Summary
Questo protocollo descrive come isolare i cheratinociti cutanei dai modelli murinari, per macchiare con anticorpi con tag metallici e analizzare le cellule colorate per citometria di massa al fine di profilare il modello di espressione delle proteine di interesse nelle diverse fasi del ciclo cellulare.
Abstract
L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare e quantificare i cambiamenti dell'espressione proteica in modo dipendente dal ciclo cellulare utilizzando singole cellule isolate dall'epidermide della pelle del topo. Ci sono sette passi importanti: separazione dell'epidermide dal dermide, digestione dell'epidermide, colorazione delle popolazioni di cellule epidermiche con cisplatina, codice a barre campione, colorazione con anticorpi metallici marcati per marcatori del ciclo cellulare e proteine di l'interesse, la rilevazione di anticorpi con etichettatura metallica mediante citometria di massa e l'analisi dell'espressione nelle varie fasi del ciclo cellulare. Il vantaggio di questo approccio rispetto ai metodi istologici è il potenziale per esaminare il modello di espressione di >40 marcatori diversi in una singola cella in diverse fasi del ciclo cellulare. Questo approccio consente anche l'analisi di correlazione multivariata dell'espressione proteica che è più quantificabile rispetto ai metodi istologici/immagini. Lo svantaggio di questo protocollo è che è necessaria una sospensione di singole cellule, che si traduce nella perdita di informazioni sulla posizione fornite dalla colorazione delle sezioni di tessuto. Questo approccio può anche richiedere l'inclusione di marcatori aggiuntivi per identificare diversi tipi di cellule nelle sospensioni cellulari grezze. L'applicazione di questo protocollo è evidente nell'analisi dei modelli di malattia iperplastica della pelle. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per l'analisi di specifici sottotipi di cellule (ad esempio, cellule staminali) mediante l'aggiunta di anticorpi specifici del lignaggio. Questo protocollo può anche essere adattato per l'analisi delle cellule della pelle in altre specie sperimentali.
Introduction
La correlazione dell'espressione genica con le fasi del ciclo cellulare rimane una sfida nell'analisi di modelli animali di malattie iperplastiche come il cancro. Parte di questa sfida è la coordinazione delle proteine di interesse (POI) con marcatori di proliferazione. Le cellule proliferative possono essere trovate in varie fasi del ciclo cellulare tra cui G1, S, G2 e M. Ki67 è uno dei marcatori più comunemente utilizzati di proliferazione ed è espresso in tutte le fasi del ciclo cellulare. È stato ampiamente utilizzato nell'analisi dei tessuti sia umani che murini1,2,3. Tuttavia, come altri marcatori di proliferazione generale, Ki67 non discerne singole fasi del ciclo cellulare. Un approccio più preciso utilizza l'incorporazione di analoghi nucleotiditici tiofini come Bromodeoxyuridina (BrdU) in cellule che stanno replicando attivamente il loro genoma (cioè, S-fase)4,5. Uno svantaggio dell'uso di analoghi nucleotidi è la necessità di somministrarli agli animali vivi ore prima dell'analisi. Ki67 e BrdU sono comunemente rilevati su sezioni di tessuto fisso dall'uso di anticorpi. Un vantaggio di questo approccio è che la posizione dei POI può essere accertata all'interno dell'architettura dei tessuti (ad esempio, lo strato basale dell'epidermide cutanea). Questo approccio inoltre non richiede la dissociazione dei tessuti che può portare a cambiamenti nell'espressione genica. Uno svantaggio è che la fissazione dei tessuti o l'elaborazione del tessuto per il congelato dello Strumento di personalizzazione di Office o la sezionamento della paraffina possono occludere i bersagli degli anticorpi (ad esempio, gli antigeni). Il recupero degli antigeni richiede in genere la digestione di calore o tessuto. Anche la quantificazione delle intensità di colorazione può essere difficile. Ciò è dovuto alle variazioni nella colorazione, nello spessore della sezione, nel rilevamento del segnale e nella distorsione dello sperimentatore. Inoltre, un numero limitato di marcatori può essere rilevato contemporaneamente nella maggior parte delle configurazioni di laboratorio tipiche. Tuttavia, gli approcci di colorazione multiplex più recenti promettono di superare questi limiti; esempi sono la citometria di massa di imaging e l'amplificazione del segnale Tyramide6,7.
La citometria di flusso è un'altra potente tecnologia per rilevare le cellule che proliferano. Permette il rilevamento multiplex di marcatori nelle stesse cellule, ma richiede la dissociazione dei tessuti per la maggior parte dei tipi di cellule non ematopoietiche. L'analisi delle cellule che proliferano viene eseguita regolarmente mediante l'uso di coloranti che legano il DNA (ad esempio, Propidium Iodide (PI))8. La citometria di flusso permette anche una determinazione più precisa delle fasi del ciclo cellulare quando accoppiato con il rilevamento dell'incorporazione BrdU9. Anche se un approccio potente, la citometria di flusso BrdU/PI ha i suoi svantaggi. Non è in grado di risolvere le fasi G2/M e G0/G1 senza l'inclusione di anticorpi specifici per fase. Tuttavia, il numero di anticorpi che possono essere utilizzati è limitato dall'autofluorescenza cellulare, dalla fuoriuscita spettrale delle emissioni di fluoroforo e dall'uso di controlli di compensazione. Questa limitazione segna più difficile e laborioso rilevare co-rilevare l'espressione dei marcatori del ciclo cellulare con i POI. Un approccio più facile è quello di utilizzare la citometria di massa10,11. Questa tecnologia utilizza anticorpi coniugati in metallo che hanno uno spettro di rilevamento più stretto. Una volta che le cellule sono macchiate con anticorpi marcati metallici, vengono vaporizzate e i metalli rilevati dalla spettrometria di massa del tempo di volo della citometria (CyTOF). A causa di queste proprietà, la citometria di massa consente il rilevamento multiplex di >40 marcatori diversi utilizzando piattaforme esistenti10,11. Inoltre, è possibile codici a barre campioni con metalli che si traducono in risparmio di anticorpi preziosi, riducendo al contempo la variabilità di colorazione da campione a campione. D'altra parte, la citometria di massa ha diversi svantaggi. Ci sono un numero limitato di anticorpi con etichettatura metallica disponibile in commercio per le cellule non derivate dal sangue. La quantificazione del contenuto del DNA è meno sensibile rispetto all'uso di coloranti del DNA fluorescente e la citometria di massa ha una gamma dinamica ridotta di rilevamento del segnale rispetto alla citometria del flusso di fluorescenza.
Il protocollo qui descritto è stato progettato per analizzare la dinamica del ciclo cellulare dai cheratinociti appena isolati (KC) dalla pelle del topo e caratterizzare l'espressione della proteina specifica del ciclo cellulare in queste cellule usando la citometria di massa. Questo protocollo può essere utilizzato anche con cellule coltivate o adattato ad altri tipi di cellule.
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Protocol
Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso del campus medico dell'Università del Colorado ha approvato gli esperimenti sugli animali descritti in questo protocollo.
1. Preparativi
- Progettare un pannello anticorpo con tag metallici. Utilizzare il software di progettazione pannello online gratuito12 e includere 127IododeoxyUridina (IdU), 164Dy (Dysprosium) etichettato anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), e 150 Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA proteinaSer807/811 (pRB)13. Aggiungere altri anticorpi con etichetta metallica che non si sovrappongono nel segnale di canale14.
- Preparare una soluzione stock IdU. Sciogliere la polvere IdU a 10 mg/mL in 0,1 N NaOH a 60 gradi centigradi. Soluzione di stock Aliquot IdU in tubi di microcentrismo e congelare a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
- Regolare il pH della soluzione IdU a 7,5 con 12 N HCl immediatamente prima dell'uso. Testare con una striscia di pH su uno scarto per assicurarsi che la soluzione sia a pH 7.5.
NOTA: Il tempo prolungato (>5 min) di IdU a pH 7.5 comporterà precipitazioni e una nuova aliquota di IdU è necessaria quando questo accade. - Utilizzare adeguate dispositivi di protezione personale (ad esempio, guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza) e lavorare in un armadietto di sicurezza nella movimentazione di soluzioni NaOH o HCl.
- Regolare il pH della soluzione IdU a 7,5 con 12 N HCl immediatamente prima dell'uso. Testare con una striscia di pH su uno scarto per assicurarsi che la soluzione sia a pH 7.5.
- Preparare una soluzione di fissaggio di paraformaldeide 2x (PFA). Combinare 5 mL di 10x PBS (pH 7.5) e 1 mL di 16% PFA con 44 mL di grado molecolare puro dH2O (3,2% concentrazione finale).
NOTA: Uno stock di PFA può essere preparato come pubblicato in precedenza15 o acquistare il 16% di scorte prive di metalli contaminati.- Utilizzare adeguate attrezzature di protezione personale e lavorare in un armadio di sicurezza durante la movimentazione di polvere e soluzioni PFA.
- Preparare il barium (Ba2 )gratuito 1x PBS combinando 5 mL di 10x PBS (pH 7.5) senza metalli con 45 mL di puro grado molecolare dH2O.
NOTA: La qualità di PBS e di altri reagenti è molto importante per evitare di contaminare i metalli che possono introdurre rumore di fondo durante l'analisi dei dati citometrici di massa. - Preparare una soluzione di 100 mm di cisplatina. Sciogliere 300.5 mg di cisplatina polvere in 10 mL di DMSO. Conservare in aliquote a -80 gradi centigradi. Preparare una soluzione di lavoro cisplatina da 10 mM per esperimenti da utilizzare oltre 1 d.
- Preparare soluzioni di separazione epidermide/dermide. Preparare una soluzione di stock 20x dispase sciogliendo 30 mg in 1 mL di HBSS o PBS. Filtrare sterilizzare attraverso un filtro di 0,22 m e conservare in aliquote a -20 gradi centigradi. Preparare una soluzione di brodo di collagenasi di tipo 1x IV a 1 mg/mL in HBSS, filtrare sterilizzare attraverso un filtro da 0,22 m e conservare le aliquote a -20 gradi centigradi.
2. Etichettatura della fase S per incorporazione IdU
- Pesare i topi. Utilizzare p1-P3 cuccioli neooatici o topi adulti di 8-10 settimane e utilizzare topi maschi o femmine da un C57BL/6, FvB, o 129 sfondi. Determinare una dose a 0,1 mg IdU (pH 7.5)/g peso corporeo. Ad esempio, un mouse da 25 g richiede 0,25 mL di IdU.
- Somministrare la dose di IdU mediante un'iniezione intraperitoneale e attendere 2 h prima della raccolta delle cellule. Utilizzare una siringa di tubercolina per iniettare cuccioli neooatali.
NOTA: Una dose di 2 mg/mL di IdU può essere utilizzata con cellule di coltura tissutale con un'incubazione di 1 h a 37 gradi centigradi prima della raccolta e dell'etichettatura per la citometria di massa.
3. Isolamento delle celle per l'etichettatura
- Soluzioni stock disaffetto disaffetto e collagenase. Diluire la soluzione di stock 20x dispase a 1x (1,5 mg/mL) in STERILe HBSS o PBS. Tenere sul ghiaccio fino a quando pronto per l'uso.
- Combina 2 volumi di dispasi con 1 volume di collagene in un volume totale che permette alla pelle di galleggiare liberamente. Ad esempio, la digestione di 5 pelli di topo neonale può essere galleggiata su 8 mL di 1x dispase con 4 mL di collagene in un piatto Petri da 100 mm.
- Seguire i metodi approvati per eutanasia i topi sperimentali (ad esempio, il controllo del sovradosaggio/punta dell'isoflurano o l'inalazione di CO 2/lussazione cervicale). Pulire la pelle dell'orecchio adulto con una soluzione di iodio (vedi Tabella deimateriali) e risciacquare con acqua sterile quando le cellule isolate devono essere utilizzate per la coltura dei tessuti.
- Rimuovere chirurgicamente l'orecchio alla base (Figura 1A). Sciacquare le orecchie in PBS sterile quando le cellule isolate devono essere utilizzate per la coltura dei tessuti. Mettere su una piastra petri secco da 100 mm.
- Separare con cura anteriore dalla pelle posteriore creando inizialmente una tasca al centro o al bordo dell'area di taglio utilizzando pinze sottili e tirando i due lembi della pelle a parte ( Figura 1B-D). Procedere con entrambe le pelli anteriori e posteriori.
NOTA: istruzioni dettagliate per sezionare la pelle di topo neoooattale sono fornite da Litchi et al.16 Inoltre, l'uso di un ambito di dissezione può aiutare nella separazione della pelle anteriore da posteriore e nell'identificazione dei lati epidermis/dermici pelle: i capelli sono visibili sul lato dell'epidermide, mentre il derma avrà un aspetto gelatinoso. - Posizionare con attenzione le pelli anteriori e posteriori dell'orecchio con il lato derma della pelle che tocca la soluzione dispasi/collagenase ( Figura 1E). Utilizzare 1 mL sia per la pelle anteriore che posteriore di un singolo orecchio per pozzo di una piastra di coltura 12 bene. Incubare a 37 oC per 1 h. In alternativa, galleggiare pelli su 1x soluzione dispasi a 4 gradi centigradi per 16-18 h.
NOTA: Lavorare in una cappa di coltura tissutale con tecnica sterile quando le cellule devono essere coltivate. - Posizionare la pelle digerita con il lato dell'epidermide toccando la superficie di un piatto Petri pulito. Appiattire la pelle e far scorrere delicatamente il derisito fuori l'epidermide lavorando dal centro ai bordi in un modello circolare.
- Scartare il derma o digerirlo ulteriormente per liberare i fibroblasti per la coltura o l'analisi dei tessuti16.
NOTA: Il derma sarà più scuro in apparenza e hanno una composizione gelatinosa e appiccicosa. Il derma dovrebbe facilmente staccarsi. Il fallimento o la difficoltà di rimuovere il derma suggerisce una digestione dei tessuti insufficiente. Tuttavia, l'incubazione estesa nel buffer di digestione ridurrà la vitalità cellulare. L'epidermide rimarrà sul piatto Petri e avrà un aspetto sbiancato. - Sollevare delicatamente l'epidermide afferrando i bordi e staccarlo dalla superficie del piatto Petri. Posizionare con attenzione l'epidermide su una soluzione di distacco cellulare preriscaldata (vedere Tabella dei materiali) per 5 min a 37 o 20 min a RT. Utilizzare 500 l di soluzione di distacco cellulare per 2 epidermises dell'orecchio adulto per bene di una piastra di coltura 12 pozzi e utilizzare 750 L di distacco cellulare soluzione per una singola epidermide neooatale per pozzo di un piatto di 6 pozzi.
- Afferrare l'epidermide con pinze sterili e strofinare trascinando l'epidermide contro il fondo del piatto per dissociare le cellule. Aggiungere 1 mL di DMEM contenente l'1% di FBS (0,01 mL) e passare attraverso un setaccio di 40 celle in un tubo di raccolta. Sciacquare bene con altri 2 mL di DMEM e aggiungere alla sospensione cellulare.
- Centrifuga a 120 x g per 5 min. Aspirare il supernatante con attenzione.
- Risospendere il pellet cellulare in 1-2 mL di DMEM contenente l'1% di FBS. Determinare la cella e % conteggi di cellule vive utilizzando Trypan Blue e un emocitometro o un dispositivo di conteggio automatizzato. Cellule di Pellet come descritto al punto 3.11.
NOTA: Dopo il passaggio 3.12, le cellule possono essere coltivate in supporti di coltura tissutale appropriati. 17 mi lato
4. Etichettatura Cisplatina per determinare le cellule vive / morte
- Risospendere 1-3 x 106 celle per 1 mL di DMEM contenente 25 cisplatin (2,5 - L di stock/mL). Incubare per 1 min e dissetare pipettando con un volume uguale di FBS (ad esempio, 1 mL).
- Centrifuga a 120 x g per 5 min. Decant supernatant in un becher contenente candeggina diluita e tubi invertiti per drenare la soluzione rimanente su un tovagliolo di carta. Toccare delicatamente per liberare la soluzione rimanente su pellet e sidewall del tubo.
- Risospendere il pellet cellulare in2 mL di PBS senza Ba 2. Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 4.2.
NOTA: Si consiglia di fissare le cellule se non possono essere macchiate immediatamente.
5. Fissazione delle cellule con etichetta cisplatin (opzionale)
- Risospendere 1-3 x 106 cellule con etichetta tura cisplatina in 1 mL di PBS senza Ba2. Vorticare le cellule a bassa potenza continua e aggiungere dropwise 1 mL (1 volume) del buffer di fissaggio PFA 2x. Incubare a RT per 10 min su una piattaforma a dondolo.
- Cellule di Pellet come descritto al punto 4.2, ma centrifugare a 500 x g per 5 min.
- Lavare le celle con2 mL di cellule PBS e pellet senza Ba 2, come descritto nel passaggio 5.2. Ripetere il passaggio 5.3 una volta.
- Risospendere il pellet in 2mL di PBS senza Ba 2. Conservare a 4oC per <3 d. Aggiungere FBS al 3% (ad esempio, 0,3 mL di FBS/mL di celle) del volume totale se si conserva più a lungo >3 d, quindi mescolare e congelare a -80 gradi centigradi.
NOTA: la fissazione può influire sul rilevamento di alcuni incarnati. Gli effetti della fissazione sul segnale anticorpale devono essere determinati empiricamente.
6. Codifica a barre dei campioni (opzionale ma consigliato)
- Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2 e quindi risospendere 1-3 x 106 celle in 1 mL di 1x buffer di fissaggio (vedere Tabella dei materiali). Incubare a RT per 10 min.
- Lavare le celle con 1 mL di buffer permeabilizzazione del codice a barre (vedere Tabella dei materiali). Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Ripetere il passaggio 6.2 una volta.
- Aggiungete 100 l di buffer di permeabilizzazione del codice a barre ai codici a barre (vedere Tabella deimateriali)18 e mescolate immediatamente mentre le celle del passaggio 6.2 sono a pelletizzazione.
- Risospendere il pellet cellulare in un buffer di permeabilizzazione di 800 ll di codice a barre. Aggiungere la soluzione del codice a barre alle celle, mescolare e incubare a RT per 30 min. Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Lavare nuovamente le celle in 2 mL di buffer di colorazione cellulare (vedere Tabella deimateriali) e pellet.
NOTA: Fino a 20 campioni possono essere etichettati con varie combinazioni di metalli Palladium18. Altre strategie di codifica a barre sono descritte altrove15.
7. Etichettatura delle cellule per la citometria di massa
- Risospendere 1-3 x 106 celle in 1 mL di soluzione di lavoro buffer di colorazione dell'antigentà nucleare (vedere Tabella dei materiali). Combinare i campioni in un unico tubo per i passaggi successivi quando si utilizzano campioni con codice a barre. Incubare a RT per 30 min. Pellet come descritto nel passaggio 5.2.
- Risospendere 1-3 x 106 celle in 2 mL di buffer di permeabilizzazione della colorazione dell'antigen nucleare (vedere Tabella dei materiali). Scalare in base alle esigenze. Ad esempio, utilizzare 6 mL di buffer per 10 campioni combinati con un numero di celle di 9 x 106 celle. Pellet come descritto nel passaggio 5.2.
- Ripetere il passaggio 7.2. Vorticare delicatamente il pellet cellulare nel volume residuo lasciato nel tubo.
- Aggiungere 50 - L di cocktail anticorpale intracellulare per 1-3 x 106 cellule. Scalare in base alle esigenze. Ad esempio, utilizzare 150 l del cocktail anticorpale per 10 campioni combinati con un numero di cellule di 9 x 106 cellule. Mescolare e incubare a RT per 45 min. Aggiungere 2 mL di buffer di colorazione cellulare e pellet come descritto nel passaggio 5.2.
- Risospendere il pellet 1-3 x 106 celle in 2 mL di buffer di colorazione cellulare. Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Ripetere il passaggio 7.5 una volta.
NOTA: Altre soluzioni tampone possono essere utilizzate per colorare la membrana extracellulare o i marcatori citolasmici e lo sperimentatore potrebbe dover ottimizzare la colorazione se è necessario rilevare gli epitopi in diverse posizioni cellulari. Le cellule possono anche essere fissate in PFA dopo il passaggio 7.5 quando si utilizzano celle vive per la colorazione. - Risospendere 1-3 x 106 celle in 1 mL di soluzione di intercalazione e conservare per 1-3 d a 4 gradi centigradi.
- Conservare le celle a -80 gradi centigradi in DMSO contenente la soluzione per le celle >3 d. Pellet come descritto nel passaggio 5.2 se le cellule sono in soluzione di intercalazione. Risospendere il pellet (1-3 x 106 celle) in 1 mL di celle di colorazione cellulare e di pellet come descritto nel passaggio 5.2. Resuspend pellet in 1 mL del 10% DMSO/90% FBS19, trasferire in un crioviale, mettere in un contenitore di congelamento isopropanolo, e conservare a -80 .
- Cellule di Pellet come descritto nel passaggio 5.2. Lavare 1-3 x 106 celle con 2 mL di buffer di colorazione cellulare, pellendo come descritto nel passaggio 5.2. Eseguire due lavature aggiuntive con 2 mL di acqua, pellendo come descritto nel passaggio 5.2.
- Diluire le perline di calibrazione EQ 1:9 in acqua (soluzione di riserva a 3,3 x 105 perline/mL).
- Risospendere il pellet cellulare a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL con soluzione diluita perline EQ. Filtrare le cellule attraverso tubi di flusso del farro da 35 m.
- Eseguire campioni sul citometro di massa e acquisire dati. I dati verranno depositati in un formato di file Flow Cytometry Standard (FCS).
8. Elaborazione e analisi dei file di dati di citometria di massa
- Normalizzare i file FCS. Utilizzare un programma gratuito disponibile allhttps://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
- Deconvolute file FCS con codice a barre. Separare la popolazione di codici a barre raggruppati in file con codice a barre separati con un programma gratuito disponibile allhttps://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
- Analizzare i file FCS normalizzati. Utilizzare programmi commerciali21,22 o freeware (vedi web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).
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Representative Results
La tabella 1 mostra le rese cellulari e la fattibilità previste dall'orecchio adulto del topo (Figura 1) e dalla pelle neoatale in condizioni non patologiche. La tabella mostra anche i dati rappresentativi degli animali provenienti da uno sfondo misto C57/126. Si prevede che la pelle di altri ceppi si tradurrà in rese cellulari e vitalità simili. La resa approssimativa dipende dalla superficie della pelle e indica che la pelle neonale sarebbe una scelta migliore per esperimenti che richiedono un maggior numero di cellule (Tabella 1). Bassi rendimenti o redditività ridotta (<50%) indicherebbe problemi con la digestione o le condizioni sperimentali che riducono l'integrità della pelle o inducono la morte cellulare. Cellule di coltura con supporti appropriati e integratori possono aiutare a valutare la qualità dei preparati KC17.
Dopo la normalizzazione20 e la deconvulation18 dei file FCS, la raccolta dei dati definirà le popolazioni di cellule epidermiche di interesse e definirà le singole fasi del ciclo cellulare (Figura 2). Nei grafici bivariati che confrontano i canali 191Ir vs 193Ir, le celle intatte possono essere gated nel quadrante superiore destro (Figura 2A). La tracciatura della lunghezza degli eventi rispetto a 191Ir e la selezione di un gruppo stretto di celle vicino all'asse 191Ir deprimono le singole celle. Le celle vitali sono selezionate in un grafico di 195Pt vs 193Ir trama gating per le cellule con bassi livelli di 195Pt. Il campione illustrato nella figura 2A presenta detriti e una maggiore presenza di cellule non vitali con cisplatina. Ciò può indicare che il campione è stato eccessivamente digerito, maneggiato duramente o lasciato sul ghiaccio o RT per troppo tempo prima della colorazione per la citometria di massa. I profili delle cellule legate alla coltura tissutale in genere danno percentuali più elevate di 195cellule negative Pt (Figura2B). In alternativa, la presenza di cellule positive da 195Pt può essere prevista se la morte delle cellule a induzione è una caratteristica del modello sperimentale e/o delle condizioni.
Idealmente, i marcatori che definiscono la popolazione di interesse dovrebbero essere inclusi nell'analisi di tipi di cellule specifici. Ad esempio, le cellule immunitarie che dovrebbero essere presenti nelle sospensioni KC grezze possono essere rilevate con l'aggiunta di un anticorpo CD4523, che rileva le cellule ematopoietiche (Figura 2C). Per quanto riguarda il pannello anticorpi di proliferazione13, la tracciatura di IdU vs CYCLIN B1 risolve le fasi del ciclo cellulare (Figura 2C) simili alla trama di flusso BrdU/PI standard (Figura 2D), consentendo il rilevamento della fase S, g0/G1 e g2/M Popolazioni. Nei grafici IdU vs pHH3, alta positività pHH3 identifica le cellule di fase M. Infine, l'analisi delle celle G0/G1 sul segnale pRB alto può distinguere G0 (quiescente) dalle celle in G1 (Figura 2C, a sinistra della maggior parte del pannello).
Dopo aver identificato le diverse fasi del ciclo cellulare, è quindi possibile costruire una rappresentazione grafica dei profili del ciclo cellulare per diversi tipi di cellule o condizioni sperimentali. Ad esempio, quando si confrontano le popolazioni di celle CD45- e CD45 , ad esempio, nella sospensione KC illustrata nella Figura 2vengono confrontati i profili di celle CD45- e CD45 . Come previsto, i KC iperplastici trovati nel gruppo CD45 avevano meno cellule nelle fasi G0 e più cellule nelle fasi S, G2 e M3. Al contrario, le cellule immunitarie dello stesso campione avevano popolazioni degne di nota in G0 e G1. Oltre ai profili del ciclo cellulare, è possibile anche la caratterizzazione dell'espressione genica in modo dipendente dal ciclo cellulare. Ad esempio, le proteine fosforo che aiutano a definire la segnalazione EGFR e mTOR/PI3K sono state analizzate nei dati presentati per la figura 3A. L'analisi delle fasi G1 delle cellule CD45- vs CD45 ha rivelato un profilo simile per le proteine di segnalazione EGFR e mTOR/PI3K, anche se sembravano esserci lievi differenze nella percentuale di cellule positive pS6 e pEGFR (Figura 3B). Approcci simili possono essere adattati per caratterizzare l'espressione di altre proteine della via di segnalazione o processi cellulari in diverse fasi del ciclo cellulare.
Figura 1 : Preparazione della pelle dell'orecchio del topo per la digestione. (A) In primo luogo, rimuovere l'orecchio dall'animale e giacere piatto su un piatto Petri pulito. (B) Afferrare un lato dell'orecchio al centro o al bordo utilizzando pinze di precisione curve. (C) Capovolgere e utilizzando un altro paio di pinze e tirare delicatamente le metà dell'orecchio a parte fino a quando l'orecchio si strappa sulla piega. (D) Continuare a tirare fino a quando i lati si separano in due metà. (E) Galleggiare l'orecchio a metà sui supporti di dissociazione con il lato derma toccando la soluzione. Barra di scala - 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : strategia di Gating per i dati di citometria di massa. I dati di questa cifra sono stati generati da un animale sperimentale trattato con il phorbol ester TPA come descritto in precedenza3. TPA è un attivatore PKC che induce l'infiammazione della pelle24. (A) I pannelli mostrano la strategia iniziale di gating dopo la normalizzazione e la deconvoluzione dei dati codificati a barre. Gating sulla lunghezza dell'evento, 191Ir,193Ir, e 195Pt canali, è possibile selezionare per celle intatte, singole e vitali. (B) Cellule Umane SRB SRB-P93 trattate con DMSO e sono state poi macchiate per la citometria di massa. I dati sono stati recintati come in (A) e il grafico mostra i livelli di cellule vive in questo esempio. (C) L'inclusione di marcatori di lignaggio consente la selezione delle popolazioni cellulari di interesse. Per questo esempio, le celle vitali di (A) sono state escluse sulla lunghezza dell'evento rispetto a CD45 per escludere le celle ematopoietiche. Le cellule CD45 per l'incorporazione di IdU vs CYCLIN B1 consentono l'identificazione delle popolazioni di cellule S, G0/G1 e G2/M. La selezione delle celle alte pHH3 definisce la fase M, mentre l'analisi di G0/G1 per la positività pRB identifica le cellule in G1. (D) Il grafico mostra i risultati rappresentativi dell'analisi del ciclo cellulare mediante l'individuazione dell'incorporazione di BrdU e del PI (contenuto del DNA) con citometria di flusso basata sulla fluorescenza. I dati mostrati provengono da cellule umane Colo163 SCC coltivate con BrdU per 1 h come descritto in precedenza3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : caratterizzazione dei profili del ciclo cellulare e espressione proteica specifica della fase. (A) I profili del ciclo cellulare sono stati determinati nel campione della figura 2 per le celle CD45- vs CD45. (B) L'analisi delle fasi G1 con anticorpi specifici del fosforo nelle cellule CD45-(arancione) e CD45-(Blue) ha rivelato profili di espressione simili per i marcatori dei percorsi di segnalazione EGFR e mTOR/PI3K. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| fazzoletto | area | Resa cellulare | attuabilità |
| Orecchio del mouse | 225-230 mm3 | 1-2x106 | 70-90% |
| Pelle neooatale | 1000-1100 mm3 | 5-10x106 | 80-99% |
Tabella 1: Rese tipiche di cellule e vitalità da orecchio di topo adulto e pelle neooatale. Il numero di cellule e la fattibilità con l'esclusione blu di Trypan sono stati mediati dai KC auricolari raccolti da orecchie da topo adulto di 7-10 settimane o pelli neoinate n. 7 P3.
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Discussion
Il protocollo descritto in questo documento può essere completato in circa 8 ore. Il risultato finale è una sospensione delle cellule arricchite in PC che possono essere analizzati per l'espressione proteica in modo dipendente dal ciclo cellulare. Diversi studi precedenti hanno delineato metodi per isolare i K dalla pelle umana e del topo16,25. Questi studi includono anche protocolli per l'isolamento dei KC per la citometria di flusso26. Tuttavia, non è stato descritto in precedenza un protocollo dettagliato che combina l'isolamento dei KC con l'analisi dell'espressione proteica e della dinamica del ciclo cellulare utilizzando la citometria di massa.
Il più grande ostacolo per ottenere risultati di alta qualità in questo protocollo è la qualità delle cellule vive utilizzate. Nella letteratura, le condizioni e gli enzimi suggeriti per la separazione epidermide/dermida variano notevolmente16,25,26,27. Tuttavia, si raccomanda quindi di mantenere il tempo di digestione della pelle alla più breve durata possibile che consente una separazione efficace dell'epidermide dal derma. Questo protocollo presenta la digestione con collagenasi dispasi e tipo IV che permette una facile separazione della pelle neonatale sia dell'orecchio che del topo entro 1 h. Questo si traduce in rendimenti cellulari sufficienti con elevata vitalità cellulare. Un altro fattore che può influenzare la qualità delle cellule è la posizione della pelle selezionata per la digestione. Si presume che i KSi comportino in modo simile da diverse posizioni anatomiche nel corpo. Tuttavia, la pelle in siti diversi può avere diverse proprietà e composizione delle cellule staminali28,29. Tuttavia, l'uso della pelle neoatale e dell'orecchio3,30 è preferito perché l'isolamento dei KC è più difficile dalle aree della pelle con un'alta densità di follicoli piliferi (ad esempio, la pelle posteriore). Un più alto grado di manipolazione o dissociazione tissutale può essere richiesto per un isolamento efficiente dei CC dalle aree pelose del topo26. Le condizioni sperimentali prima dell'isolamento dei KC possono anche influenzare la qualità delle cellule isolate. Le lesioni cutanee o condizioni che influenzano la barriera cutanea o l'integrità della pelle possono ridurre la separazione dell'epidermide dal derma. Ciò potrebbe comportare una riduzione delle rese di cellule vitali o una maggiore contaminazione delle cellule non KC (ad esempio, cellule immunitarie). Infine, i PC isolati sono suscettibili di agglomerarsi. Possono anche perdere la vitalità cellulare se lasciati troppo a lungo sul ghiaccio o a RT prima dell'elaborazione per la citometria di massa o altre analisi a singola cellula.
La metodologia di colorazione per la citometria di massa è simile a quella utilizzata per la citometria del flusso di fluorescenza, ma con differenze chiave. Ad esempio, la rilevazione della replicazione del DNA si ottiene rilevando direttamente l'IdU invece che con l'uso di anticorpi contro gli analoghi nucleotidicome BrdU. Il rilevamento diretto di IdU semplifica notevolmente l'identificazione delle cellule S-phase, poiché il rilevamento degli anticorpi di BrdU può essere una procedura coinvolta. Un'altra differenza è l'uso della cisplatina per la discriminazione delle cellule morte e vive. La cisplatina etichetta preferibilmente le cellule morte. Questo passaggio è simile all'uso di PI o altre macchie per esperimenti FACS morti/live. La fase di colorazione della cisplatina è importante perché le cellule morte possono legare anticorpi e quindi generare falsi segnali positivi. La citometria di massa utilizza anche anticorpi per rilevare l'espressione di un marcatore specifico della fase al posto della misurazione del contenuto del DNA. Ciò consente una facile discriminazione delle singole fasi del ciclo cellulare. Infine, i file di dati di citometria di massa (FCS) devono essere normalizzati utilizzando il picco di perline di calibrazione a causa del deterioramento del segnale campione nel tempo nello strumento CyTOF durante la stessa corsa e tra una corsa e l'altra.
La colorazione, l'acquisizione di dati e l'analisi per la citometria di massa sono state ben esaminate dalle recenti pubblicazioni14,15. L'applicazione di questa tecnologia all'analisi delle cellule ematopoietiche e immunitarie è ben documentata. Ciò è evidente da una vasta collezione di anticorpi con etichettatura metallica disponibili in commercio e dalla predominanza delle pubblicazioni relative al sistema immunitario che utilizzano questa tecnologia. L'applicazione immediata della citometria di massa nella pelle sarebbe per l'analisi delle cellule immunitarie. Ciò è particolarmente rilevante per i modelli di pelle dei topi in malattie come il cancro in cui l'infiammazione ha un ruolo importante. Per l'analisi delle cellule non immunitarie, la mancanza di anticorpi con etichettatura metallica disponibili in commercio può essere un ostacolo. Il vantaggio dei reagenti commerciali è che possono essere utilizzati senza una notevole ottimizzazione come sarebbe il caso per gli anticorpi con etichetta metallica domestica. Tuttavia, ci sono anticorpi con etichettatura metallica contro tag fluorescenti comunemente usati (ad esempio, FITC, PE e APC) che consentirebbero a uno sperimentatore di aggiungere ulteriori marcatori al proprio pannello di colorazione. Questa soluzione può essere applicata anche all'analisi delle cellule della pelle in specie diverse, dove può esserci un numero limitato di anticorpi commerciali con etichettatura metallica che mostrano reattività tra le specie. Tuttavia, questa soluzione richiede anche un ulteriore passaggio di colorazione dopo la colorazione cisplatina e qualche ottimizzazione. Un'ulteriore considerazione per la costruzione di un pannello di successo sono discussi nella letteratura14. Un altro svantaggio della citometria di massa è che l'efficienza di raccolta dei dati dei citometri di massa può essere 40-60% del numero di cella di input. Di conseguenza, l'analisi delle popolazioni di cellule rare (ad esempio, le cellule staminali) da campioni sfusi può richiedere un maggior numero di cellule, il raggruppamento di campioni per la rilevazione efficace o altri approcci per arricchire la popolazione cellulare di interesse prima della colorazione per la citometria di massa 24.
La citometria di massa è una potente tecnologia emergente il cui uso continuerà a crescere. Attualmente, l'applicazione di questa tecnologia è focalizzata sull'uso di anticorpi con marcatura metallica, ma è stata recentemente estesa per la rilevazione di mRNA31. Inoltre, c'è il potenziale di etichettare altri componenti cellulari o metaboliti con tag metallici, che espanderebbero la gamma di applicazione per la citometria di massa nella pelle e in altri tessuti da topi, esseri umani e altre specie. In sintesi, questo protocollo può quindi estendere gli strumenti sperimentali disponibili per i biologi della pelle per correlare l'espressione della proteina KC nelle varie fasi del ciclo cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il sostegno a questo lavoro è stato fornito dal Dipartimento di Dermatologia, dal Gates Center for Regenerative Medicine presso l'Università del Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212). Gli autori riconoscono la sovvenzione di supporto e risorsa di supporto Cytometry Shared Resource and support (NCI P30 CA046934) per il funzionamento del citometro di massa e sono grati per Karen Helm e Christine Childs al centro per i loro consigli di esperti sul flusso e sulla citometrica di massa Tecniche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM - Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
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