Summary
Detta protokoll beskriver hur man isolerar hudkeratinocyter från musmodeller, för att färga med metallmärkta antikroppar, och för att analysera färgade celler av masscytometri för att profilera uttrycksmönstret av proteiner av intresse i de olika cell cykel faserna.
Abstract
Målet med detta protokoll är att upptäcka och kvantifiera protein uttrycks förändringar i en cell cykel beroende sätt med hjälp av enstaka celler isolerade från epidermis av mus huden. Det finns sju viktiga steg: separation av epidermis från dermis, nedbrytning av epidermis, färgning av epidermal cellpopulationer med cisplatin, prov barkodning, färgning med metall märkta antikroppar för cell cykel markörer och proteiner av intresse, detektering av metallmärkta antikroppar av masscytometri, och analys av uttrycket i de olika cellcykeln faser. Fördelen med denna metod över histologiska metoder är potentialen att assay uttrycksmönstret av > 40 olika markörer i en enda cell i olika faser av cellcykeln. Denna metod möjliggör också för multivariat korrelation analys av proteinuttryck som är mer kvantifierbar än histologiska/Imaging metoder. Nackdelen med detta protokoll är att en suspension av enstaka celler behövs, vilket resulterar i förlust av lokaliseringsinformation från färgning av vävnad sektioner. Denna metod kan också kräva införande av ytterligare markörer för att identifiera olika celltyper i rå cellsuspensioner. Tillämpningen av detta protokoll är uppenbar i analysen av hyperplastiska hud sjukdomsmodeller. Dessutom kan detta protokoll anpassas för analys av specifika subtyper av celler (t. ex. stamceller) genom tillsats av härstamning-specifika antikroppar. Detta protokoll kan också anpassas för analys av hudceller i andra försöks arter.
Introduction
Korrelation av genuttryck med cell cykel stadier är fortfarande en utmaning i analysen av djurmodeller av hyperplastiska sjukdomar som cancer. En del av denna utmaning är CO-detektion av proteiner av intresse (POI) med markörer för spridning. Proliferativa celler kan hittas i olika cell cykel faser inklusive G1, S, G2, och M. Ki67 är en av de mest använda markörer för spridning och uttrycks i alla faser av cellcykeln. Det har använts i stor utsträckning i analysen av både mänskliga och mus vävnader1,2,3. Men liksom andra allmänna spridnings markörer, Ki67 inte urskilja enskilda cellcykeln faser. En mer exakt metod använder införlivandet av tymidin nukleotid analoger som bromodeoxyuridine (BrdU) i celler som aktivt replikerar deras arvsmassa (dvs. S-fas)4,5. En nackdel med användningen av nukleotidanaloger är behovet av att administrera dem till levande djur timmar före analys. Ki67 och BrdU upptäcks vanligen på fasta vävnad sektioner genom användning av antikroppar. En fördel med detta tillvägagångssätt är att placeringen av intressepunkter kan fastställas inom vävnads uppbyggnad (t. ex. det basala lagret av hud epidermis). Denna metod kräver inte heller vävnads dissociation som kan leda till förändringar i genuttryck. En nackdel är att vävnaden fixering eller bearbetning av vävnaden för OCT fryst eller paraffin snittning kan ockludera antikropps mål (dvs, antigener). Hämtning av antigener kräver normalt värme eller vävnadsnedbrytning. Kvantifiering av Färgnings intensiteter kan också vara utmanande. Detta beror på variationer i färgning, snittjocklek, signaldetektering och försöksledaren bias. Dessutom kan ett begränsat antal markörer upptäckas samtidigt i de flesta typiska laboratorie uppställningar. Ännu nyare multiplex färgning metoder lovar att övervinna dessa begränsningar; exempel är bildmascytometry och tyramid signalamplifiering6,7.
Flow flödescytometrianalys är en annan kraftfull teknik för att upptäcka prolifererande celler. Det möjliggör multiplex detektion av markörer i samma celler men kräver vävnads dissociation för de flesta icke-hematopoietiska celltyper. Analys av prolifererande celler görs rutinmässigt genom användning av färgämnen som binder DNA (t. ex. Propidium Iodide (PI))8. Flödescytometri medger också en mer exakt bestämning av cellcykelns faser i kombination med detektion av BrdU-inkorporering9. Även om en kraftfull metod, har BrdU/PI Flow flödescytometrianalys sina nackdelar. Det är oförmögen att lösa de G2/M och G0/G1 faser utan införandet av fas-specifika antikroppar. Antalet antikroppar som kan användas begränsas dock av cellulär autofluorescens, spektralspill av fluorophore-utsläpp och användning av kompensationskontroller. Denna begränsning är mer utmanande och mödosam att identifiera uttrycket av cell cykel markörer med POI. En mer facile metod är att använda masscytometry10,11. Denna teknik använder metallkonjugerade antikroppar som har ett smalare detektions spektrum. När celler färgas med metall-märkta antikroppar, de är förgasas, och de metaller som upptäcks av flödescytometrianalys tid-of-Flight (CyTOF) masspektrometri. På grund av dessa egenskaper möjliggör mascytometri multiplex-detektion av > 40 olika markörer som använder befintliga plattformar10,11. Dessutom är det möjligt att streckkods prov med metaller som resulterar i besparingar av värdefulla antikroppar samtidigt minska prov-to-Sample färgning variation. Å andra sidan, masscytometry har flera nackdelar. Det finns ett begränsat antal kommersiellt tillgängliga metallmärkta antikroppar för icke-blodhärledda celler. Kvantifiering av DNA-halten är mindre känslig jämfört med användning av fluorescerande DNA-färgämnen och masscytometri har ett minskat dynamiskt omfång av signaldetektering jämfört med fluorescensflödescytometri.
Det protokoll som beskrivs här var utformat för att analysera cellcykelns dynamik från nyligen isolerade keratinocyter (KCs) från mus huden och karakterisera cellcykelns specifika proteinuttryck i dessa celler med hjälp av masscytometri. Detta protokoll kan också användas med odlade celler eller anpassas till andra celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
University of Colorado Anschutz Medical Campus ' institutionella djuromsorg och användning kommittén godkände djur experiment som beskrivs i detta protokoll.
1. förberedelser
- Designa en metall-märkt antikropp panel. Använd gratis online Panel Design Software12 och inkluderar 127iododeoxyuridine (IDU), 164dy (dysprosium) märkt anti-CCNB1 (Cyclin B1), 175Lu (Lutetium) ämnesomsättningphosphoen (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), och 150 Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA proteinSer807/811 (PRB)13. Lägg till ytterligare metallmärkta antikroppar som inte överlappar varandra i kanalsignalen14.
- Förbered en IdU-lagerlösning. Lös upp IdU-pulvret med 10 mg/mL i 0,1 N NaOH vid 60 ° c. Aliquot IdU stamlösning i mikrocentrifugrör och frys vid-20 ° c för långtidsförvaring.
- Justera pH IdU-lösningen till 7,5 med 12 N HCl omedelbart före användning. Testa med en pH-remsa på en kassera alikvot för att säkerställa att lösningen är pH 7,5.
Anmärkning: förlängd tid (> 5 min) av IdU vid pH 7,5 kommer att resultera i nederbörd och en ny alikvot av IdU behövs när detta händer. - Använd lämplig personlig skyddsutrustning (t. ex. handskar, labbrock och skyddsglasögon) och arbeta i ett säkerhetsskåp vid hantering av NaOH-eller HCl-lösningar.
- Justera pH IdU-lösningen till 7,5 med 12 N HCl omedelbart före användning. Testa med en pH-remsa på en kassera alikvot för att säkerställa att lösningen är pH 7,5.
- Förbered en 2x PARAFORMALDEHYD (PFA) fixerande lösning. Kombinera 5 mL 10X PBS (pH 7,5) och 1 mL 16% PFA med 44 mL ren molekylära grad dH2O (3,2% slutkoncentration).
Obs: ett lager av PFA kan förberedas som tidigare publicerats15 eller köpa 16% bestånd fria från kontaminerande metaller.- Använd lämplig personlig skyddsutrustning och arbeta i ett säkerhetsskåp vid hantering av PFA pulver och lösningar.
- Bered barium (ba2 +) gratis 1x PBS genom att kombinera 5 ml metallfri 10X PBS (pH 7,5) med 45 ml ren molekylära grad DH2O.
Notera: kvaliteten på PBS och andra reagenser är mycket viktigt för att undvika kontaminering av metaller som kan medföra bakgrundsbrus vid analys av masscytometriska data. - Förbered en stamlösning på 100 mM cisplatin. Lös 300,5 mg cisplatin pulver i 10 mL DMSO. Förvaras i alikvoter vid-80 ° c. Bered en 10 mM cisplatin arbetslösning för experiment som ska användas över 1 d.
- Förbered epidermis/dermis separations lösningar. Förbered en 20x dispas stamlösning genom att lösa upp 30 mg i 1 ml Hbss eller PBS. Filtrera sterilisera genom ett 0,22 μm filter och förvara i portioner vid-20 ° c. Förbered en 1x typ IV kollagenase stamlösning på 1 mg/mL i HBSS, filter sterilisera genom ett 0,22 μm filter, och lagra alikvoter vid-20 ° c.
2. märkning av S-fas genom IdU-inkorporering
- Väga möss. Använd P1-P3 neonatal valpar eller 8-10 veckor gamla vuxna möss och använda manliga eller kvinnliga möss från en C57BL/6, FvB eller 129 bakgrunder. Bestäm en dos vid 0,1 mg IdU (pH 7.5)/g kroppsvikt. Till exempel kräver en 25 g mus 0,25 mL IdU.
- Administrera dosen av IdU genom en intraperitoneal injektion och vänta i 2 timmar innan du skördar cellerna. Använd en tuberkulin spruta för att injicera neonatal pups.
Anmärkning: en dos på 2 mg/mL IdU kan användas med vävnadskultur celler med 1 h inkubering vid 37 ° c före skörd och märkning för masscytometri.
3. isolering av celler för märkning
- Tina-och kollagenase-lagerlösningar. Späd 20x dispas stamlösning till 1x (1,5 mg/ml) i steril Hbss eller PBS. Håll på isen tills den är klar att använda.
- Kombinera 2 volymer av dispas med 1 volym kollagenas i en total volym som gör att huden flyter fritt. Till exempel kan nedbrytning av 5 neonatal mus skinn flödas på 8 ml 1x dispas med 4 ml kollagenas i en 100 mm petriskål.
- Följ godkända metoder för att euthanize experimentella möss (t. ex., isofluran överdosering/tå nypa check eller CO2 inandning/cervikal dislokation). Rengör den vuxna öron huden med en jodlösning (se tabell över material) och skölj med sterilt vatten när isolerade celler ska användas för vävnadsodling.
- Ta bort örat vid basen (figur 1a). Skölj öronen i steril PBS när isolerade celler ska användas för vävnadsodling. Placera på en torr 100 mm petriskål.
- Separera försiktigt anterior från bakre huden genom att initialt skapa en ficka i mitten eller kanten av snittet området med hjälp av fina pinken och dra de två flikar huden isär ( figur 1b-D). Fortsätt med både främre och bakre skinn.
Obs: detaljerade instruktioner för att dissekera neonatal mus hud tillhandahålls av litchi et al.16 Dessutom kan användningen av en dissekera omfattning bidra till separation av främre från bakre huden och identifiering av epidermis/dermal sidor av dissekerade hud: hår syns på epidermis sidan medan dermis kommer att ha en gelatinös utseende. - Placera försiktigt främre och bakre skinn av örat med dermis sidan av huden vidrör dispase/kollagenase lösning ( figur 1e). Använd 1 mL för både främre och bakre huden på ett enda öra per brunn av en 12 väl kultur tallrik. Inkubera vid 37 ° c i 1 h. Alternativt flyt skinn på 1x dispas lösning vid 4 ° c för 16-18 h.3
Obs: arbeta i en vävnad kultur huva med steril teknik när celler ska odlas. - Placera den smälta huden med epidermis sidan vidrör ytan av en ren petriskål. Platta ut huden och försiktigt glida dermis från epidermis genom att arbeta från mitten till kanterna i ett cirkulärt mönster.
- Kassera dermis eller smälta det ytterligare att befria fibroblaster för vävnadsodling eller analys16.
Obs: dermis kommer att vara mörkare i utseende och har en gelatinös och klibbiga komposition. Dermis bör lätt lossas. Misslyckande eller svårighet att ta bort dermis tyder otillräcklig vävnad matsmältningen. Emellertid, förlängd inkubering i rötnings buffert kommer att minska cellernas lönsamhet. Epidermis kommer att finnas kvar på petriskål och kommer att ha en blekt utseende. - Försiktigt lyfta av epidermis genom att gripa tag i kanterna och skala bort ytan av petriskål. Placera försiktigt epidermis på förvärmda cell avskiljande lösning (se tabell över material) i 5 min vid 37 ° c eller 20 min vid RT. Använd 500 μl cell avskiljande lösning för 2 vuxna öron epidermiser per brunn av en 12 brunn kultur tallrik och Använd 750 μl cell avlossning lösning för en enda neonatal epidermis per brunn av en 6 väl kultur tallrik.
- Ta tag i epidermis med sterila pinproppar och skrubba genom att dra epidermis mot botten av skålen för att separera celler. Tillsätt 1 mL DMEM innehållande 1% FBS (0,01 mL) och passera genom en cell sikt på 40 μm till ett uppsamlings rör. Skölj väl med ytterligare 2 mL DMEM och tillsätt i cellsuspensionen.
- Centrifugera vid 120 x g i 5 min. Aspirera supernatanten noggrant.
- Omsuspendera cellpelleten i 1-2 mL DMEM innehållande 1% FBS. Bestäm cell-och% Live-cellräkningar med Trypan Blue och en hemocytometern eller automatiserad räkneenhet. Pellets celler enligt beskrivningen i steg 3,11.
ANMÄRKNINGAR: celler kan odlas i lämpliga vävnads odlingsmedier efter steg 3,12. 17
4. cisplatin märkning för att bestämma levande/döda celler
- Omsuspendera 1-3 x 106 celler per 1 ml DMEM innehållande 25 μm cisplatin (2,5 μl av beståndet/ml). Inkubera i 1 min och släcka genom pipettering med en lika mängd FBS (t. ex. 1 mL).
- Centrifugera vid 120 x g i 5 min. Dekantera supernatanten i en bägare som innehåller utspädda blekmedel och invertrör för att dränera kvarvarande lösning på en pappershandduk. Knacka försiktigt för att frigöra lösning kvar på pellets och sidovägg av röret.
- Omsuspendera cellpelleten i 2 mL BA+ 2-fri PBS. Pellets celler enligt beskrivningen i steg 4,2.
Anmärkning: det rekommenderas att fastställa celler om de inte kan färgas omedelbart.
5. fixering av cisplatin-märkta celler (tillval)
- Omsuspendera 1-3 x 106 cisplatin-märkta celler i 1 ml BA+ 2-fri PBS. Vortex celler under kontinuerlig låg effekt och tillsätt droppvis 1 ml (1 volym) av 2x PFA fixeringsbuffert. Inkubera vid RT i 10 minuter på en gungande plattform.
- Pellets celler enligt beskrivningen i steg 4,2, men Centrifugera vid 500 x g i 5 min.
- Tvätta celler med 2 mL BA+ 2-fria PBS-och pelletceller enligt beskrivningen i steg 5,2. Upprepa steg 5,3 en gång.
- Omsuspendera pelleten i 2 mL BA+ 2-fri PBS. Förvaras vid 4 ° c i < 3 d. Tillsätt FBS till 3% (t. ex. 0,3 mL FBS/mL celler) av den totala volymen om lagringen varar längre > 3 d, blanda sedan och frys vid-80 ° c.
Observera: fixering kan påverka detekteringen av vissa epitoper. Effekterna av fixering på antikropps signalen måste bestämmas empiriskt.
6. barkodning av prover (valfritt men rekommenderas)
- Pellets celler enligt beskrivningen i steg 5,2 och sedan Omsuspendera 1-3 x 106 celler i 1 ml 1x fixeringsbuffert (se tabell över material). Inkubera vid RT för 10 min. pellets celler enligt beskrivningen i steg 5,2.
- Tvätta celler med 1 ml streckkod depolarisering buffert (se tabell över material). Pellets celler enligt beskrivningen i steg 5,2. Upprepa steg 6,2 en gång.
- Tillsätt 100 μl streckkod depolarisering buffert till streckkoder (se tabell över material)18 och blanda omedelbart medan cellerna från steg 6,2 pelletering.
- Omsuspendera cellpelleten i 800 μL streckkods permeabiliseringsbuffert. Lägg till streckkodslösning i celler, blanda och inkubera vid RT i 30 min. pellets celler enligt beskrivningen i steg 5,2. Tvätta celler i 2 mL Cellfärgningsbuffert (se tabell över material) och pellets igen.
Obs: upp till 20 prover kan märkas med olika kombinationer av Palladium metaller18. Andra barkodnings strategier beskrivs på annat håll15.
7. märkning av celler för masscytometri
- Omsuspendera 1-3 x 106 celler i 1 ml nukleär antigen Färgnings buffert arbetslösning (se tabell över material). Kombinera prover i ett enda rör för efterföljande steg när du använder barkodade prover. Inkubera vid RT i 30 min. pellet enligt beskrivningen i steg 5,2.
- Omsuspendera 1-3 x 106 celler i 2 ml nukleär antigen färgning permeabiliseringsbuffert (se tabell över material). Skala efter behov. Använd till exempel 6 mL buffert för 10 kombinerade prover med ett cellantal på 9 x 106 celler. Pelleten enligt beskrivningen i steg 5,2.
- Upprepa steg 7,2. Skaka försiktigt cellpelleten i den resterande volymen kvar i röret.
- Tillsätt 50 μL intracellulär antikropps cocktail per 1-3 x 106 celler. Skala efter behov. Använd till exempel 150 μL av antikropps cocktail för 10 kombinerade prover med ett cellantal på 9 x 106 celler. Blanda och inkubera vid RT för 45 min. Tillsätt 2 mL Cellfärgningsbuffert och pellet enligt beskrivningen i steg 5,2.
- Omsuspendera 1-3 x 106 celler pellet i 2 ml cellfärgningsbuffert. Pellets celler enligt beskrivningen i steg 5,2. Upprepa steg 7,5 en gång.
Obs: andra buffertlösningar kan användas för färgning extracellulära membran eller cytoplasmiska markörer och försöksledaren kan behöva optimera färgning om det finns ett behov av att upptäcka epitoper i olika cellulära platser. Celler kan också korrigeras i PFA efter steg 7,5 när du använder levande celler för färgning. - Omsuspendera 1-3 x 106 celler i 1 ml interkaleringslösning och förvara för 1-3 d vid 4 ° c.
- Lagra celler vid-80 ° c i DMSO som innehåller lösningen för > 3 d. pellets celler enligt beskrivningen i steg 5,2 om celler är i interkalation lösning. Omsuspendera pelleten (1-3 x 106 celler) i 1 ml cellfärgningsbuffert och pellets celler enligt beskrivningen i steg 5,2. Omsuspendera pelleten i 1 mL 10% DMSO/90% FBS19, överför till en kryovial, placera den i en isopropanol-frysnings behållare och förvara vid-80 ° c.
- Pellets celler enligt beskrivningen i steg 5,2. Tvätta 1-3 x 106 celler med 2 ml cellfärgningsbuffert, pelletering enligt beskrivningen i steg 5,2. Utför ytterligare två tvättar med 2 mL vatten, pelletering enligt beskrivningen i steg 5,2.
- Späd EQ kalibrerings pärlor 1:9 i vatten (stamlösning på 3,3 x 105 pärlor/ml).
- Omsuspendera cellpelleten vid en koncentration av 1 x 106 celler/ml med utspädd EQ-pärllösning. Filtrera celler genom 35 μm SIL Cap Flow rör.
- Kör prover på massan flödescytometerns och hämta data. Data kommer att deponeras i ett Flow Cytometry standard (FCS) filformat.
8. bearbetning och analys av masscytometry datafiler
- Normalisera FCS-filer. Använd ett gratis program som finns på https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
- Deconvolute Barcoded FCS filer. Separera den poolade streckkods populationen i separata barkodade filer med ett gratis program som finns på https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
- Analysera normaliserade FCS-filer. Använd kommersiella21,22 eller freeware program (se Web.Stanford.edu/Group/Nolan/Resources.html).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 1 visar förväntad cell avkastning och livskraft från vuxet mus öra (figur 1) och neonatal hud under icke-patologiska tillstånd. Tabellen visar också representativa uppgifter om djur från en blandad C57/126 bakgrund. Det förväntas att huden på andra stammar skulle resultera i liknande cell utbyten och viabilities. Den ungefärliga avkastningen är beroende av hudens yta och indikerar att neonatal hud skulle vara ett bättre val för experiment som kräver ett större antal celler (tabell 1). Låg avkastning eller minskad lönsamhet (< 50%) skulle indikera problem med matsmältningen eller experimentella förhållanden som minskar hudens integritet eller inducerar celldöd. Odling celler med lämpliga medier och kosttillskott kan bidra till att bedöma kvaliteten på KC preparat17.
Efter normalisering20 och deconvulation18 av FCS filer, gating av data kommer att definiera epidermal cellpopulationer av intresse och Demark individuella cellcykeln faser (figur 2). I bivariat tomter som jämför 191ir vs 193IR-kanaler, kan intakt celler vara gated i den övre högra kvadranten (figur 2A). Plottning händelse längd vs 191IR och välja för ett tätt kluster av celler nära 191IR-axeln avmarkeras enstaka celler. Livskraftiga celler väljs i en tomt på 195pt vs 193IR Plot av gating för celler med låga 195PT nivåer. Provet som visas i figur 2A har skräp och ökad förekomst av cisplatin märkta icke-viabla celler. Detta kan tyda på att provet var översmält, hårt hanterat eller lämnat på is eller RT för länge före färgning för masscytometri. Profiler från vävnads-odlade celler ger vanligtvis högre procentsatser av 195PT negativa celler (figur 2b). Alternativt, närvaron av 195PT positiva celler kan förväntas om induktion celldöd är ett inslag i den experimentella modellen och/eller villkor.
Helst bör markörer som definierar populationen av intresse inkluderas i analysen av specifika celltyper. Till exempel, immunceller som förväntas vara närvarande i rå KC suspensioner kan upptäckas genom tillsats av en CD4523 antikropp, som detekterar hematopoietiska celler (figur 2C). När det gäller spridningen av antikroppar13, plottning IDU vs Cyclin B1 löser cellcykeln faser (figur 2C) liknar standard BrdU/PI Flow Plot (figur 2D), vilket möjliggör detektion av S-fas, G0/G1 och G2/M cell Befolkningar. I IdU vs pHH3 tomter, hög pHH3 positivitet identifierar M fas celler. Slutligen, gating G0/G1 celler på hög pRB signal kan skilja G0 (quiescent) från celler i G1 (figur 2C, vänster mest panel).
Efter att ha identifierat de olika cell cykel faserna är det möjligt att konstruera en grafisk representation av cell Cykelprofiler för olika celltyper eller experimentella förhållanden. Till exempel uppstår distinkta cell Cykelprofiler när man jämför CD45-vs CD45 + cellpopulationer (figur 3a) i KC-fjädringen som visas i figur 2. Som förväntat hyperplastiska KCs hittades i CD45-gruppen hade färre celler i G0 och fler celler i S, G2, och M faser3. Däremot hade immunceller från samma prov anmärkningsvärda populationer i G0 och G1. Förutom cell Cykelprofiler är karakteriseringen av genuttrycket i ett cell cykel beroende sätt också möjlig. Till exempel analyserades fosho-proteiner som hjälper till att definiera EGFR och mTOR/PI3K-signalering i de data som presenteras för figur 3a. Analys av G1 faser av CD45-vs CD45 + celler avslöjade en liknande profil för EGFR och mTOR/PI3K signalering proteiner, även om det verkade finnas smärre skillnader i procentandelen av pS6 och pEGFR positiva celler (figur 3b). Liknande tillvägagångssätt kan anpassas för att karakterisera uttrycket av andra signalering väg proteiner eller cellulära processer i olika faser av cellcykeln.
Figur 1 : Beredning av mus öra huden för matsmältningen. (A) först, ta bort örat från djuret och låg plant på en ren petriskål. (B) ta tag i ena sidan av örat på antingen mitten eller kanten med böjda precisions tång. (C) vänd över och med hjälp av ett annat par pincett och försiktigt dra halvor av örat isär tills örat tårar på globlinjen. (D) Fortsätt att dra tills sidorna är åtskilda i två halvor. (E) flyta öron halvor på dissociation media med dermis sidan vidrör lösningen. Scale bar = 2 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Gating strategi för masscytometry data. Uppgifterna i denna siffra har genererats från ett försöksdjur som behandlats med phorbol Ester TPA som tidigare beskrivits3. TPA är en PKC Activator som inducerar hudinflammation24. (A) panelerna visar den ursprungliga gating strategi efter normalisering och deconvolution av Barcoded data. Genom att gating på händelse längd, 191ir,193IR och 195PT kanaler, är det möjligt att välja för intakt, enkel och livskraftiga celler. (B) Human SCC SRB-P93 celler behandlade med DMSO och sedan färgas för masscytometry. Data var gated som i (a) och observationsområdet visar nivåerna av levande celler i detta prov. (C) införandet av härstamning markörer möjliggör val av cellpopulationer av intresse. I det här exemplet var livskraftiga celler från (a) gated på händelse längd kontra CD45 att utesluta hematopoietiska celler. Gating CD45-celler för inkorporering av IdU vs CYCLIN B1 gör det möjligt att identifiera S, G0/G1, och G2/M cellpopulationer. Val av pHH3 höga celler definierar M fas, medan analysen av G0/G1 för pRB positivitet identifierar celler i G1. D) observationsområdet visar de representativa resultaten av cell cykel analys genom detektion av BrdU-inkorporering och PI (DNA-innehåll) med fluorescensbaserad flödescytometri. De uppgifter som visas är från Human Colo163 SCC celler odlas med BrdU för 1 h som tidigare beskrivits3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Karaktärisering av cell Cykelprofiler och fasspecifikt proteinuttryck. Acell cykel profilerna fastställdes i urvalet från figur 2 för CD45-vs CD45 + celler. (B) analys av G1 faser med fosforspecifika antikroppar i CD45-(orange) och CD45 + (blå) celler avslöjade liknande uttryck profiler för MARKÖRER för EGFR och mTOR/PI3K signalering vägar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vävnad | Området | Cell utbyte | Livskraft |
| Mus öra | 225-230 mm3 | 1-2x106 | 70-90% |
| Neonatal hud | 1000-1100 mm3 | 5-10x106 | 80-99% |
Tabell 1: typiska cell utbyten och lönsamhet från vuxna mus öron och neonatal hud. Cell antal och lönsamhet genom Trypan blå exkludering var i genomsnitt från öron KCs skördade från n = 7 8-10 veckor gamla vuxna mus öron eller n = 7 P3 neonatal skinn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs i detta dokument kan fyllas i ca 8 h. Slutresultatet är en suspension av celler berikade i KCs som kan analyseras för proteinuttryck i ett cell cykel beroende sätt. Flera tidigare studier har skisserat metoder för att isolera KCS från människa och mus hud16,25. Dessa studier omfattar även protokoll för isolering av KCs för flödescytometri26. Ett detaljerat protokoll har dock inte beskrivits tidigare som kombinerar isolering av KCs med analys av proteinuttryck och cellcykeldynamik med hjälp av masscytometri.
Det största hindret för att få högkvalitativa resultat i detta protokoll är kvaliteten på levande celler som används. I litteraturen, de föreslagna villkor och enzymer för epidermis/dermis separation varierar kraftigt16,25,26,27. Emellertid, det är därför rekommenderas att hålla tiden för nedbrytning av huden till kortast möjliga tid som möjliggör effektiv separation av epidermis från dermis. Detta protokoll presenterar matsmältningen med dispas och typ IV kollagenas som tillåter facile separation av både öra och mus neonatal hud inom 1 h. Detta resulterar i tillräckliga cell utbyten med hög cellviabilitet. En annan faktor som kan påverka kvaliteten på celler är placeringen av huden valts för matsmältningen. Det förutsätts att KCs beter sig på liknande sätt från olika anatomiska platser i kroppen. Men huden på olika platser kan ha olika egenskaper och stamcells sammansättning28,29. Icke desto mindre, användningen av neonatal och öron skinn3,30 är att föredra eftersom isoleringen av KCS är svårare från hudområden med en hög densitet av hårsäckar (t. ex., rygg hud). En högre grad av manipulation eller vävnads dissociation kan krävas för effektiv isolering av KCs från håriga områden av musen26. Försöksbetingelserna före isolering av KCs kan också påverka kvaliteten på isolerade celler. Hudlesioner eller tillstånd som påverkar hudbarriären eller hudens integritet kan minska separationen av epidermis från dermis. Detta kan resultera i minskad avkastning av livskraftiga celler eller ökad kontaminering av icke-KC-celler (t. ex. immunceller). Slutligen, isolerade KCs är mottagliga för klumpar. De kan också förlora cellernas lönsamhet om de lämnas för länge på is eller vid RT före bearbetning för massa flödescytometrianalys eller andra enstaka cell analyser.
Infärgnings metoden för masscytometri liknar den som används för fluorescens flödescytometri men med viktiga skillnader. Till exempel, upptäckten av DNA-replikering åstadkoms genom direkt detektion av IdU i stället för genom användning av antikroppar mot nukleotidanaloger som BrdU. Direkt detektion av IdU förenklar identifieringen av S-Phase-celler, eftersom antikropps detektering av BrdU kan vara ett involverat förfarande. En annan skillnad är användningen av cisplatin för diskriminering av döda och levande celler. Cisplatin etiketter företrädesvis döda celler. Detta steg liknar användningen av PI eller andra fläckar för Dead/Live FACS experiment. Cisplatin-Färgnings steget är viktigt eftersom döda celler kan binda antikroppar och därigenom generera falskt positiva signaler. Masscytometri använder också antikroppar för att detektera uttrycket av fasspecifik markör i stället för att mäta DNA-halten. Detta möjliggör facile diskriminering av enskilda cell cykel faser. Slutligen måste massan flödescytometrianalys data (FCS) filer normaliseras med hjälp av spik i kalibrerings kulor på grund av prov signal försämring över tiden i CyTOF instrumentet under samma körning och mellan körningar.
Färgning, datainsamling och analys för masscytometri har granskats väl av de senaste publikationerna14,15. Tillämpningen av denna teknik för analys av hematopoietiska och immunceller är väl dokumenterad. Detta framgår av en stor samling av kommersiellt tillgängliga metall-märkta antikroppar och dominans av immunrelaterade publikationer med hjälp av denna teknik. Den omedelbara tillämpningen av masscytometry i huden skulle vara för analys av immunceller. Detta är särskilt relevant för mus hud modeller i sjukdomar som cancer där inflammation har en viktig roll. För icke-immun cell analys, avsaknaden av kommersiellt tillgängliga metall-märkta antikroppar kan vara ett hinder. Fördelen med kommersiella reagenser är att de kan användas utan betydande optimering som skulle vara fallet för i hus metall-märkta antikroppar. Det finns dock metall-märkta antikroppar mot vanliga fluorescerande Taggar (t. ex. FITC, PE, och APC) som skulle tillåta en försöksledaren att lägga till ytterligare markörer till deras färgning panel. Denna lösning kan också tillämpas på analys av hudceller i olika arter där det kan finnas ett begränsat antal kommersiella metall-märkta antikroppar som visar reaktivitet mellan arter. Ändå, den här workaround också behöver en i tillägg färgning steg efter den cisplatin infärgning och något Optimization. En ytterligare ersättning för att bygga en lyckad panel diskuteras i litteraturen14. En annan nackdel med masscytometri är att datainsamlings effektiviteten hos masscytometrar kan vara 40-60% av indatacell-numret. Som sådan kan analysen av sällsynta cellpopulationer (t. ex. stamceller) från bulkprover kräva ett större antal celler, sammanslagning av prover för effektiv detektion eller andra metoder för att berika cellpopulationen av intresseföre färgning för masscytometri 24.
Masscytometry är en kraftfull framväxande teknik vars användning kommer att fortsätta att växa. För närvarande är tillämpningen av denna teknik inriktad på användning av metall-märkta antikroppar, men det förlängdes nyligen för detektion av mRNA31. Dessutom, det finns potential att märka andra cellulära komponenter eller metaboliter med metall taggar, vilket skulle utöka utbudet av ansökan om masscytometri i huden och andra vävnader från möss, mänskliga, och andra arter. Sammanfattnings, detta protokoll kan sedan utvidga experimentella verktyg tillgängliga för hudbiologer att korrelera KC proteinuttryck i de olika cellcykeln faser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Stöd för detta arbete kom från Institutionen för dermatologi, Gates Center for regenerativ medicin vid University of Colorado och University of Colorado (UC) hudsjukdom Center morfologi och fenotypning kärnor (NIAMS P30 AR057212). Författarna erkänner UC Cancer Center Flow cytometry delad resurs och stöd bidrag (NCI P30 CA046934) för driften av massan flödescytometerns och är tacksamma för Karen Helm och Christine Childs i centrum för deras expertråd om flöde och massa kors Tekniker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM - Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
- http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
