使用微球菌核酸酶在哺乳动物细胞中进行染色质免疫沉淀实验

摘要

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究基因调控分子机制的有力工具。然而，该方法在通过机械剪切获得可重复的染色质片段化方面存在困难。在此，我们提供一种利用酶解消化的ChIP检测的改进方案。

摘要

为了在生物体中表达细胞表型，活细胞会相应地执行基因表达，而转录程序在基因表达中起着核心作用。细胞的转录机制及其染色质修饰蛋白协同调控转录过程。为了在分子水平上分析转录调控，已有多种实验方法可供使用，例如电泳迁移率变动实验、瞬时报告基因实验以及染色质免疫沉淀（ChIP）实验。本文详细描述了一种经过改进的ChIP实验方法，因其在直接展示组蛋白修饰以及细胞内蛋白质与DNA相互作用方面具有优势。成功进行ChIP实验的关键步骤之一是染色质剪切。尽管超声处理常用于染色质剪切，但难以确定可重复的实验条件。我们采用微球菌核酸酶（MNase）进行酶解消化，而非超声剪切，以获得更可重复的结果。本文提供了一种使用MNase的简便ChIP实验方案。

引言

哺乳动物细胞中的基因表达受到严密且动态的调控，其中转录是关键步骤之一。基因转录主要由转录因子和组蛋白进行调控。转录因子是一类能够结合特定DNA序列并控制基因转录的蛋白质，它们通过促进或抑制RNA聚合酶II（PolII）的招募，从而启动以基因组DNA为模板的mRNA合成¹。组蛋白尾部残基的乙酰化和甲基化等组蛋白修饰，可通过改变染色质结构对基因转录产生正向或负向影响²。由于基因表达的改变会影响细胞状态，因此研究转录调控的分子机制至关重要。

迄今为止，已有多种方法可用于研究基因转录的调控机制。电泳迁移率变动分析（EMSA），也称为凝胶迁移分析，用于分析蛋白质与DNA之间的相互作用³。将目标细胞的核提取物与放射性同位素（例如³²P）标记的DNA探针孵育后，在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。其自显影图像显示，DNA-蛋白质复合物在凝胶中的迁移速度比游离探针更慢。当存在针对该蛋白质的抗体时，DNA-蛋白质-抗体三元复合物在凝胶中的迁移速度比DNA-蛋白质复合物更慢。这种发生“上移”的条带可揭示DNA与蛋白质之间的特异性结合。然而，EMSA仅能检测无细胞体系中的特定DNA-蛋白质相互作用，因此尚不清楚该相互作用是否在活细胞中调控转录过程。为研究细胞内基因表达的调控，发展了瞬时报告基因检测法，通常称为荧光素酶报告基因检测。通常将目的基....

方案

1. 试剂的准备

1. 配制18.5%的多聚甲醛（PFA）溶液。在50 mL锥形塑料管中加入0.925 g PFA、4.8 mL水（整个实验过程中均使用超纯水）和35 µL 1 M KOH。盖紧管盖，将管子置于盛有约200 mL水的400–600 mL玻璃烧杯中，用微波炉加热。在水沸腾前取出管子，涡旋振荡以溶解PFA。待PFA冷却至室温后，置于冰上保存。
   注意：重复加热和混匀步骤，直至PFA完全溶解。在交联反应前（步骤2.1.3）立即配制PFA溶液。
2. 配制1.25 M甘氨酸溶液。将14.07 g甘氨酸溶于150 mL水中，经0.22 µm孔径滤膜过滤，4 °C保存。
3. 配制ChIP细胞裂解缓冲液。将378 mg PIPES、10.6 mL 2 M KCl和1.25 g支链辛基苯氧基聚（乙二醇）乙醇溶解于水中，在4 °C条件下用1 M KOH调节pH至8.0，并定容至250 mL。经0.22 µm孔径滤膜过滤后，4 °C保存。
4. 配制微球菌核酸酶（MNase）消化缓冲液。每1 mL溶液包含：0.1 mL 10× MNase消化缓冲液、10 µL 100× BSA溶液、10 µL 0.1 M二硫苏糖醇和0.88 mL水。
5. 配制1 M NaHCO₃溶液。将4.2 g NaHCO₃溶于50 mL水中，经0.22 µm孔径滤膜过滤，室温保存。
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结果

染色质消化是ChIP实验中的重要步骤之一。我们使用MNase消化染色质，以获得核小体寡聚体的混合物。在MNase消化过程中，MNase能够穿过核膜并消化染色质，但消化后的染色质无法穿过核膜，仍保留在细胞核内。为了将消化后的染色质从细胞核中释放出来，需要进行短暂的超声处理。图1A展示了VCaP细胞悬液在超声处理前后的显微照片。未经超声处理时，细胞结构保持完整，表明染色质仍存在于细胞核中。短暂的超声处理可破坏细胞结构，通过显微照片观察细胞状态有助于确定合适的短暂超声条件。我们还展示了在293T细胞（图1B）、人B细胞急性淋巴细胞白血病细胞系REH细胞（图1C）以及人前列腺癌细胞系LNCaP（图1D）中进行短暂超声的其他示例。

图2A显示了在VCaP细胞中使用不同量的MNase处理后染色质的片.......

讨论

尽管超声处理常用于获得片段化的染色质，但确定可重复的实验条件往往耗时且繁琐。在本实验方案中，我们采用MNase消化法，因为酶消化更易于实现条件的可重复性。MNase消化后需进行短暂的超声处理（见步骤2.2），以破坏细胞膜并释放已消化的染色质。因此，本方案中的超声功率应尽可能低。我们对所使用的所有细胞均采用相同的超声条件（见图1和Table 1），以实现细胞膜的完全破裂。

使用MNase消化染色质是本实验方案中的关键步骤，因此我们投入了大量精力优化细胞内染色质消化的条件。消化活性取决于酶量、底物（染色质）量以及孵育时间。此外，由于不同细胞的倍性存在差异，必须针对每种细胞类型确定MNase消化的最佳条件。一旦确定，无论细胞接受何种处理，均可采用相同的消化条件。在每次实验中，我们都会检测染色质的消化模式，以确保其适用于ChIP实验，如图2A第5泳道所示。

某些因素会影响染色质免疫沉.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Thermo Scientific	AM9010
2 M KCl	Thermo Scientific	AM9010
2x iQ SYBR Green supermix	Bio-Rad	1706862
5 M NaCl	Thermo Scientific	AM9010
50 bp DNA ladder	New England Biolabs	N3236S
琼脂糖	Research Product International	A20090
支链辛基苯氧基聚乙氧基乙醇	Millipore Sigma	I8896	IGEPAL CA-630
ChIP级蛋白G磁珠	Cell signaling technology	9006S
染色质免疫沉淀（ChIP）稀释缓冲液	Millipore Sigma	20-153	缓冲液成分：0.01% SDS，1.1% Triton X-100，1.2 mM EDTA，16.7 mM Tris-HCl，pH 8.1，167 mM NaCl。
紫色凝胶上样染料（6x）	New England Biolabs	B7024S
甘氨酸	Bio-Rad	161-0724	电泳级
糖原	Millipore Sigma	G1767	19–22 mg/mL
Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（无EDTA，100x）	Thermo Scientific	78445
高盐免疫复合物洗涤缓冲液	Millipore Sigma	20-155	缓冲液成分：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，pH 8.1，500 mM NaCl。
H3K4me3组蛋白抗体（pAb）	Active Motif	39915
LiCl免疫复合物洗涤缓冲液	Millipore Sigma	20-156	缓冲液成分：0.25 M LiCl，1% IGEPAL CA630，1%脱氧胆酸钠，1 mM EDTA，10 mM Tris，pH 8.1。
低盐免疫复合物洗涤缓冲液	Millipore Sigma	20-154	缓冲液成分：0.1% SDS，1% Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl，pH 8.1，150 mM NaCl。
Magna GrIP磁力架（8孔）	Millipore Sigma	20-400	任何可兼容1.5 mL离心管的磁力分离架均可使用。
微球菌核酸酶	New England Biolabs	M0247S	附带10x缓冲液（500 mM Tris-HCl，50 mM CaCl2，25 °C时pH 7.9）和100x BSA（10 mg/mL）
NaHCO3	JT Baker	3506-01
正常兔IgG	Millipore Sigma	12-370
PIPES	Millipore Sigma	P6757
蛋白酶K	Millipore Sigma	3115887001
实时PCR系统	Bio-Rad	CFX96, C1000
RNA聚合酶II CTD磷酸化Ser5抗体	Active Motif	39749
SDS	Boehringer Mannheim	100155	电泳级
乙酸钠	Millipore Sigma	S5636
配备微探头的超声破碎仪	QSONICA	Q700	任何可兼容1.5 mL离心管的超声破碎仪均可使用。
UltraPure苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1, v/v）	Thermo Scientific	15593031	pH 8.05