Denne protokol beskriver, hvordan man isolerer hudens keratinocytter fra musemodeller, til farvning med metal mærkede antistoffer, og til at analysere farvede celler ved massecytometri for at profilere udtryks mønstret af proteiner af interesse i de forskellige celle cyklus faser.
Målet med denne protokol er at detektere og kvantificere ændringer i protein ekspression i en celle cyklus-afhængig måde ved hjælp af enkeltceller isoleret fra epidermis af mus hud. Der er syv vigtige trin: adskillelse af epidermis fra dermis, fordøjelsen af epidermis, farvning af epidermal cellepopulationer med Cisplatin, prøve barkodning, farvning med metal mærkede antistoffer for celle cyklus markører og proteiner af interesse, påvisning af metal mærkede antistoffer ved massecytometri og analyse af ekspression i de forskellige celle cyklus faser. Fordelen ved denne tilgang over histologiske metoder er potentialet til at assay udtryks mønsteret af > 40 forskellige markører i en enkelt celle i forskellige faser af cellecyklussen. Denne fremgangsmåde giver også mulighed for multivariat korrelationsanalyse af protein ekspression, der er mere kvantificerbare end histologiske/billedbehandlings metoder. Ulempen ved denne protokol er, at en suspension af enkeltceller er nødvendig, hvilket resulterer i tab af lokaliseringsoplysninger fra farvning af vævs sektioner. Denne fremgangsmåde kan også kræve medtagelse af yderligere markører for at identificere forskellige celletyper i rå celle suspensioner. Anvendelsen af denne protokol er tydelig i analysen af hyperplastiske hudsygdoms modeller. Desuden kan denne protokol tilpasses til analyse af specifikke undertyper af celler (f. eks. stamceller) ved tilsætning af Lineage specifikke antistoffer. Denne protokol kan også tilpasses til analyse af hudceller i andre forsøgs arter.
Korrelation af genekspression med celle cyklus faser er fortsat en udfordring i analysen af dyremodeller af hyperplastiske sygdomme som kræft. En del af denne udfordring er co-påvisning af proteiner af interesse (POI) med markører for spredning. Proliferative celler kan findes i forskellige celle cyklus faser herunder G1, S, G2, og M. Ki67 er en af de mest almindeligt anvendte markører for spredning og udtrykkes i alle faser af cellen cyklus. Det er blevet flittigt anvendt i analysen af både humane og mus væv1,2,3. Men ligesom andre generelle spredning markører, Ki67 ikke skelne individuelle celle cyklus faser. En mere præcis tilgang bruger inkorporering af thymidinnukleotid analogerne som bromodeoxyuridine (brdu) i celler, der aktivt Repliker deres genomet (dvs. S-fase)4,5. En ulempe ved brugen af nukleotidanaloner er behovet for at administrere dem til levende dyr timer før analyse. Ki67 og BrdU er almindeligt detekteret på faste vævs sektioner ved brug af antistoffer. En fordel ved denne fremgangsmåde er, at placeringen af POI’er kan fastslås inden for vævs arkitekturen (f. eks. det basale lag hud epidermis). Denne fremgangsmåde kræver heller ikke vævs dissociation, der kan føre til ændringer i genekspression. En ulempe er, at vævs fiksering eller behandling af vævet til OLT-frosset eller paraffin-skæring kan medføre antistofmål (dvs. antigener). Genfinding af antigener kræver typisk varme-eller vævs fordøjelse. Kvantificering af farvnings intensiteter kan også være udfordrende. Dette skyldes variationer i farvning, snittykkelse, signaldetektering, og eksperimententer bias. Desuden kan et begrænset antal markører detekteres samtidigt i de fleste typiske laboratorie opsætninger. Endnu, nyere multiplex farvning tilgange lover at overvinde disse begrænsninger; Eksempler herpå er billedbehandlings massecytometri og tyramid-signal forstærkning6,7.
Flow cytometri er en anden kraftfuld teknologi til at detektere prolifererende celler. Det giver mulighed for multiplex påvisning af markører i de samme celler, men kræver vævs dissociation for de fleste ikke-hæmatopoietiske celletyper. Analyse af prolifererende celler sker rutinemæssigt ved brug af farvestoffer, der binder DNA (f. eks Propidium iodide (PI))8. Flowcytometri giver også mulighed for en mere præcis bestemmelse af celle cyklus faser, når det kombineres med påvisning af BrdU inkorporering9. Selv om en stærk tilgang, brdu/pi flow flowcytometri har sine ulemper. Det er ikke i stand til at løse de G2/M og G0/G1 faser uden inddragelse af fase-specifikke antistoffer. Antallet af antistoffer, der kan anvendes, er dog begrænset af cellulær autofluorescens, spektral afsmittende virkninger af fluoroforet-emissioner og brug af kompensations kontrol. Denne begrænsning Marcus det mere udfordrende og omstændelig at co-detektere udtrykket af celle cyklus markører med POI’er. En mere facile tilgang er at bruge massecytometri10,11. Denne teknologi bruger metal konjugeret antistoffer, der har en smallere detekterings spektrum. Når cellerne er plettet med metal mærkede antistoffer, er de fordampet, og metallerne detekteres ved flowcytometri Time-of-Flight (cytof) massespektrometri. På grund af disse egenskaber muliggør massecytometri multiplex-detektion af > 40 forskellige markører ved hjælp af eksisterende platforme10,11. Desuden er det muligt at stregkode prøver med metaller, der resulterer i besparelser af dyrebare antistoffer og samtidig reducere prøve-til-prøve farvning variation. På den anden side har masse cytometri flere ulemper. Der er et begrænset antal kommercielt tilgængelige metal mærkede antistoffer for ikke-blod afledte celler. Kvantificering af DNA-indholdet er mindre følsomt sammenlignet med brugen af fluorescerende DNA-farvestoffer, og massecytometri har et reduceret dynamisk spektrum af signaldetektering i forhold til fluorescens flow cytometri.
Den protokol, der er beskrevet her, er designet til at analysere celle cyklus dynamik fra nyligt isolerede keratinocytter (KCs) fra mus hud og karakterisere celle cyklus specifikke protein udtryk i disse celler ved hjælp af massecytometri. Denne protokol kan også bruges med dyrkede celler eller tilpasset andre celletyper.
Protokollen, der er skitseret i dette dokument, kan udfyldes i ca. 8 timer. Slutresultatet er en suspension af celler beriget i KCs, der kan analyseres for protein ekspression i en celle cyklus-afhængig måde. Flere tidligere undersøgelser har skitseret metoder til at isolere KCS fra menneske og mus hud16,25. Disse undersøgelser omfatter også protokoller for isolering af KCs til strømnings cytometri26. Der er imidlertid ikke tidligere…
The authors have nothing to disclose.
Støtte til dette arbejde kom fra Department of Dermatology, Gates Center for regenerativ medicin på University of Colorado og University of Colorado (UC) hudsygdom Center morfologi og Phenotyping kerner (NIAMS P30 AR057212). Forfatterne anerkender UC Cancer Center flow cytometry Shared Resource og support Grant (NCI P30 CA046934) for driften af Mass flowcytometer og er taknemmelig for Karen Helm og Christine Childs i kernen for deres ekspertrådgivning om flow og masse cytometriske Teknikker.
12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
Cisplatin | Sigma | 479306 | |
Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |