Summary
染色质免疫沉淀(ChIP)是了解基因调控的分子机制的有力工具。然而,该方法在通过机械剪切获得可重复染色质碎片方面遇到了困难。在这里,我们为使用酶消化的ChIP测定提供了改进的协议。
Abstract
为了表达生物体内的细胞表型,活细胞相应地执行基因表达,转录程序在基因表达中起着核心作用。细胞转录机及其染色质修饰蛋白协调以调节转录。为了在分子水平上分析转录调控,可以使用几种实验方法,如电泳移动移位、瞬态报告器和染色质免疫沉淀(ChIP)测定。本文详细介绍了经过修饰的ChIP测定,因为它具有直接显示组蛋白修饰和细胞中蛋白质和DNA之间的相互作用的优点。成功的 ChIP 测定的关键步骤之一是染色质剪切。虽然声波常用于剪切染色质,但很难识别可重现的条件。我们采用微球核酸酶(MNase)的酶消化,而不是通过声波剪切染色质,从而获得更可重复的结果。在本文中,我们使用MNase提供一个简单的ChIP测定协议。
Introduction
哺乳动物细胞的基因表达是严格而动态的调节,转录是关键步骤之一。基因转录主要受转录因子和组蛋白的调节。转录因子是一种蛋白质,它与特定的DNA序列结合并控制基因转录。这些因素要么促进或抑制RNA聚合酶II(PolII)的招募,它启动从基因组DNA作为模板1的mRNA合成。组蛋白修饰,如乙酰化和甲基化组蛋白尾残留物正和消极影响基因转录通过改变染色质结构2。由于基因表达的变化会影响细胞上下文,因此有必要研究转录的分子机制。
迄今为止,已有几种研究基因转录调控的方法可用。电泳移动移位测定(EMSA),也称为凝胶移位测定,用于分析蛋白质-DNA相互作用3。从感兴趣的细胞中孵育出一种放射性同位素(例如,32 P)标记的DNA探针,并在聚丙烯酰胺凝胶上电泳。其自动放射图显示,DNA-蛋白质复合物的迁移速度比凝胶中的探针慢。在存在针对蛋白质的抗体的情况下,DNA-蛋白质-抗体复合物在凝胶中迁移的速度比DNA-蛋白质复合物要慢。这个超移带揭示了DNA和蛋白质之间的特定结合。然而,EMSA只确定细胞无细胞系统中的特定DNA-蛋白质相互作用,因此,该相互作用是否控制活细胞的转录仍不得而知。瞬态报告器测定,通常称为荧光酶报告器测定,是为解决细胞中的基因表达调节而开发的。通常 , 感兴趣的基因的上游基因组区域入到报告质粒中 , 瞬时转染成细胞 , 并测量报告者的活动。各种缺失突变体允许识别负责基因调控的区域。尽管报告员检测是识别转录因子和控制转录的结合DNA序列的有用工具,但这种方法有一个主要缺点,即报告质粒不含染色质结构,不能反映"真实"转录机械。此外,组蛋白修改的更改不能由系统确定。
染色质免疫沉淀(ChIP)方法的发展是基于杰克逊和查克利的报告,"全细胞"固定与甲醛保留染色质结构4,5。自那时以来,许多相关的技术已经开发和改进6。在ChIP测定中,细胞用甲醛固定,以交叉连接DNA和蛋白质。染色质是支离破碎的,然后用感兴趣的抗体进行免疫沉淀。免疫复合物被洗净,DNA被纯化。PCR扩增与引基因靶向基因组的特定区域揭示感兴趣的蛋白质在基因组的占用。
虽然ChIP是识别蛋白质(如转录因子)和修饰组蛋白与DNA相互作用的有力工具,但该方法在实践中涉及一些困难,如染色质破碎步骤。声波已广泛应用于剪切染色质;但是,识别可重现的条件很麻烦。微球核酸酶(MNase)治疗是染色质剪切的替代方法。MNase是一种内源性酶,可消化双链、单链、圆形和线性DNA和RNA。确定最佳染色质分片的条件(包括染色质和酶的量、温度和孵育时间)相对容易。我们修改和简化了现有的协议,并建立了一个简单易重用的方法。本文提供了在哺乳动物细胞中使用MNase的ChIP测定方案。
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Protocol
1. 试剂制备
- 制造18.5%的甲醛(PFA)溶液。在 50 mL 锥形塑料管中加入 0.925 g 的 PFA、4.8 mL 的水(在整个协议中使用超净化水)和 35 μL 的 1 M KOH。用微波炉将盖子紧紧合住,在 400-600 mL 玻璃烧杯中加热管,其中包含约 200 mL 的水。在水开始沸腾之前取出管子,并涡旋管以溶解 PFA。让 PFA 冷却到室温并储存在冰上。
注:重复加热和混合,直到 PFA 完全溶解。在交联之前立即准备 PFA 解决方案(步骤 2.1.3)。 - 制造1.25M甘氨酸溶液。将14.07克甘氨酸溶解在150 mL水中,并通过0.22 μm孔径过滤器过滤。储存在4°C。
- 使 ChIP 细胞解液缓冲液。将378毫克的PIPES、10.6 mL的2M KCl和1.25克分枝八苯基苯基多(乙烯氧)乙醇溶解在水中。在 4°C 下,使用 1 M KOH 将 pH 调整为 8.0,并构成高达 250 mL 的 pH 值。过滤0.22 μm孔径的过滤器,并储存在4°C。
- 使微球核酸酶(MNase)消化缓冲液。要制造 1 mL,将 0.1 mL 的 10x MNase 消化缓冲液、10μL 100x BSA 溶液、10 μL 0.1 M 二硫硫醇和 0.88 mL 水混合。
- 制作 1 M NaHCO3。将 4.2 g 的 NaHCO3溶解在 50 mL 的水中,并通过 0.22 μm 孔径过滤器进行过滤。在室温下储存。
- 制造 10% 硫酸二钠 (SDS)。将 5 克 SDS 溶解在 50 mL 水中。在室温下储存。
- 使洗脱缓冲。混合15μL的1M NaHCO 3,15μL的10%SDS和120μL的水,以获得150μL的洗脱缓冲液一个样品。
注:根据样本数量按比例增加体积。 - 制作 3 M 醋酸钠 (pH 5.2) 溶液。将24.6克醋酸钠溶解在水中。用醋酸将pH调整到5.2,并组成100 mL。过滤0.22 μm孔径的过滤器,并在室温下储存。
2. 确定MNase消化条件
注:在协议的第2步中,给出了一个使用VCaP的例子,提出了人类前列腺癌细胞。任何哺乳动物细胞系都可以使用;请参阅步骤中的注释。
- 交叉染色质的制备
- 在二氧化碳培养箱中,在37°C下,用10%的胎儿牛血清(FBS)在DME高血糖中保持VCaP细胞。种子VCaP细胞在4 x 106细胞在6 6厘米的培养和培养4 mL的培养和培养3天。
注:为每个单元格线使用适当的培养基。在 6 厘米或 10 厘米的菜盘中可以播种多达 10 x 106个细胞。对于悬浮细胞,T25烧瓶中的种子细胞。盘子或烧瓶的数量取决于多少剂量测试MNase消化。如果测试4剂,准备6个盘子或烧瓶。另请参阅步骤 2.2。 - 使用胰蛋白酶从一个培养皿中分离 VCaP 细胞并计算细胞数。在一个菜盘中计算细胞数。对于悬浮细胞,从一个烧瓶中取出少量细胞悬浮液并计算细胞数量。
- 在4 mL的培养培养剂中,在6厘米的培养皿中加入0.229 mL的18.5%PFA,最终浓度为1%。轻轻但彻底地旋转盘子或烧瓶,均匀地分配PFA。在室温下孵育整整10分钟。
注:在此步骤中,染色质和蛋白质是交联的。由于 PFA 有毒,在化学烟气罩中执行此步骤并使用适当的个人防护设备。 - 10分钟后,在最终浓度为125 mM时加入0.47 mL的1.25 M甘氨酸溶液。在室温下孵育5分钟。
注:甘氨酸中和过量的PFA,以停止进一步的交联。 - 吸出甲醛/甘氨酸/培养基。通过加入4 mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)两次清洗细胞。对于悬浮细胞,将细胞悬浮液转移到15 mL锥形管中,并在室温下以300 x g离心5分钟。吸出上清液,并添加一个中等体积的PBS并完全挂起。重复此步骤。适当处置液体废物,因为它们含有甲醛。
- 通过在PBS中加入1/100体积的100xPIC,制备含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(PIC)的PBS。从一道菜中吸出PBS,每盘含有PIC的PBS添加1 mL。刮取细胞并将细胞悬浮液转移到1.5 mL微离心管。对于悬浮细胞,只需将悬浮液转移到1.5 mL管。
- 在室温下,在3,000 x g下使用5分钟的离心管,以回收细胞颗粒。使用移液器完全拆下 PBS。记录每管的细胞数,并将细胞颗粒储存在-80°C。
- 在二氧化碳培养箱中,在37°C下,用10%的胎儿牛血清(FBS)在DME高血糖中保持VCaP细胞。种子VCaP细胞在4 x 106细胞在6 6厘米的培养和培养4 mL的培养和培养3天。
- 细胞解说和MNase消化
注:以下步骤中的试剂体积基于一个包含 6 x 106细胞的管。根据细胞数量按比例调整试剂体积;当一个管包含2 x 106细胞时,使用100 μL的ChIP细胞解液缓冲液(步骤2.2.1),MNase消化缓冲液(步骤2.2.3)和ChIP稀释缓冲液(步骤2.2.5)和10μL的0.5M EDTA(pH 8.0)(步骤2.2.4)。- 在冰上解冻步骤2.1.7中制备的储存细胞颗粒(VCaP细胞,每管含有6个10个6个细胞)。通过在缓冲液中添加 1/100 体积的 100x PIC,制备 ChIP 细胞解液缓冲液,并辅以 PIC。加入300 μL的ChIP细胞赖沙缓冲液,补充PIC,并彻底重新悬浮颗粒。涡旋管15秒,孵育悬浮在冰上10分钟。
- 在 9,000 x g下在 4°C 下离心 3 分钟,并完全去除上清液。在300 μL的MNase消化缓冲液中重新悬浮颗粒。
- 用MNase消化缓冲液稀释MNase(2,000凝胶单位/μL),以给予50个凝胶单位/μL。将0,0,2,4μL的50个凝胶单位/μL的MNase添加到悬浮液中,并在37°C下孵育,正好10分钟,每2.5分钟通过反转混合。
注:表1显示了多个细胞系中MNase的最佳量。 - 加入30 μL的0.5M EDTA(pH 8.0),以短暂终止MNase消化和涡旋。在冰上孵育5分钟。在 9,000 x g下在 4°C 下离心 5 分钟,并完全去除上清液。
- 通过在缓冲器中添加 1/100 体积的 100x PIC,准备 ChIP 稀释缓冲器,并辅以 PIC。在 300 μL 的 ChIP 稀释缓冲液中重新悬浮颗粒,并辅以 PIC。
- 使用配备微尖探头的声波器在冰上声波悬浮液。使用以下声波条件:振幅2,处理时间15秒,脉冲5秒,脉冲关闭30秒。取1μL的悬架,并点到滑动玻璃上,并用显微镜观察它们。确保细胞结构几乎破碎。
注:图1A显示了声波前后VCaP细胞悬浮液的代表性微照片。此步骤用于通过破坏核膜将消化染色质释放到上清液中。功率设置应调整为最大功率的 5%,并尝试在超过 30 秒的间隔内进行 5 秒的声波。如果功率控制可用,则将功率设置调整为 5 W,并处理上文所述的总 15 s 的样本,使总功率为 70-75 J。如果不够,请再重复一次。上述条件实际上适用于测试的所有细胞系。 - 在 9,000 x g下在 4°C 下离心 10 分钟,将上清液转移到新的 1.5 mL 微离心管中,并保存 20 μL 的消化染色质,用于步骤 2.3。剩余储存在-80°C。
- 反向交联、DNA纯化及消化染色质分析
- 将 75 μL 的水、4 μL 的 5 M NaCl 和 1 μL 蛋白酶 K 添加到 1.5 mL 的螺杆管中。从步骤2.2.7中制备的各种MNase消化条件中加入20μL的消化染色质,加入含有水、NaCl和蛋白酶K的管中。
注:此步骤用于去除蛋白质和DNA之间的交联。 - 根据每个情况准备两个 1.5-mL 微离心管。在一根1.5 mL管中加入100μL的苯酚:氯仿:二醇(25:24:1)(PCI)。将10μL的3M醋酸钠(pH 5.2)和2μL的糖原加入另一根管。
注:使用氯仿:丙醇是没有必要的7。增加体积可能导致低脱氧核糖核酸恢复后乙醇沉淀8。 - 将含有消化染色质的管从步骤2.3.1中短暂离用,并加入100μL的PCI。紧闭盖子,并大力涡旋形成乳液。在室温下以最高速度(例如 20,000 x g)将管离心 30 s。
- 小心地服用含有DNA的上相,并加入步骤2.3.2中制备的含有PCI的管中。作为步骤 2.3.3,将管大力旋转和离心。
注:如果下相受到污染,则再次离心管,或先取出大部分下相,将管离心,并取上相。 - 仔细服用步骤 2.3.4 中描述的上相,并将含有步骤 2.3.2 中制备的醋酸钠和糖原的管添加到管中。加入250μL乙醇。通过反转混合,在室温下孵育10分钟。在4°C下以最大速度(例如20,000 x g)离心管30分钟。
注:溶液在室温下孵育不影响DNA恢复8,9。 - 确认管底部的颗粒。小心地去除上清液,以免干扰颗粒,并加入 500 μL 的 70% 乙醇。在4°C下以最大速度(例如20,000 x g)离心管5分钟。
- 完全去除上清液,在室温下干燥颗粒约 5 分钟。将颗粒溶解在 20 μL 的 10 mM Tris* 中HCl/1 mM EDTA (pH 8.0) (TE)。使用紫外分光光度计测量 DNA 浓度。
- 将 0.5 μg 的 DNA 与凝胶加载染料混合,并涂抹在 2% 的甘蔗凝胶中。在三酸乙酯-EDTA缓冲液中电镀样品在100 V处,直到紫色染料迁移到凝胶的三分之二,并染色含0.5微克/mL溴化乙酸的凝胶10分钟。拍摄凝胶的照片。
注:有关详细信息,请参阅图2。
- 将 75 μL 的水、4 μL 的 5 M NaCl 和 1 μL 蛋白酶 K 添加到 1.5 mL 的螺杆管中。从步骤2.2.7中制备的各种MNase消化条件中加入20μL的消化染色质,加入含有水、NaCl和蛋白酶K的管中。
3. 染色质免疫沉淀
- 消化染色质的制备
- 准备细胞。对于粘附细胞,种子2-10 x 106细胞每盘2个菜(6厘米或10厘米)每个治疗组,并允许细胞附着在菜的底部超过1天。对于悬浮细胞,每个治疗组在2个T25烧瓶中播种。根据需要处理细胞。
- 从每组取一个盘子或烧瓶,并计算步骤 2.1.2 中描述的细胞号。如步骤 2.1.3-2.1.7 所述,准备交叉链接染色质。
- 如步骤 2.2.1-2.2.7 中所述,对细胞颗粒和 MNase 消化进行酶。使用最佳量的MNase消化步骤2中确定的染色质。将消化染色质储存在-80°C。
- 如步骤 2.3.8 所述,反向交联 20 μL 的消化染色质并纯化 DNA。测量步骤 2.3.7 中描述的 DNA 浓度。电液样品在2%的甘蔗凝胶中,以检查步骤2.3中所述的消化染色质的大小。
注:DNA浓度与步骤3.1.3中制备的存储消化染色质的浓度相同。 - 从步骤 3.1.4 稀释反向交联消化染色质样品,用水提供 10 纳克/μL,并连续稀释,使浓度达到 1、0.1 和 0.01 纳克/μL,储存在 -20°C。
注:这些样品用于实时PCR标准。
- 免疫沉淀
注:在协议步骤3.2-3.5中,确定VCaP细胞中的抗甲基化组蛋白H3基林4(H3K4me3)的占用。另见图3。- 从步骤 3.1.3 解冻消化的染色质。将所有样品放在冰上。
- 通过在缓冲器中添加 1/100 体积的 100x PIC,准备 ChIP 稀释缓冲器,并辅以 PIC。稀释消化染色质至5μg/500μL,辅以PIC。准备 1,000 μL 加上额外的 (1) IP 与非免疫 IgG (控制 IgG), (2) IP 与 H3K4me3.
- 将 5 μL 的 5 μg/500 μL 消化染色质加入 1.5 mL 螺纹管作为输入样品(1% 的 IP)。将样品储存在-80°C。
- 将 5 μg/500 μL 消化染色质各加入 500 μL,作为 IP 样品添加到 1.5 mL 螺杆管中。向管中加入2μg抗体。关闭盖子,在4°C下孵育管子过夜,使用摇动平台进行温和混合。
注:虽然最佳抗体量应以经验方式确定,但首先建议每个 IP 2 μg。 - 每个 IP 添加 30 μL ChIP 级蛋白质 G 磁珠。在 4°C 下孵育管 2 小时,使用摇动平台温和混合。
注:不需要预洗磁珠。
- 洗涤免疫复合物和反向交联
- 从步骤 3.2.5 短暂旋转管。将管子放在装有新钛磁铁的聚乙烯机架中1分钟。通过吸气小心地去除上清液。
- 加入0.5 mL每管低盐免疫复合洗涤缓冲液。通过轻轻敲击或短暂涡旋管来分散珠子。在 4°C 下孵育管 5 分钟,使用摇动平台进行温和混合。5 分钟后,重复步骤 3.3.1。
- 每管加入0.5 mL的高盐免疫复合洗涤缓冲液。作为步骤 3.3.2 分散和清洗珠子。洗涤后,重复步骤 3.3.1。
- 每管加入0.5 mL的LiCl免疫复合洗涤缓冲液。作为步骤 3.3.2 分散和清洗珠子。洗涤后,重复步骤 3.3.1。
- 将管子放在磁性机架中 1 分钟,完全取出剩余的上清液。
- 向管中加入150 μL洗脱缓冲液。涡旋管以完全分散珠子。关闭盖子,在65°C孵育管30分钟,每5分钟通过反转或涡旋混合,以彻底分散珠子。
- 在孵育过程中,制备1.5 mL螺杆,加入步骤3.2.3中制备的6μL 5M NaCl和2μL蛋白酶K.解冻1%输入样品。加入150μL洗脱缓冲液,6μL 5 M NaCl和2μL蛋白酶K到1%的输入样品。
- 孵育后,旋转管。将管放入磁性机架中 1 分钟,并将上清液转移到步骤 3.3.7 中制备的含有 NaCl 和蛋白酶 K 的螺钉管中。
- 关闭盖和涡旋所有 IP 和输入样品以完全混合。在65°C孵育管过夜。
- DNA纯化
- 按照 2.3.2 中所述准备管,并添加 150 μL 的 PCI,而不是 100 μL。在另一根管中,加入12μL的3M醋酸钠(pH 5.2)和2μL的糖原。
- 从培养箱中取出管子。向下旋转管并添加 150 μL 的 PCI。
- 涡旋大力管形成乳液。在室温下以最高速度(例如 20,000 x g)将管离心 30 s。
- 小心地将上相的140 μL转移到步骤3.4.1中制备的含有PCI的管中。重复步骤 3.4.3。
注:另请参阅步骤 2.3.4 中的注释。 - 小心地将120μL的上相转移到含有醋酸钠和糖原的管中,该管在步骤3.4.1中制备。
注:另请参阅步骤 2.3.4 中的注释。 - 加入300μL乙醇。通过反转混合,在室温下孵育10分钟。
- 在4°C下以最大速度(例如20,000 x g)离心管30分钟。如步骤 2.3.6 所述,清洗颗粒。
- 根据步骤 2.3.7 中所述干燥颗粒后,将颗粒溶解在 TE 的 50 μL 中。储存在-20°C。
- 使用实时PCR检测DNA片段
- 解冻以下样品:(1) 带控制 IgG 的 IP,(2) 带防 H3K4me3 的 IP,(3) 1% 输入样品。解冻步骤3.1.5中准备的4剂标准(共7个样品)。
注:使用同一组的标准对输入和 IP 样本中的 DNA 量进行量化。 - 为 8 个样品制作 PCR 工作解决方案。混合 40 μL 的 2 倍实时 PCR 超级混合,4 μM 正向和反向底漆各 8 μL,以及 8 μL 水。
注:一种PCR反应混合物含有5μL的2倍实时PCR超混合,4μM正向和反向底漆各1μL,水1μL。引性序列列在表2中。 - 五氯苯酚工作溶液的8μL,放入PCR板的一个孔中。从步骤 3.4.8 或步骤 3.1.5 中添加 2 μL 样品或标准。
- 密封 PCR 板并使用以下条件运行 PCR:1) 95 °C,初始变性 3 分钟,2) 95 °C 10 秒用于变性,3) 56°C 用于 30 秒的退火,4) 72 °C 用于 30 秒的扩展和数据收集,重复步骤 2) 到 4) 为 55 个周期。循环后,测量 PCR 产物的熔化曲线。分析数据。
注:图3的原始数据如图3所示。 使用标准曲线计算样本的起始数量 (SQ)。将 SQ 以 1% 输入乘以 100,将 1% 的输入样本的 SQ 调整为一个 IP,从而在输入中给出调整后的 SQ(Eq. 1)。在 IP 样本中按输入中调整的 SQ 划分 SQ,以给出 % 输入值(百分比输入法,Eq. 2)。要计算折叠扩充,请将具有抗 H3K4me3 的 IP 中的 SQ 与控制 IgG(折叠扩充方法,Eq. 3)中的 SQ 除以
输入中调整的 SQ = (1% 输入中的 SQ) x 100 (1)
H3K4me3 的百分比输入百分比 = 100 x(IP 中 SQ 与防 H3K4me3) / (输入中调整的 SQ) (2)
H3K4me3 + 的折叠富集性 (具有防 H3K4me3 的 IP 中的 SQ) / (具有控制 IgG 的 IP 中的 SQ) (3)
- 解冻以下样品:(1) 带控制 IgG 的 IP,(2) 带防 H3K4me3 的 IP,(3) 1% 输入样品。解冻步骤3.1.5中准备的4剂标准(共7个样品)。
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Representative Results
消化染色质是ChIP测定的重要步骤之一。我们使用MNase消化染色质,以获得核小体寡聚物的混合物。在MNase消化步骤中,MNase可以通过核膜和消化染色质。然而,消化的染色质不能穿过膜,并留在核中。要从核中释放消化的染色质,需要短暂的声波。图1A显示了VCaP细胞悬浮液声波前后的微照片。在没有声波的情况下,细胞结构保持不变,表明染色质存在于核中。短暂的声波会破坏细胞结构,在微照片中检查细胞有助于确定短暂的声波条件。我们还给出了在293T细胞(图1B)中短暂声波的其他例子,人类B细胞急性淋巴细胞白血病细胞系,REH细胞(图1C)和人类前列腺癌细胞系LNCaP(图1D)。
图2A显示在VCaP细胞中处理不同量的MNase后染色质分裂。我们在300μL的消化缓冲液中,用0、50、100、200个凝胶单位的MNase在37°C下治疗6 x 106个交联VCaP细胞颗粒10分钟。在消化染色质纯化后,在2%的甘蔗凝胶上分析500纳克的DNA,并沾染溴化钠。如果不添加MNase,就出现了分子量非常高的涂片模式(通道1)。MNase 的加入给出了一个梯形模式(N;单核糖体单位),表明 MNase 消化了内糖体(通道 2-5)。图 2B显示了不适当的消化模式。过度消化主要导致单核糖体生产(图2B,车道7)。我们应该找到产生染色质片段达到900bp(一至五个核小体;例如,车道5)的适当条件。
为了检查 ChIP 测定是否正确执行,必须在测定中进行适当的控制。对于免疫沉淀,与感兴趣的抗体来自同一物种的非免疫IgG用作一种对照,显示对同一区域的非特异性结合(参见讨论)。此外,建议测量正极和负区域蛋白质(占用)的结合。人们普遍认为,H3K4me3的占用率分布在大约1千基(kb)上下游的转录起始站点10,11。我们测量了H3K4me3在AR阳性VCaP细胞AR转录起始位点(AR-TSS)下游的大约20kb上游到12kb的AR基因组中的H3K4me3占用率。本实验中使用的VCaP细胞染色质消化模式如图3A所示,表明染色质的正确消化。在AR-TSS和AR-TSS上游的0.5 kb和1kb上部观察到H3K4me3的最高占用率(图3B)。只要基因是转录活性的,TSS可以是"正区"。然而,位于AR-TSS上游19 kb和8 kb和12kb下游的区域很少占用H3K4me3(图3B),这表明这些区域可以用作"负区域"。
已经表明,雄激素增加RNA聚合酶II在PSA启动子和增强剂在LNCaP细胞使用切屑染色质通过声波12,13。因此,我们通过测量活性RNA聚合酶II(磷酸酯RNA聚合酶II在丝氨酸5处)来测试我们的协议的有效性;单元格中的 PolII(pS5)。我们进行了同样的实验来检查我们方法的可重复性。LNCaP细胞在类固醇匮乏培养基培养3天,用车辆或10 nM二氢睾酮(DHT)刺激4小时。活性RNA聚合酶II占用通过免疫沉淀与抗PolII(pS5)进行测量,然后实时PCR。图4A显示了三个独立实验中LNCaP细胞染色质的可重复消化模式。如图4B所示,使用百分比输入法时,DHT显著提高了POLII(pS5)在PSA启动子和增强器中的占用率。我们还使用折叠浓缩法(图4C)计算了占用率,发现PSA启动子中的PolII(pS5)无显著差异,无论是否进行DHT处理。DHT没有影响GAPDH推广人如先前14日公布的占用情况。重要的是,我们的数据与从声波-采集染色质样本12、13中获得的数据相似。
图 1:声波前后交联细胞颗粒的代表性微照片。交联VCaP (A)、 293T (B)、 REH (C) 和 LNCaP (D) 细胞颗粒用MNase处理,颗粒在ChIP稀释缓冲液中重新悬浮。在声波前后,拍摄了悬挂的照片。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:消化染色质的代表性甘蔗凝胶分析。(A) 交联染色质是从VCaP细胞制备的,并按照步骤2.2所述用各种量的MNase进行消化。消化染色质在2%的甘蔗凝胶中反向交联、纯化和分析。N;单核糖体单位。(B) VCaP细胞的染色质在37°C下每2 x 106细胞用250个凝胶单位的MNase消化20分钟并进行分析(如A所述)。大量的MNase和更长的孵育时间导致染色质几乎完全消化形成单核细胞体(150 bp)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:H3K4me3占用在AR基因组中。消化染色质是从VCaP细胞制备的。(A) 使用胶凝乳分析消化模式.(B) 5 μg 消化染色质用步骤 3.1 和步骤 3.2 中所述的 2 μg 正常兔 IgG 或抗H3K4me3抗体进行免疫沉淀。免疫复合物被洗涤和洗脱珠,并反向交联。使用表2所列的引物集使用实时PCR对纯化DNA片段进行了分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:雄激素增加PSA启动子和增强剂中的活性RNA聚合酶II的占有率。类固醇饥饿的LNCaP细胞在4小时内使用或不带10 nM DHT进行治疗,并制备消化染色质。(A) 在三个独立实验中从LNCaP细胞中消化染色质的消化模式.(B,C)消化染色质用抗PolII(pS5)抗体进行免疫沉淀,DNA片段被纯化,如图3所示。使用表2所列引物集的实时PCR测定了活性RNA聚合酶II在PSA启动子、增强剂和GAPDH促进剂中的占有率作为百分比输入(B)和褶皱扩充(C)。结果表明,三个独立实验的均值= SE。(*);p<0.05,(*);p < 0.01 与 0 nM DHT 治疗。NS;与 0 nM DHT 相比,该显著性与 0 nM DHT 相比。请点击此处查看此图的较大版本。
| 单元格线 | 100 μL缓冲液中每200万个细胞的凝胶单位,37°C10分钟 |
| LnCaP | 267 |
| VCaP | 66.7 |
| 293T | 450 |
| REH | 134 |
| 22Rv1 | 400 |
表 1:各种细胞系中微球酸核酸酶的最佳量。该值表示 100 μL 缓冲液中每 2 x 106个细胞的 MNase 量,10 分钟为 37°C。
| 引种名称 | 序列 | |
| AR (-18.8kb) | Fwd | ATATGGAACTATATCT |
| 转速 | 中化中心CTCCTCCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCCT | |
| AR (-8.8kb) | Fwd | 塔卡卡格茨塔加特塔加特 |
| 转速 | TGAAATCTGGATAAAGCA | |
| AR (-8.2kb) | Fwd | CAGTGCATTTTGTGGGGGGGGC |
| 转速 | TTGGATCTATATTTGA | |
| AR-TSS (0 kb) | Fwd | GCAAACTTGCATTCTC |
| 转速 | GGCCCTTTCTCTCTC | |
| AR (0.6 kb) | Fwd | 中加协 |
| 转速 | TGAAGACCGACT克特克特TC | |
| AR (+1.0kb) | Fwd | CCGCATTTCTCG |
| 转速 | CTTCCCGCCCTACTACTACTACTACTACTACT | |
| AR (+11.8kb) | Fwd | CCTTGCTGGGAACTGGTAG |
| 转速 | 塔特格特格格格格格格格格格 | |
| PSA 推广器 | Fwd | CCTAGATAGCTCCTCTCTCTA |
| 转速 | GGGAGGGGCTACTG | |
| PSA 增强剂 | Fwd | 海合会加特加特加加特加特克特茨克 |
| 转速 | ACACCTTTTTTGGGGG | |
| 加普德 | Fwd | 塔格格格塔格格格格格格格格 |
| 转速 | 嘎加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加加 |
表 2:用于 ChIP 测定的成对底漆序列。
| AR (-18.8kb) | 重庆 | 平方 | 调整为一个 IP | % 输入 | 折叠浓缩 |
| 1% 输入 | 23.49 | 0.815 | 81.5 | 100 | |
| 带控制 IgG 的 IP | 27.68 | 0.051 | 0.051 | 0.062 | 1 |
| 带防 H3K4me3 的 IP | 22.48 | 1.590 | 1.590 | 1.951 | 31.4 |
| AR (-8.8kb) | 重庆 | 平方 | 调整为一个 IP | % 输入 | 折叠浓缩 |
| 1% 输入 | 23.22 | 0.586 | 58.6 | 100 | |
| 带控制 IgG 的 IP | 26.81 | 0.052 | 0.052 | 0.088 | 1 |
| 带防 H3K4me3 的 IP | 23.74 | 0.414 | 0.414 | 0.706 | 8.0 |
| AR (-8.2kb) | 重庆 | 平方 | 调整为一个 IP | % 输入 | 折叠浓缩 |
| 1% 输入 | 23.19 | 0.643 | 64.3 | 100 | |
| 带控制 IgG 的 IP | 26.99 | 0.048 | 0.048 | 0.075 | 1 |
| 带防 H3K4me3 的 IP | 23.63 | 0.477 | 0.477 | 0.742 | 9.9 |
| AR-TSS (0 kb) | 重庆 | 平方 | 调整为一个 IP | % 输入 | 折叠浓缩 |
| 1% 输入 | 25.06 | 0.657 | 65.7 | 100 | |
| 带控制 IgG 的 IP | 28.63 | 0.050 | 0.050 | 0.077 | 1 |
| 带防 H3K4me3 的 IP | 20.70 | 15.064 | 15.064 | 22.944 | 299.8 |
| AR (0.6 kb) | 重庆 | 平方 | 调整为一个 IP | % 输入 | 折叠浓缩 |
| 1% 输入 | 23.86 | 0.716 | 71.6 | 100 | |
| 带控制 IgG 的 IP | 26.67 | 0.106 | 0.106 | 0.147 | 1 |
| 带防 H3K4me3 的 IP | 19.15 | 17.787 | 17.787 | 24.840 | 168.6 |
| AR (+1.0kb) | 重庆 | 平方 | 调整为一个 IP | % 输入 | 折叠浓缩 |
| 1% 输入 | 23.51 | 0.730 | 73.0 | 100 | |
| 带控制 IgG 的 IP | 25.94 | 0.125 | 0.125 | 0.171 | 1 |
| 带防 H3K4me3 的 IP | 19.06 | 18.486 | 18.486 | 25.335 | 147.8 |
| AR (+11.8kb) | 重庆 | 平方 | 调整为一个 IP | % 输入 | 折叠浓缩 |
| 1% 输入 | 24.54 | 0.876 | 87.6 | 100 | |
| 带控制 IgG 的 IP | 29.14 | 0.033 | 0.033 | 0.037 | 1 |
| 带防 H3K4me3 的 IP | 24.47 | 0.918 | 0.918 | 1.048 | 27.97 |
表 3:图 3 的定量 PCR 分析的原始数据。Cq:阈值周期数,SQ:使用标准曲线计算起始数量,调整为一个IP:将SQ在1%输入中乘以100作为一个IP的1%样本体积用于PCR,% 输入:在IP样本中除以SQ,在输入中调整,折叠扩充:在 IP 中除除反 H3K4me3 的 IP 中 SQ,并控制 IgG。
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Discussion
虽然声波通常用于获得零碎的染色质,但识别可重现的条件既耗时又繁琐。在此协议中,我们使用MNase消化,因为酶消化应该更容易识别可重复的条件。在MNase消化后,需要一个短暂的声波步骤(参见步骤2.2)来破坏细胞膜并释放消化的染色质。因此,我们协议中的声波功率应该尽可能低。我们对所有使用的细胞使用相同的声波条件(参见图1和表1)来获得膜的完全分解。
MNase 的染色质消化是我们协议中的关键步骤,因此,我们努力优化细胞内染色质的消化条件。消化活性由酶和基质(染色质)和孵育时间的数量决定。此外,由于不同细胞之间的策略不同,必须为每个细胞类型确定MNase消化的最佳条件。一旦建立,相同的条件可以应用,无论细胞治疗。我们总是检查每个实验中的染色质消化模式,以确保消化模式适合ChIP测定,如图2A,车道5所示。
一些因素影响ChIP测定的结果。在我们的协议中使用适当数量的消化染色质是很重要的。在许多协议中,一个IP的细胞数而不是染色质的量显示15,16。由于多向差异,这些实验条件在细胞间染色质量产生高变异性。我们在测定中使用5μg染色质和2μg抗体,因此我们的方案比其他协议更直接、更清晰,尽管可能需要知识产权的最佳抗体量。抗体的选择也很重要;使用ChIP测定验证抗体。
分析ChIP PCR数据的方法有两种:百分比输入法和折叠扩充法。在百分比输入法中,来自 IP 样本的信号除以 IP 样本中总染色质的信号。在折叠扩充法中,来自 IP 的信号与特定抗体(如 H3K4me3)进行除以来自 IP 的信号,并带有控制 IgG。后一种方法仅适用于不同生理条件下不同条件下多个目标或相同目标来自 IP 且具有控制 IgG 的信号相似且可重现的情况。实际上,信号电平会有所不同,因此褶皱富集值具有高变异性,如图4C所示。因此,我们不建议使用折叠扩充方法来表示我们方法中的 ChIP 数据。
MNase 倾向于欧色马丁"开放"环境,并且不能用于异体素结构,这表明 MNase 消化可能产生一些偏差。据报道,富集的拉明A相互作用染色质域在声波-谢化和MNase消化染色质制剂17之间是不同的。因此,ChIP测定中的MNase消化可能不适合分析核结构相关分子,如层压A/C和特殊AT-富序列结合蛋白1(SATB1)。
在专为下游微阵列(芯片上的ChIP)或测序(ChIP-seq)分析设计的ChIP测定协议中,RNase在DNA纯化步骤中使用,尽管不是用于PCR分析18的协议。我们尚未测试我们的协议是否与芯片上的 ChIP 和 ChIP-seq 分析兼容,但我们假设我们的协议在使用 RNase 处理样本时适用。如果需要RNase治疗,在步骤3.3中使用2 μL的10mg/mL无DNaseRNase A,而不是蛋白酶K,并在65°C孵育过夜。在纯化DNA(步骤3.4)之前,加入蛋白酶K,并在60°C下再孵育1小时。
我们通常使用本文描述的方法使用修饰的组蛋白和转录因子进行ChIP测定,并表明染色质重塑因子,AT-富相互作用域5B,通过改变PolII的占用率来调节AR基因表达(pS5)和H3K4me3在AR启动子19。我们相信,我们的协议在技术上比其他ChIP测定更容易,在分子生物学研究中被广泛接受。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了基因科技对希望之城的版税的支持。这项工作没有得到国家卫生研究院的全部或部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2x iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
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