. Forbered en 10 mM Cisplatin arbejdsopløsning til forsøg, der skal anvendes over 1 d.
  6. Forbered epidermis/dermis separations løsninger. Forbered en 20x dispase stamopløsning ved at opløse 30 mg i 1 mL HBSS eller PBS. Filter steriliserer gennem et 0,22 μm filter og opbevares i aliquoter ved-20 °C. Forbered en 1x type IV kollagenase stamopløsning ved 1 mg/mL i HBSS, Filtrer sterilisering gennem et 0,22 μm filter, og opbevar aliquoter ved-20 °C.

2. mærkning af S fase ved IdU inkorporering

  1. Veje mus. Brug P1-P3 neonatal pup eller 8-10 uger gamle voksne mus og brug mandlige eller hunmus fra en C57BL/6, FvB eller 129 baggrunde. Bestem en dosis ved 0,1 mg IdU (pH 7.5)/g legemsvægt. For eksempel kræver en 25 g mus 0,25 mL IdU.
  2. Du bør administrere dosis af IdU ved en intraperitoneal injektion og vente i 2 timer, før du høster celler. Brug en tuberkulin sprøjte til at injicere neonatal unger.
    Bemærk: en dosis på 2 mg/mL IdU kan anvendes med vævskultur celler med en 1 h inkubation ved 37 °C før høst og mærkning for masse cytometri.

3. isolering af celler til mærkning

  1. Thaw dispase og kollagenase stamopløsninger. 20x dispase stamopløsningen fortyndes til 1x (1,5 mg/mL) i steril HBSS eller PBS. Opbevares på is, indtil de er klar til brug.
  2. Kombiner 2 volumener af dispase med 1 volumen af kollagenase i et samlet volumen, der gør det muligt for huden at flyde frit. For eksempel kan fordøjelsen af 5 neonatal muse skind fleres på 8 mL 1x dispase med 4 mL kollagenase i en 100 mm Petri skål.
  3. Følg godkendte metoder til at aflive eksperimentelle mus (f. eks isofluran overdosering/tå knivspids kontrol eller co2 indånding/cervikal dislokation). Rengør den voksne øre hud med en jod opløsning (Se tabel over materialer) og skyl med sterilt vand, når isolerede celler skal anvendes til vævskultur.
  4. Kirurgisk fjernelse af øret ved foden (figur 1a). Skyl ørerne i sterile PBS, når isolerede celler skal bruges til vævskultur. Placer på en tør 100 mm Petri skål.
  5. Adskil forsigtigt forreste fra posterior hud ved først at oprette en lomme i midten eller kanten af klippeområdet ved hjælp af fine pincet og trække de to hudflapper fra hinanden ( figur 1b-D). Fortsæt med både forreste og posterior skind.
    Bemærk: detaljerede instruktioner til dissekere neonatal muse skind leveres af litchi et al.16 desuden kan anvendelsen af et dissekerings område medvirke til adskillelse af forreste fra posterior hud og identifikation af epidermis/dermal sider af dissekeret hud: hår er synlig på epidermis side mens dermis vil have en gelatinøse udseende.
  6. Placer forsigtigt de forreste og bageste skind i øret med dermis-siden af huden, som rører ved opløsningen af dispase/kollagenase ( figur 1E). Brug 1 ml til både forreste og posterior hud i et enkelt øre pr. brønd af en 12 brønd kultur plade. Inkuber ved 37 °C i 1 time. Alternativt flyde skind på 1x dispase opløsning ved 4 °C for 16-18 h.3
    Bemærk: Arbejd i en vævskultur hætte med steril teknik, når cellerne skal dyrkes.
  7. Placer den fordøjelige hud med epidermis-siden, der rører overfladen af en ren Petri skål. Udfladér huden og skub forsigtigt dermis ud af epidermis ved at arbejde fra centrum til kanterne i et cirkulært mønster.
  8. Kassér dermis eller fordøje den yderligere for at befri fibroblaster for vævskultur eller analyse16.
    Bemærk: dermis vil være mørkere i udseende og have en gelatinøse og klæbrig sammensætning. Dermis skal nemt komme ud. Svigt eller besvær med at fjerne dermis tyder på utilstrækkelig vævs fordøjelse. Forlænget inkubation i fordøjelses bufferen vil dog reducere cellernes levedygtighed. Epidermis vil forblive på Petri skålen og vil have en bleget udseende.
  9. Løft forsigtigt epidermis af ved at snuppe kanterne og skræl det af overfladen af Petri skålen. Placer forsigtigt epidermis på den præ-varmede celle løsning (Se tabel over materialer) i 5 min ved 37 °c eller 20 min ved rt. Brug 500 μl af cellen løsrivelse løsning til 2 voksne øre epidermises per brønd af en 12 brønd kultur plade og bruge 750 μl af celle løsrivelse opløsning til en enkelt neonatal epidermis pr. brønd af en 6 brønd kultur plade.
  10. Tag fat i epidermis ved hjælp af sterile pincet og skrub ved at trække epidermis mod bunden af skålen for at adskille cellerne. Der tilsættes 1 mL DMEM indeholdende 1% FBS (0,01 mL) og passerer gennem en 40 μm celle sigte ind i en opsamlings slange. Skyl godt med yderligere 2 mL DMEM, og tilsæt cellesuspensionen.
  11. Centrifuge ved 120 x g i 5 min. Aspirér supernatanten forsigtigt.
  12. Resuspension af celle pellet i 1-2 mL DMEM indeholdende 1% FBS. Bestem cellen og% live celletal ved hjælp af Trypan Blue og et hemocytometer eller automatiseret tælle anordning. Pellet celler som beskrevet i trin 3,11.
    Bemærk: cellerne kan dyrkes i passende vævskultur medier efter trin 3,12. 17

4. Cisplatin mærkning for at bestemme levende/døde celler

  1. Resuspension 1-3 x 106 celler pr 1 ml DMEM indeholdende 25 μM cisplatin (2,5 μl af bestanden/ml). Inkubér i 1 min. og sluk ved pipettering med et tilsvarende volumen af FBS (f. eks. 1 mL).
  2. Centrifugeres ved 120 x g i 5 min. decant supernatanten i et bægerglas, der indeholder fortyndet blegemiddel og invertsukker, for at tømme den resterende opløsning på et papirhåndklæde. Tap forsigtigt for at frigøre opløsningen tilbage på pellet og sidevæg af røret.
  3. Resuspension af celle pellet i 2 mL BA+ 2-fri PBS. Pellet celler som beskrevet i trin 4,2.
    Bemærk: det anbefales at reparere celler, hvis de ikke kan farves med det samme.

5. fiksering af Cisplatin-mærkede celler (valgfrit)

  1. Resuspension 1-3 x 106 Cisplatin mærkede celler i 1 ml BA+ 2-fri PBS. Vortex-celler under kontinuerlig lav effekt og tilsæt dråbevis 1 ml (1 volumen) af 2x PFA fikserings buffer. Inkuber i RT i 10 minutter på en gynge platform.
  2. Pellet celler som beskrevet i trin 4,2, men centrifugeres ved 500 x g i 5 min.
  3. Vask celler med 2 mL BA+ 2-frie PBS-og pellet celler som beskrevet i trin 5,2. Gentag trin 5,3 én gang.
  4. Resuspension af pellet i 2 mL BA+ 2-fri PBS. Opbevares ved 4 °C for < 3 d. Tilsæt FBS til 3% (f. eks. 0,3 mL FBS/mL celler) af det totale volumen, hvis det opbevares længere > 3 d, og bland og fryse ved-80 °C.
    Bemærk: fiksering kan påvirke påvisning af visse epitoper. Virkningerne af fiksering på antistof-signalet skal bestemmes empirisk.

6. barkodning af prøver (valgfrit, men anbefalet)

  1. Pellet celler som beskrevet i trin 5,2 og derefter resuspendere 1-3 x 106 celler i 1 ml 1X fikserings buffer (Se tabel over materialer). Der inkubates i RT i 10 min. pellet celler som beskrevet i trin 5,2.
  2. Vask celler med 1 mL stregkode permeabiliserings buffer (Se tabel over materialer). Pellet celler som beskrevet i trin 5,2. Gentag trin 6,2 én gang.
  3. Tilsæt 100 μL stregkode permeabiliserings buffer til stregkoder (Se tabel over materialer)18 og bland straks, mens cellerne fra trin 6,2 er pelletering.
  4. Resuspendér celle pellet i 800 μL stregkode permeabiliserings buffer. Tilføj stregkode løsning til celler, bland og Inkuber ved RT i 30 min. pellet celler som beskrevet i trin 5,2. Vask cellerne i 2 mL celle farvnings buffer (Se tabel over materialer) og pellet igen.
    Bemærk: op til 20 prøver kan mærkes med forskellige kombinationer af Palladium metaller18. Andre barkodnings strategier er beskrevet andetsteds15.

7. mærkning af celler til massecytometri

  1. Resuspension 1-3 x 106 celler i 1 ml af nukleare antigen farvnings buffer arbejdsopløsning (Se tabel over materialer). Kombiner prøverne i et enkelt rør for efterfølgende trin, når du bruger barkodede prøver. Der inkubates på RT i 30 min. pellet som beskrevet i trin 5,2.
  2. Resuspension 1-3 x 106 celler i 2 ml nukleare antigen farvning permeabilization buffer (Se tabel over materialer). Skala som nødvendigt. Brug for eksempel 6 mL buffer til 10 kombinerede prøver med et celletal på 9 x 106 celler. Pellet som beskrevet i trin 5,2.
  3. Gentag trin 7,2. Hvirvel forsigtigt celle pellet i den resterende mængde tilbage i røret.
  4. Tilsæt 50 μL intracellulær antistof cocktail pr. 1-3 x 106 celler. Skala som nødvendigt. Brug for eksempel 150 μL af antistof-cocktailen til 10 kombinerede prøver med et celletal på 9 x 106 celler. Bland og Inkuber ved RT i 45 min. Tilsæt 2 mL celle farvnings buffer og pellet som beskrevet i trin 5,2.
  5. Resuspension 1-3 x 106 celler pellet i 2 ml celle farvnings buffer. Pellet celler som beskrevet i trin 5,2. Gentag trin 7,5 én gang.
    Bemærk: andre bufferopløsninger kan bruges til farvning af ekstracellulær membran eller cytoplasmiske markører, og eksperimententer kan være nødt til at optimere farvning, hvis der er behov for at detektere epitoper i forskellige cellulære steder. Celler kan også rettes i PFA efter trin 7,5, når der bruges levende celler til farvning.
  6. Resuspension 1-3 x 106 celler i 1 ml interkalation opløsning og opbevares for 1-3 d ved 4 °c.
    1. Cellerne opbevares ved-80 °C i DMSO, som indeholder opløsningen til > 3 d. pellet celler som beskrevet i trin 5,2, hvis cellerne er i interkalationsvæske. Der opslæmmes pellet (1-3 x 106 celler) i 1 ml celle farvnings buffer og pellet celler som beskrevet i trin 5,2. Opstil pellet i 1 mL 10% DMSO/90% FBS19, Overfør til en cryovial, Placer i en isopropanol-fryse beholder, og opbevar ved-80 °c.
  7. Pellet celler som beskrevet i trin 5,2. Vask 1-3 x 106 celler med 2 ml celle farvnings buffer, pelleterings som beskrevet i trin 5,2. Udfør to ekstra skyller med 2 mL vand, pelleterings som beskrevet i trin 5,2.
  8. Fortyndet EQ kalibrering perler 1:9 i vand (stamopløsning på 3,3 x 105 perler/ml).
  9. Resuspension celle pellet i en koncentration på 1 x 106 celler/ml med fortyndet EQ perle opløsning. Filtrer cellerne gennem 35 μm si Cap flow-rør.
  10. Køreprøver på masse flowcytometer og erhverve data. Data vil blive deponeret i et flow cytometry standard (FCS) filformat.

8. behandling og analyse af massecytometri-datafiler

  1. Normaliser FCS-filer. Brug et gratis program til rådighed på https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
  2. Devolute Barcoded FCS filer. Adskille den samlede stregkode population i separate barkodede filer med et gratis program, der findes på https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
  3. Analysér normaliserede FCS-filer. Brug kommercielle21,22 eller freeware programmer (Se web.Stanford.edu/Group/Nolan/Resources.html).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tabel 1 viser de forventede celle udbytter og levedygtighed fra voksne mus øre (figur 1) og neonatal hud under ikke-patologiske forhold. Tabellen viser også repræsentative data for dyr fra en blandet C57/126 baggrund. Det forventes, at huden af andre stammer ville resultere i lignende celle udbytter og viabilities. Det omtrentlige udbytte afhænger af hudens overfladeareal og indikerer, at neonatal hud ville være et bedre valg til eksperimenter, der kræver et større antal celler (tabel 1). Lavt udbytte eller nedsat levedygtighed (< 50%) ville indikere problemer med fordøjelse eller eksperimentelle forhold, der reducerer hudens integritet eller inducerer celledød. Culturing celler med passende medier og kosttilskud kan hjælpe med at vurdere kvaliteten af KC præparater17.

Efter normalisering20 og devulation18 af FCS filer, gating af data vil definere epidermal cellepopulationer af interesse og Demark individuelle celle cyklus faser (figur 2). I bivariate plots sammenligne 191ir vs 193IR kanaler, kan intakte celler være gated i øverste højre kvadrant (figur 2a). Plotting Event længde vs 191IR og vælge for en stram klynge af celler nær 191IR-aksen demarks enkeltceller. Levedygtige celler er valgt i et plot af 195pt vs 193IR plot ved gating for celler med lav 195PT niveauer. Prøven vist i figur 2a har snavs og øget forekomst af Cisplatin mærket ikke-levedygtige celler. Dette kan indikere, at prøven var over-fordøjet, hårdt håndteret, eller efterladt på is eller RT for længe før farvning for masse cytometri. Profiler fra væv-dyrkede celler typisk give højere procenter af 195PT negative celler (figur 2b). Alternativt kan tilstedeværelsen af 195PT positive celler forventes, hvis induktions celledød er en funktion af den eksperimentelle model og/eller betingelser.

Ideelt set bør markører, der definerer populationspopulationen, inkluderes i analysen af specifikke celletyper. For eksempel, immunceller, der forventes at være til stede i rå KC suspensioner kan påvises ved tilsætning af en CD4523 antistof, som detekterer hæmatopoietiske celler (figur 2c). Med hensyn til proliferation-antistof-panelet13, løser plotte Idu vs cyclin B1 celle cyklus faser (figur 2c) svarende til standard brdu/pi flow plot (figur 2D), der giver mulighed for påvisning af S-fase, G0/G1 og G2/M celle Befolkninger. I IdU vs pHH3 plots identificerer høj pHH3 positivitet M-fase celler. Endelig, gating G0/G1 celler på højt pRB signal kan skelne G0 (quiescent) fra celler i G1 (figur 2c, venstre mest panel).

Efter at have identificeret de forskellige celle cyklus faser, er det så muligt at konstruere en grafisk gengivelse af celle cyklus profiler til forskellige celletyper eller eksperimentelle betingelser. For eksempel opstår særskilte celle cyklus profiler ved sammenligning af CD45-vs CD45 + cellepopulationer (figur 3a) i KC-suspensionen vist i figur 2. Som forventet havde hyperplastiske Kc'er fundet i CD45-gruppen færre celler i G0 og flere celler i S-, G2-og M-faserne3. I modsætning hertil havde immunceller fra samme prøve bemærkelsesværdige populationer i G0 og G1. Ud over celle cyklus profiler, karakterisering af genekspression i en celle cyklus-afhængige måde er også muligt. For eksempel, fosfo enheder proteiner, der hjælper definere EGFR og MTOR/PI3K signalering blev analyseret i de data, præsenteret for figur 3a. Analyse af G1-faserne af CD45-vs CD45 +-celler afslørede en lignende profil for EGFR-og mTOR/PI3K-signalerings proteiner, selv om der syntes at være små forskelle i procentdelen af pS6 og pEGFR positive celler (figur 3b). Lignende tilgange kan tilpasses til at karakterisere ekspression af andre signalering pathway proteiner eller cellulære processer i forskellige faser af cellecyklussen.

Figure 1
Figur 1 : Fremstilling af mus øre hud til fordøjelse. (A) først fjernes øret fra dyret og lægges fladt på en ren Petri skål. (B) tag fat i den ene side af øret ved enten midten eller kanten ved hjælp af buede præcisions tang. (C) flip over og bruge et andet par tang og forsigtigt trække halvdele af øret fra hinanden, indtil øret tårer på krølle. (D) Fortsæt med at trække, indtil siderne adskilles i to halvdele. (E) flyde ørehalverne på dissociations mediet med dermis-siden, som rører ved opløsningen. Scale bar = 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Gating strategi for massecytometri data. Dataene i dette tal blev genereret fra et forsøgsdyr behandlet med phorbols ester TPA som tidligere beskrevet3. TPA er en PKC aktivator, der inducerer hudbetændelse24. A) panelerne viser den oprindelige gating-strategi efter normalisering og dekoncentrering af barkodede data. Ved at gating på Event længde, 191ir,193IR, og 195PT kanaler, er det muligt at vælge for intakt, enkelt, og levedygtige celler. (B) humane SCC SRB-P93 celler behandlet med DMSO og blev derefter plettet til massecytometri. Data blev gated som i (A) og plottet viser niveauerne af levende celler i denne prøve. (C) medtagelse af Lineage markører giver mulighed for udvælgelse af cellepopulationer af interesse. For dette eksempel, levedygtige celler fra (A) blev gated på hændelses længde vs. CD45 at udelukke hæmatopoietiske celler. Gating CD45-celler til inkorporering af IdU vs CYCLIN B1 gør det muligt at identificere S, G0/G1, og G2/M cellepopulationer. Udvælgelse af pHH3 høje celler definerer M fase, mens analysen af G0/G1 for pRB positivitet identificerer celler i G1. D) observationsområdet viser de repræsentative resultater af celle cyklus analysen ved påvisning af brdu inkorporering og PI (DNA-indhold) med fluorescens baseret flow cytometri. De viste data er fra humane Colo163 SCC celler dyrket med brdu for 1 h som tidligere beskrevet3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Karakterisering af celle cyklus profiler og fase-specifikke protein udtryk. A) celle cyklus profilerne blev fastlagt i prøven fra figur 2 for CD45-vs CD45 +-celler. B) analyse af G1-faserne med phospho-specifikke antistoffer i CD45-(orange) og CD45 + (blå) celler afslørede lignende udtryks profiler for markører for EGFR-og MTOR/PI3K-signalerings veje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Væv Område Celle ydelse Levedygtighed
Mus øre 225-230 mm3 1-2x106 70-90%
Neonatal hud 1000-1100 mm3 5-10x106 80-99%

Tabel 1: typiske celle udbytter og levedygtighed fra voksne mus øre og neonatal hud. Celletal og levedygtighed ved Trypan blå udelukkelse blev gennemsnitligt fra øre KCs høstet fra n = 7 8-10 uge gamle voksne mus ører eller n = 7 P3 neonatal skind.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen, der er skitseret i dette dokument, kan udfyldes i ca. 8 timer. Slutresultatet er en suspension af celler beriget i KCs, der kan analyseres for protein ekspression i en celle cyklus-afhængig måde. Flere tidligere undersøgelser har skitseret metoder til at isolere KCS fra menneske og mus hud16,25. Disse undersøgelser omfatter også protokoller for isolering af KCs til strømnings cytometri26. Der er imidlertid ikke tidligere beskrevet en detaljeret protokol, som kombinerer isoleringen af KCs med analysen af protein ekspression og celle cyklus dynamik ved hjælp af massecytometri.

Den største forhindring for at opnå resultater af høj kvalitet i denne protokol er kvaliteten af de levende celler, der anvendes. I litteraturen varierer de foreslåede betingelser og enzymer for epidermis/dermis separation meget16,25,26,27. Men, det anbefales derfor at holde tiden for fordøjelsen af huden til den kortest mulige varighed, der giver mulighed for effektiv adskillelse af epidermis fra dermis. Denne protokol præsenterer fordøjelsen med dispase og type IV kollagenase, der tillader facile adskillelse af både øre og mus neonatal hud inden for 1 time. Dette resulterer i tilstrækkelige celle udbytter med høj cellelevedygtighed. En anden faktor, der kan påvirke kvaliteten af celler er placeringen af huden valgt til fordøjelsen. Det forudsættes, at KCs opfører sig på samme måde fra forskellige anatomiske steder i kroppen. Men, huden på forskellige steder kan have forskellige egenskaber og stamcelle sammensætning28,29. Ikke desto mindre foretrækkes brug af neonatal og ørehuden3,30 , fordi isoleringen af KCS er vanskeligere fra hudområder med en høj tæthed af hårsækkene (f. eks. ryghud). En højere grad af manipulation eller vævs dissociation kan være nødvendig for effektiv isolering af KCs fra behårede områder af musen26. Forsøgsbetingelserne før isolering af KCs kan også påvirke kvaliteten af isolerede celler. Hudlæsioner eller tilstande, der påvirker hudbarrieren eller hudens integritet, kan reducere udskillelsen af epidermis fra dermis. Dette kan resultere i reducerede udbytter af levedygtige celler eller øget kontaminering af ikke-KC-celler (f. eks. immunceller). Endelig er isolerede Kc'er modtagelige for clumping. De kan også miste cellelevedygtighed, hvis de lades for længe på is eller ved RT før behandling for masse cytometri eller andre enkelt celle analyser.

Farvnings metoden for massecytometri svarer til den, der anvendes til fluorescens flow cytometri, men med væsentlige forskelle. For eksempel opnås påvisning af DNA-replikering ved direkte påvisning af IdU i stedet for ved brug af antistoffer mod nukleotidanalogere som BrdU. Direkte påvisning af IdU forenkler identifikationen af S-fase celler betydeligt, da antistof detektering af BrdU kan være en involveret procedure. En anden forskel er brugen af Cisplatin til diskrimination af døde og levende celler. Cisplatin fortrinsvis etiketter døde celler. Dette trin svarer til brugen af PI eller andre pletter til døde/levende FACS eksperimenter. Cisplatin farvnings trinnet er vigtigt, fordi døde celler kan binde antistoffer og derved generere falske positive signaler. Massecytometri bruger også antistoffer til at detektere ekspression af fase specifik markør i stedet for måling af DNA-indhold. Dette giver mulighed for facile diskrimination af individuelle celle cyklus faser. Endelig skal de massecytometri data (FCS)-filer normaliseres ved hjælp af spidsen i kalibrerings perlerne på grund af, at prøvesignalet forringes over tid i CyTOF-instrumentet under samme kørsel og mellem kørsler.

Farvning, dataindsamling og analyse for massecytometri er blevet godt gennemgået af de seneste publikationer14,15. Anvendelsen af denne teknologi til analyse af hæmatopoietiske og immunceller er veldokumenteret. Dette fremgår af en stor samling af kommercielt tilgængelige metal mærkede antistoffer og over vægten af immunrelaterede publikationer ved hjælp af denne teknologi. Øjeblikkelig anvendelse af masse cytometri i huden ville være til analyse af immunceller. Dette er især relevant for muse hudmodeller i sygdomme som kræft, hvor inflammation har en vigtig rolle. For ikke-immuncelle analyse kan manglen på kommercielt tilgængelige metal mærkede antistoffer være en hindring. Fordelen ved kommercielle reagenser er, at de kan anvendes uden betydelig optimering, som det ville være tilfældet for in House metal-mærkede antistoffer. Der er dog metal mærkede antistoffer mod almindeligt anvendte fluorescerende Tags (fx FITC, PE og APC), som ville tillade en eksperimentel at tilføje yderligere markører til deres farvnings panel. Denne løsning kan også anvendes til analyse af hudceller i forskellige arter, hvor der kan være et begrænset antal kommercielle metal mærkede antistoffer, der viser reaktivitet på tværs af arter. Ikke desto mindre, denne løsning kræver også en yderligere farvnings trin efter Cisplatin farvning og nogle optimering. En yderligere overvejelse for opbygningen af et vellykket panel diskuteres i litteraturen14. En anden ulempe ved masse cytometri er, at dataindsamlingen effektivitet af masse cytometre kan være 40-60% af Inputcelle nummer. Som sådan kan analysen af sjældne cellepopulationer (f. eks. stamceller) fra bulkprøver kræve et større antal celler, samleprøver til effektiv påvisning eller andre tilgange til at berige celle populationen af interesse forud for farvning for masse cytometri 24.

Masse cytometri er en kraftfuld ny teknologi, hvis anvendelse vil fortsætte med at vokse. I øjeblikket er anvendelsen af denne teknologi fokuseret på brugen af metal-mærkede antistoffer, men det blev for nylig forlænget til påvisning af mRNA31. Desuden er der potentiale for mærkning andre cellulære komponenter eller metabolitter med metal Tags, som ville udvide anvendelsesområdet for masse cytometri i huden og andre væv fra mus, menneskelige og andre arter. Sammenfattende kan denne protokol udvide de eksperimentelle værktøjer til rådighed for huden biologer til at korrelere KC protein udtryk i de forskellige celle cyklus faser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Støtte til dette arbejde kom fra Department of Dermatology, Gates Center for regenerativ medicin på University of Colorado og University of Colorado (UC) hudsygdom Center morfologi og Phenotyping kerner (NIAMS P30 AR057212). Forfatterne anerkender UC Cancer Center flow cytometry Shared Resource og support Grant (NCI P30 CA046934) for driften af Mass flowcytometer og er taknemmelig for Karen Helm og Christine Childs i kernen for deres ekspertrådgivning om flow og masse cytometriske Teknikker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Cell Treat 229512
Intercalator solution Fluidigm 201192A 125 µM - Ir intercalator solution
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4 16 %  PFA
Strainer cap flow tubes Fisher/Corning 352235 35 µm pore size 
Cell sieve Fisher 22363547 40 μm pore size 
Cell detatchment solution CELLnTEC CnT-ACCUTASE-100 Accutase
Iodine Solution ThermoFisher/Purdue 67618-151-17 Betadine 7.5%-iodine surgical scrub
Barcode permeabilization buffer  Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Barcodes Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH strips EMD 9590 colorpHast
DMEM Hyclone SH30022.01 Dulbecco’s Modified Eagle Media
Fine forceps Dumont & Fils 0109-5-PO Dumostar #5
Curved precision forceps Dumont & Fils 0109-7-PO Dumostar #7
Calibration Beads Fluidigm 201078 EQ Four Element Calibration Beads
HBSS Gibco 14175-095 Hank's Balanced Salt Solution
Water Fisher SH30538.03 Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine  Sigma I7125 IdU
Cryo vials ThermoFisher 366656PK internal thread
Cell Staining buffer Fluidigm 201068 Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Perm buffer Fluidigm 201067 Maxpar Fix & Perm buffer
Fix I buffer Fluidigm 201065 Maxpar Fix I buffer
Phosphate buffered saline Rockland MB-008 Metal free 10x PBS
isopropanol-freezing container ThermoFisher 5100-0001 Mr.Frosty
Sodium hydroxide Fisher BP359-500 NaOH
Petri dish Kord-Valmark 2900 Supplied by Genesee 32-107 
15 mL conical Olympus/Genesee 28-101
50 mL conical Olympus/Genesee 28-106
6-well plate Cell Treat 229506
Cisplatin Sigma 479306
Dispase II Sigma/Roche 4942078001
DMSO Sigma D2650
FBS Atlanta Biologicals S11150
Hydrochloric acid Fisher A144-212
Nuclear Antigen Staining  permeabilization buffer Fluidigm 201063
Nuclear Antigen Staining buffer Fluidigm 201063
Trypan blue Sigma T8154
Tuberculin syringe BD 309626
Type IV Collagenase  Worthington Bioscience CLSS-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  8. Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
  9. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  10. Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
  12. http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
  13. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  14. Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
  15. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
  16. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  17. Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
  18. Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  19. Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
  20. Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  21. http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
  22. http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
  23. Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
  24. Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
  25. Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
  26. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  27. Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  28. Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
  29. Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
  30. Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
  31. Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).

Tags

Udviklingsmæssige biologi celle cyklus epidermis hud Keratinocyte isolation musemodeller Massecytometri proliferation korrelation af protein ekspression enkelt celle analyse
Isolering og farvning af mus hud keratinocytter for celle cyklus specifik analyse af cellulært protein ekspression ved Massecytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez, J., Torchia, E. C.… More

Fernandez, J., Torchia, E. C. Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59353, doi:10.3791/59353 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter