Summary
כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.
Abstract
כדי לבטא פנוטיפים סלולריים באורגניזמים, תאים חיים לבצע ביטוי גנים בהתאם, ו הטרנססקריפט תוכניות לשחק תפקיד מרכזי בביטוי גנים. מכונות הסלולר והשינויים הכרומטין שלהם מתאמים לווסת את התמלול. כדי לנתח את הרגולציה ברמה המולקולרית, מספר שיטות נסיוניות כגון משמרת ניידות אלקטרופיניטית, כתב ארעי וכרומטין immunoprecipitation (שבב) בחני זמינים. אנו מתארים שינויים שבב שונה בפירוט במאמר זה בשל יתרונותיה של הצגת ישירות שינויים היסטון ואת האינטראקציות בין חלבונים DNA בתאים. אחד משלבי המפתח בתוך שיטת שבבים מוצלחת הוא הטיית כרומטין. למרות שsonication משמשת בדרך כלל לחיתוך כרומטין, קשה לזהות תנאים הנמצאים בשימוש. במקום הטיית כרומטין על ידי sonication, אנו מנוצל העיכול אנזימטיות עם מmicrococcal נוקלאז (mnase) כדי לקבל תוצאות לאחר מכן. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול שיטת שימוש ישירה של שבב באמצעות MNase.
Introduction
ביטוי הגנים בתאי היונקים הוא הדוק ומוסדר באופן דינמי, ותמלול הוא אחד משלבי המפתח. תמלול הגנים מוסדר בעיקר על ידי שעתוק והאבנים. גורם שעתוק הוא חלבון הנקשר רצפי DNA ספציפיים ושולט תמלול הגנים. גורמים אלה או לקדם או לעכב את הגיוס של RNA פולימראז II (PolII), אשר יוזם סינתזה mRNA מ-DNA גנומית כתבנית1. היסטון שינויים כגון מרחרחון ומתילציה של שאריות זנב האבן באופן חיובי ולרעה להשפיע על תמלול הגנים על ידי שינוי מבנה כרומטין2. מאחר ששינויים בביטוי הגנים משפיעים על ההקשר הסלולארי, חיוני לבחון את המנגנונים המולקולריים שעליהם מוסדר התמלול.
עד היום, מספר שיטות לחקירת התקנה של שעתוק גנים זמינים. שינוי ביכולת ניידות אלקטרופיניטית (EMSA), המכונה גם שיטת שינוי ג'ל, משמשת לניתוח אינטרקציה של חלבון DNA3. תמצית גרעינית מתאי העניין היא מודמת עם איזוטופ רדיואקטיבי (לדוגמה, 32P)-התווית בדיקת DNA ו אלקטרופורציםעל ג'ל פוליאקרילמיד. הautoradiogram שלו מראה כי מורכבות ה-DNA-חלבון נודד לאט יותר מאשר הגשוש ב ג'ל. בנוכחות נוגדן נגד החלבון, מתחם ה-DNA-חלבון-נוגדן נודד בג לאט יותר מאשר מתחם ה-DNA-חלבון. הלהקה הזאת שהוזזה מגלה את הכריכה המסוימת בין הדנ א לחלבון. עם זאת, EMSA קובע רק אינטראקציה ספציפית ל-DNA-חלבון במערכת ללא תא, ולכן היא עדיין אינה ידועה אם האינטראקציה שולטת בתמלול של תאים חיים. שיטת העיתונאי החולף, המכונה בדרך כלל בשיטת לוציפראז, פותחה כדי לטפל בתקנות ביטוי גנים בתאים. בדרך כלל, אזור גנומית במעלה הזרם של גן של עניין מוכנס לתוך הפלבאמצע הכתב, מנוכר באופן מבוקר לתוך תאים, ופעילות העיתונאי נמדד. מגוון של מוטציות מחיקה מאפשר זיהוי של אזורים האחראים לתקנות גנים. אף-על-פי שיטת העיתונאי הוא כלי שימושי לזיהוי גורמי התמלול ומחייב רצפי DNA שליטה שעתוק, שיטה זו יש חיסרון משמעותי כי הכתב פלבאמצע הוא ללא מבנה כרומטין ואינו משקף "אמיתי" מכונות שעתוק. בנוסף, לא ניתן לקבוע שינויים בשינויים באבן במערכת.
הפיתוח של שיטת כרומטין immunoprecipitation (שבב) היה מבוסס על הדוחות של ג'קסון וכלקלי כי "תא שלם" קיבעון עם פורמלדהיד שימר מבנה כרומתין4,5. מאז, טכניקות רבות הקשורות פותחו והשתפרו6. ב השבב assays, תאים קבועים עם פורמלדהיד כדי להצליב קישור DNA ו חלבונים. , הכרוטין מפוצלת. ואז מimmunoprecipitated עם נוגדנים מעניינים , הקומפלקס החיסוני נשטף. והדנ א מטוהר ה-PCR הגברה עם מטרה ממוקדת באזור מסוים של הגנום חושף את התפוסה של חלבונים של עניין בגנום.
למרות שבב הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות את האינטראקציות של חלבונים כגון שעתוק גורמים ושונה יסטוניים עם ה-DNA, השיטה כרוכה בקשיים מסוימים, כגון שלב הפיצול כרומטין, בפועל. Sonication שימש רבות לחיתוך כרומטין; עם זאת, מסורבל לזהות תנאים שאינם מזהים. טיפול מmicrococcal (MNase) הוא שיטה חלופית להטיה של כרומטין. MNase הוא אנדו-אקסאוכירות שעיכול כפול תקוע, יחיד תקועים, מעגלי ו-DNA ליניארי ו-RNA. קל יחסית לקבוע את התנאים, כולל הכמויות של כרומטין ואנזימים, טמפרטורה וזמן דגירה, עבור פיצול כרומטין אופטימלי. הצלחנו לשנות ולפשט את הפרוטוקולים הקיימים, והקמנו שיטה ישירה וברורה. נייר זה מספק את הפרוטוקול עבור שיטת השבב באמצעות MNase בתאי היונקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים
- להפוך 18.5% הפתרון פאראפורמלדהיד (בשיא). הוסף 0.925 g של הלאנד, 4.8 mL של מים (להשתמש במים אולטרה מטוהרים ברחבי הפרוטוקול) ו 35 μL של 1 M KOH בצינור פלסטיק באורך 50 mL. סגרו את המכסה בחוזקה והחום את הצינור בגביע 400-600 mL המכיל כ 200 מ ל של מים באמצעות מיקרוגל. להסיר את הצינור לפני המים מתחיל רותחים ומערבולת הצינור כדי לפזר את התחתית. הרשו ליחידה הל, להתקרר לטמפרטורת החדר ולחנות בקרח.
הערה: חזרו על החימום והערבוב עד שהוא מתמוסס לחלוטין. הכינו את הפתרון ה2.1.3 באופן מיידי לפני החיבור (step). - לעשות 1.25 M הפתרון גליצין. לפזר 14.07 g של גליצין ב 150 mL של מים ולסנן דרך מסנן בגודל 0.22 יקרומטר הנקבוביות. חנות ב -4 ° c.
- הפוך את מאגר פירוק התאים של השבב. התמוססות 378 מ"ג של צינורות, 10.6 mL של 2 M KCl, ו 1.25 g של octylphenoxy פולי (ethyleneoxy) אתנול במים. להתאים את ה-pH ל 8.0 עם קו 1 M ב 4 ° צ' ולהרוויח עד 250 mL. לסנן דרך מסנן 0.22 יקרומטר בגודל הנקבוביות ולאחסן ב 4 ° c.
- הפוך את מאגר העיכול של microccoccal (MNase). כדי להפוך 1 mL, לערבב 0.1 mL של 10x MNase מאגר העיכול, 10 μL של פתרון BSA 100x, 10 μL של 0.1 M dithiothreitol ו 0.88 מ ל של מים.
- לעשות 1 M נחקו3. לפזר 4.2 g של נחקו3 ב 50 מ ל של מים ולסנן דרך מסנן בגודל 0.22 יקרומטר הנקבוביות. . חנות בטמפרטורת החדר
- להפוך 10% נתרן dodecyl סולפט (SDS). מפזר 5 גרם של SDS ב 50 mL של מים. . חנות בטמפרטורת החדר
- הפוך מאגר הימנעות. מערבבים 15 μL של 1 M נחקו3, 15 μl של 10% sds, ו 120 μl של מים כדי להשיג 150 μl של מאגר הימנעות עבור מדגם אחד.
הערה: הגדל את אמצעי האחסון באופן פרופורציונלי בהתאם למספר הדגימות. - בצע 3 מטרים אצטט נתרן (pH 5.2) פתרון. מתמוסס 24.6 גרם של נתרן אצטט הידרוous במים. להתאים את ה-pH ל 5.2 עם חומצה אצטית ולפצות 100 mL. לסנן דרך מסנן 0.22 יקרומטר בגודל הנקבוביות ולאחסן בטמפרטורת החדר.
2. קביעת תנאי העיכול של MNase
הערה: בשלב 2 של פרוטוקול, דוגמה באמצעות VCaP, תאים סרטניים בערמונית האדם מוצג. ניתן להשתמש בכל קווי הסלולר של היונקים; ראה הערה בשלבים.
- הכנת כרומטין מקושרת
- שמור על תאי VCaP ב-DME גלוקוז גבוה שיושלם עם 10% סרום העוברי (FBS) ב 37 ° c בחממה פחמן דו חמצני. תאי VCaP בגובה 4 x 106 תאים בשישה 6 ס"מ מנות 4 מ ל של מדיה תרבותית ותרבות במשך 3 ימים.
הערה: השתמש במדיית תרבות מתאימה לכל קו תא. עד 10 x 106 תאים ניתן לזריעה בצלחת 6 ס"מ או 10 ס"מ. עבור תאים מושעה, תאי זרע ב T25 מבחנות. מספר מנות או מבחנות תלוי כמה מינונים נבדקים עבור העיכול MNase. אם 4 מינונים נבדקים, להכין 6 מנות או צלוחיות. ראה גם שלב 2.2. - ניתוק תאי VCaP ממנה אחת באמצעות טריפסין וספירת התא. חשב מספר תא במנה אחת. עבור תאים מושעה, להסיר כמות קטנה של השעיית התא מבקבוקון אחד ומספר תא ספירה.
- הוסף 0.229 mL של 18.5% בחצי הגמר לצלחת 6 ס"מ ב 4 מ ל של מדיה תרבותית בריכוז סופי של 1%. בעדינות אך מערבולת ביסודיות את התבשיל או הבקבוקון כדי לפזר באופן שווה. דגירה בטמפרטורת החדר בדיוק 10 דקות.
הערה: בשלב זה, כרומטין וחלבונים מקושרים. כמו למשל, הוא רעיל, מבצע את השלב הזה בתוך מכסה כימי ומשתמש בציוד הגנה אישי מתאים. - לאחר 10 דקות, להוסיף 0.47 mL של 1.25 M הפתרון גליצין בריכוז הסופי של 125 mM. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
הערה: גליצין מנטרל את היחידה למען. הפסקת הקישור - מנושף פורמלדהיד/גליצין/מדיה תרבותית. שטוף את התאים על ידי הוספת 4 מ ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) פעמיים. עבור תאים מושעה, להעביר את ההשעיה התא ל 15 מ"ל שפופרת חרוטי ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. ולהוסיף נפח בינוני אחד של PBS ו השעיה מלאה. חזור על שלב זה. להיפטר פסולת נוזלי כראוי מאז הם מכילים פורמלדהיד.
- הכנת ה-PBS המכיל פרוטאז ו פוספספטאז קוקטייל מעכבי (PIC) על ידי הוספת 1/100 נפח של 100x PIC כדי PBS. מתיף את הPBS ממנה ומוסיפים 1 מ"ל לכל מנה של PBS המכילה PIC. גרד את התאים ולהעביר את ההשעיה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. עבור תאים מושעה, פשוט להעביר את ההשעיה לצינור 1.5 mL.
- צינורות צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחזר את הגלולה התא. הסירי את ה-PBS לחלוטין באמצעות פיפטה. הקלט את מספר הטלפון בכל שפופרת ואחסן את הגלולה בתא-80 ° c.
- שמור על תאי VCaP ב-DME גלוקוז גבוה שיושלם עם 10% סרום העוברי (FBS) ב 37 ° c בחממה פחמן דו חמצני. תאי VCaP בגובה 4 x 106 תאים בשישה 6 ס"מ מנות 4 מ ל של מדיה תרבותית ותרבות במשך 3 ימים.
- פירוק תאים והעיכול MNase
הערה: עוצמת הקול הכימית בשלבים הבאים מבוססת על צינור אחד המכיל 6 x 106 תאים. התאם את אמצעי האחסון באופן פרופורציונלי בהתאם למספר התאים; כאשר צינור אחד מכיל 2 x 106 תאים, השתמש 100 μl של מאגר פירוק תאים שבב (שלב 2.2.1), מאגר העיכול MNase (שלב 2.2.3), ו מאגר דילול שבב (שלב 2.2.5), ו 10 μl של 0.5 M Edta (pH 8.0) (שלב 2.2.4).- הפשרת את הגלולה התא המאוחסן (תאים VCaP, המכיל 6 x 106 תאים לצינור) מוכן בשלב 2.1.7 על קרח. הכנת מאגר הפירוק של תא שבב בתוספת PIC על ידי הוספת 1/100 נפח של 100x PIC למאגר. הוסף 300 μL של מאגר פירוק התא של שבב שיושלם עם PIC והשהה מחדש את הגלולה ביסודיות. מערבולת הצינור עבור 15 s ו-מודות את ההשעיה על הקרח 10 דקות.
- צנטריפוגה ב 9,000 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c ולהסיר את supernatant לחלוטין. השהה מחדש את הגלולה ב-300 μL של מאגר העיכול MNase.
- לדלל MNase (2,000 ג'ל יחידת/μL) עם מאגר העיכול MNase לתת 50 היחידות ג'ל/μL. Add 0, 0.5, 1, 2, 4 μL של 50 יחידות ג'ל/μL של MNase ההשעיה ו מודטה ב 37 ° c עבור בדיוק 10 דקות, ערבוב על ידי היפוך כל 2.5 דקות.
הערה: טבלה 1 מציגה כמויות אופטימליות של MNase במספר קווי תאים. - הוסף 30 μL של 0.5 M EDTA (pH 8.0) כדי לסיים את העיכול MNase ואת מערבולת בקצרה. מודקון למשך 5 דקות על הקרח. צנטריפוגה ב 9,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ולהסיר את supernatant לחלוטין.
- הכנת מאגר דילול שבב בתוספת PIC על ידי הוספת 1/100 נפח של 100x PIC למאגר. השהה מחדש את הגלולה ב 300 μL של מאגר דילול שבב בתוספת PIC.
- Sonicate ההשעיה על הקרח באמצעות sonicator מצויד בדיקה מיקרוטיפ. השתמש בתנאים הsonication הבאים: משרעת 2, מעובד הזמן 15 s, דופק על 5 s, פעימה מתוך 30 s. קח 1 μL של ההשעיה ואת המקום על זכוכית שקופית ולהתבונן בהם באמצעות מיקרוסקופ. ודא שמבנה התא כמעט שבור.
הערה: איור 1A מציג מיקרוצילומים של נציג ההשעיה של התא vcap לפני ואחרי sonication. שלב זה הוא עבור שחרור כרומטין מתעכל לתוך סופרנטנט על ידי שבירת קרומים גרעיניים. יש לכוונן הגדרת צריכת חשמל לפחות מ-5% מהספק המירבי ולנסות sonication עבור 5 שלוש פעמים עם יותר ממרווח זמן של 30. אם שליטה בהספק זמין, להתאים את הגדרת הכוח ל 5 W ולעבד את הדגימות עבור סך 15 s כאמור לעיל כדי לתת כוח מוחלט של 70-75 J. בדוק אם מבנה התא מנותק כאמור לעיל. , אם לא מספיק. חזור על זה שוב התנאי המתואר לעיל מוחל למעשה על כל קווי התא שנבדקו. - צנטריפוגה ב 9,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, להעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה, ולשמור 20 μl של כרומטין מתעכל עבור שלב 2.3. אחסן את היתרה ב--80 ° c.
- היפוך הקישור, טיהור של דנ א, ניתוח של כרומטין מתעכל
- הוסף 75 μL של מים, 4 μL של 5 M הנאלים, ו 1 μL של הפרוטאינאז K לצינור בורג mL 1.5. הוסף 20 μL של כרומטין מתעכל מתוך תנאי העיכול שונים MNase מוכן בשלב 2.2.7 לצינורות המכילים מים, הנאל, ו-פרוטאינאז K. סגור את הכובע בחוזקה, לערבב לחלוטין, ו מעכלת את הצינור ב 65 ° c בלילה.
הערה: שלב זה מיועד להסרת הקשר בין חלבונים ו-DNA. - הכן שני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5-mL לכל תנאי. הוסף 100 μL של פנול: כלורופורם: isoamylalcohol (25:24:1) (PCI) עד אחד 1.5 mL שפופרת. הוסף 10 μL של 3 M סודיום אצטט (pH 5.2) ו 2 μL של הגליקוגן לצינור אחר.
הערה: השימוש בכלורופורם: isoamylalcohol אינו הכרחי7. הגדלת נפח עלול לגרום להתאוששות DNA נמוך לאחר משקעים אתנול8. - צנטריפוגה את הצינור המכיל כרומטין מתעכל משלב 2.3.1 בקצרה ולהוסיף 100 μL של PCI. סגרו את הכיפה בחוזקה, ומערבולת במרץ כדי ליצור אמולסיה. צנטריפוגה את הצינור במהירות מקסימלית (למשל, 20,000 x g) עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
- בזהירות לקחת את השלב העליון המכיל DNA ולהוסיף את הצינור המכיל PCI מוכן בשלב 2.3.2. מערבולת במרץ וצנטריפוגה את הצינור כמו צעד 2.3.3.
הערה: אם השלב התחתון נגוע, לצנטריפוגה את הצינור שוב, או להסיר את רוב השלב התחתון קודם, צנטריפוגה את הצינור, ולקחת את השלב העליון. - בזהירות לקחת את השלב העליון כפי שתואר בשלב 2.3.4 ולהוסיף את הצינור המכיל אצטט נתרן ו הגליקוגן מוכן בשלב 2.3.2. הוסף 250 μL של אתנול. מערבבים על ידי היפוך הדגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את הצינור במהירות מקסימלית (למשל, 20,000 x g) עבור 30 דקות ב 4 ° c.
הערה: דגירה של הפתרון בטמפרטורת החדר אינו משפיע על התאוששות DNA8,9. - . תאשר את החבילות בתחתית הצינור בזהירות להסיר את supernatant כדי לא להפריע את הגלולה ולהוסיף 500 μL של 70% אתנול. צנטריפוגה את הצינור במהירות מקסימלית (למשל, 20,000 x g) עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- הסר את הסופרנטנט לחלוטין ויבש את הגלולה במשך כ 5 דקות בטמפרטורת החדר. לפזר את הגלולה ב 20 μL של 10 מילימטר טריס · HCl/1 מ"מ EDTA (pH 8.0) (TE). למדוד ריכוז DNA באמצעות ספקטרוסקופיה UV.
- מערבבים 0.5 μg של DNA עם צבע לטעון ג'ל ולהחיל על 2% agarose ג'ל. אלקטרופורזה את הדגימות ב 100 V ב טריס-אצטט-EDTA מאגר עד הצבע הסגול הועבר לשליש של ג'ל וכתם ג'ל עם 0.5 μg/mL אתידיום ברומיד עבור 10 דקות. . צלם את הג
הערה: ראה איור 2 לפרטים.
- הוסף 75 μL של מים, 4 μL של 5 M הנאלים, ו 1 μL של הפרוטאינאז K לצינור בורג mL 1.5. הוסף 20 μL של כרומטין מתעכל מתוך תנאי העיכול שונים MNase מוכן בשלב 2.2.7 לצינורות המכילים מים, הנאל, ו-פרוטאינאז K. סגור את הכובע בחוזקה, לערבב לחלוטין, ו מעכלת את הצינור ב 65 ° c בלילה.
3. ChromatinImmunoprecipitation
- הכנת כרומטין מתעכל
- . הכן את הרכב עבור תאים חסיד, זרע 2-10 x 106 תאים לכל מנה ב 2 מנות (6 ס"מ או 10 ס"מ) לכל הטיפול ולאפשר לתאים לצרף לתחתית הכלים במשך יותר מיום אחד. עבור תאים מושעה, זרע ב 2 T25 מבחנות לכל קבוצת טיפול. התייחס לתאים כרצונך.
- קח צלחת אחת או בקבוקון מכל קבוצה ומספר תא ספירה כמתואר בשלב 2.1.2. הכינו כרומטין מקושרים כאמור בשלבים 2.1.3-2.1.7.
- Lyse את הגלולה התא ואת העיכול MNase כפי שמתואר בשלבים 2.2.1-2.2.7. השתמש בכמות האופטימלית של MNase לתקציר כרומטין כפי שנקבע בשלב 2. אחסן כרומטין מתעכל ב-80 ° c.
- הפוך מרובי קישור 20 μL של כרומטין מתעכל וטיהור DNA כפי שמתואר בשלב 2.3.8. למדוד ריכוז DNA כמתואר בשלב 2.3.7. אלקטרופורזה הדגימות ב 2% agarose ג'ל כדי לבדוק את הגודל של כרומטין מתעכל כפי שהוזכר בשלב 2.3.
הערה: ריכוז ה-DNA זהה לזה של מאוחסן כרומטין מתעכל הכין בשלב 3.1.3. - לדלל מדגם הפוך כרומטין הפוכה מתעכל משלב 3.1.4 כדי לתת 10 ng/μL עם מים ולדלל באופן סדרתי כדי להפוך ריכוזים של 1, 0.1, ו 0.01 ng/μL. Store ב-20 ° c.
הערה: דגימות אלה משמשות לתקני PCR בזמן אמת.
- Immunoprecipitation
הערה: בשלבים 3.2-3.5 של פרוטוקול, anti-triמתילated H3 ליזין 4 (H3K4me3) תפוסת בתאי vcap נקבעת. ראה גם איור 3.- הפשרת כרומטין מתעכל משלב 3.1.3. . שמור את כל הדגימות על הקרח
- הכנת מאגר דילול שבב בתוספת PIC על ידי הוספת 1/100 נפח של 100x PIC למאגר. לדלל כרומטין מתעכל כדי 5 μg/500 μL עם מאגר דילול שבב בתוספת PIC. הכינו 1,000 μL פלוס תוספת עבור (1) IP עם Ig החיסונית לא (שליטה IgG), (2) IP עם H3K4me3.
- הוסף 5 μL של 5 μg/500 μL כרומטין מתעכל ל-1.5 mL שפופרת בורג כדוגמת קלט (1% של IP אחד). אחסן את המדגם ב-80 ° c.
- הוסף 500 μL כל אחד מתוך 5 μg/500 μL כרומטין מתעכל ל-1.5 מ ל צינור בורג כדוגמת IP. להוסיף 2 μg של נוגדן לצינור. סגרו את המכסה ואת הצינור בתוך 4 ° c לילה עם ערבוב עדין באמצעות פלטפורמת נדנדה.
הערה: למרות הסכום האופטימלי הנוגדן צריך להיקבע באמפירי, 2 μg לכל IP מומלץ בהתחלה. - הוסף 30 μL של שבב כיתה חלבון כיתה G מגנטית חרוזים לכל IP. מודאת הצינור ב 4 ° c עבור 2 h עם ערבוב עדין באמצעות פלטפורמת נדנדה.
הערה: אין צורך לשטוף מראש של חרוזים מגנטיים.
- כביסה מורכבות חיסונית והיפוך הקישור
- סובב את השפופרת משלב 3.2.5 בקצרה. מניחים את הצינור בארון פוליאתילן המכיל מגנטים neodinium עבור 1 דקות. בזהירות להסיר את סופרנטנט על ידי השאיפה.
- הוסף 0.5 mL לכל שפופרת של מלח נמוך המערכת החיסונית לשטוף מאגר. פזר את החרוזים על ידי הקשה בעדינות או לקצר את השפופרת. מודקון את הצינור ב 4 ° צ' עבור 5 דקות עם ערבוב עדין באמצעות פלטפורמת נדנדה. לאחר 5 דקות, חזור על שלב 3.3.1.
- הוסף 0.5 mL של מלח גבוה החיסון מורכבים מאגר לשטוף לכל צינור. להתפזר ולשטוף את החרוזים כמו צעד 3.3.2. לאחר כביסה, חזור על שלב 3.3.1.
- הוסף 0.5 mL של המערכת החיסונית LiCl לשטוף מאגר לכל צינור. להתפזר ולשטוף את החרוזים כמו צעד 3.3.2. לאחר כביסה, חזור על שלב 3.3.1.
- הצב את הצינור בארון תקשורת מגנטי במשך 1 דקות. הסר את הסופרנטנט הנותר לחלוטין.
- הוסף 150 μL של מאגר הימנעות לשפופרת. מערבולת הצינור לפזר את החרוזים לחלוטין. סגור את הכובע ואת הצינור ב 65 ° c עבור 30 דקות, ערבוב ידי היפוך או vortexing כל 5 דקות לפזר את החרוזים ביסודיות.
- במהלך הדגירה, להכין צינור ברגים 1.5 mL ולהוסיף 6 μL של 5 M הנאל ו 2 μL של הפשרת מדגם הקלט 1% הכין בשלב 3.2.3. הוסף 150 μL של מאגר הימנעות, 6 μL של 5 M הנאל ו 2 μL של מדגם K עד 1% לדגימת קלט.
- . אחרי הדגירה, הסתובב בצינור מניחים את הצינור בארון תקשורת מגנטית עבור 1 דקות ולהעביר את supernatant לצינור בורג המכיל הנאל ו פרוטאינאז K הכין בשלב 3.3.7.
- סגור את הכובע ואת המערבולת כל הדגימות והקלט לערבב לחלוטין. מודאת הצינור ב 65 ° c בלילה.
- טיהור דנ א
- הכן את הצינור כמתואר 2.3.2 ולהוסיף 150 μL של PCI במקום 100 μL. בצינור אחר, להוסיף 12 μL של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) ו 2 μL של הגליקוגן.
- . תסיר את השפופרת מהאינקובטור לסובב את הצינור ולהוסיף 150 μL של PCI.
- מערבולת נמרצות את הצינור כדי ליצור אמולסיה. צנטריפוגה את הצינור במהירות מקסימלית (g. 20,000 x g) עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
- בזהירות להעביר 140 μL של השלב העליון לצינור המכיל PCI הכין בשלב 3.4.1. חזור על שלב ה3.4.3.
הערה: ראה גם הערה בשלב 2.3.4. - בזהירות להעביר 120 μL של השלב העליון לצינור המכיל אצטט נתרן ו הגליקוגן מוכן בשלב 3.4.1.
הערה: ראה גם הערה בשלב 2.3.4. - הוסף 300 μL של אתנול. מערבבים על ידי היפוך הדגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה את הצינור במהירות מקסימלית (למשל, 20,000 x g) עבור 30 דקות ב 4 ° c. לשטוף את הגלולה כמתואר בשלב 2.3.6.
- לאחר ייבוש הגלולה כמתואר בשלב 2.3.7, לפזר את הגלולה ב 50 μL של TE. חנות ב-20 ° c.
- זיהוי שברי דנ א באמצעות PCR בזמן אמת
- הפשרת הדגימות הבאות: (1) IP עם IgG Control, (2) IP עם anti-H3K4me3, (3) 1% מדגם הקלט. הפשרה גם 4 מינונים של סטנדרטים שהוכנו בשלב 3.1.5 (סה כ 7 דגימות).
הערה: השתמש בתקנים מאותה קבוצה כדי לכמת את כמויות ה-DNA בדגימות קלט ו-IP. - הפוך את פתרון ה-PCR לעבודה עבור 8 דגימות. לערבב 40 μL של 2x בזמן אמת ה-PCR supermix, 8 μL כל אחד 4 μM קדימה והפוך התחל, ו 8 μL של מים.
הערה: תערובת PCR אחת מכילה 5 μL של 2x בזמן אמת של ה-PCR supermix, 1 μL כל אחד 4 μM קדימה והפוך התחל, ו-1 μL של מים. רצפים פריימר מפורטים בטבלה 2. - מספר 8 μL של הפתרון העובד של ה-PCR לבאר אחת של צלחת ה-PCR. הוסף 2 μL של דגימות משלב 3.4.8 או מתקנים משלב 3.1.5.
- אטום את לוחית ה-PCR והפעל את ה-PCR בתנאים הבאים: 1) 95 ° צ' עבור 3 דקות עבור הדנטורציה הראשונית, 2) 95 ° צ' עבור 10 עבור הדנטורציה, 3) 56 ° צ' עבור 30 s עבור ריפוי, 4) 72 ° c עבור 30 עבור שלוחה ואיסוף נתונים , חזור על שלבים 2) עד 4) עבור 55 מחזורים. לאחר הרכיבה על אופניים, למדוד עקומת ההיתוך של המוצר PCR. . נתח את הנתונים
הערה: נתונים גולמיים עבור איור 3 מוצגים בטבלה 3. חישוב כמות התחלתי (SQ) של הדגימות באמצעות עקומה סטנדרטית. הכפל SQ ב-1% קלט על-ידי 100 כדי לכוונן משטח כניסה של 1% מדגם קלט ל-IP אחד כדי להעניק כניסות מותאמות ל-SQ (Eq .1). חילוק SQ בדגימת IP על-ידי הזנת SQ בקלט כדי לתת% ערך קלט (שיטת הקלט באחוזים, Eq .2). כדי לחשב העשרה קיפול, לחלק SQ ב-IP עם anti-H3K4me3 על ידי SQ ב-IP עם השליטה IgG (שיטת העשרה הקיפול, Eq .3).
כניסת משטח לקלט = (SQ ב-1%) x 100 (1)
אחוז קלט של H3K4me3 = 100 x (מ ר ב-IP עם anti-H3K4me3)/(מותאם מ"ר בכניסה) (2)
העשרת מקפלים של H3K4me3 = (מ ר ב-IP עם anti-H3K4me3)/(מ ר ב-IP עם השליטה IgG) (3)
- הפשרת הדגימות הבאות: (1) IP עם IgG Control, (2) IP עם anti-H3K4me3, (3) 1% מדגם הקלט. הפשרה גם 4 מינונים של סטנדרטים שהוכנו בשלב 3.1.5 (סה כ 7 דגימות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עיכול כרומטין הוא אחד השלבים החשובים לצורך שיטת השבב. השתמשנו בפקודה MNase כדי לעכל כרומטין כדי לקבל תערובת של נוקלאוטיי מיעוט. בשלב העיכול של MNase, MNase יכול לעבור את הקרום הגרעיני לעכל כרומטין. עם זאת, כרומטין מתעכל לא יכול לעבור את הקרום נשאר גרעינים. כדי לשחרר את כרומטין מתעכל מן הגרעינים, sonication קצר יש צורך. איור 1A מראה מיקרוצילומים לפני ואחרי sonication של השעיית תא vcap. ללא sonication, מבנה התא נשאר שלם, המציין כי כרומטין נוכח גרעינים. Sonication קצרה שוברת את מבנה התא, ובדיקת התאים מיקרוצילומים מסייעת לקבוע את התנאים הsonication הקצרים. אנו גם מייצגים דוגמאות אחרות עבור sonication קצרים בתאי 293T (איור 1B) האדם B-cell לוקמיה לימפובלסטית חריפה קו, בתאי אהרה (איור 1b) ואת הסרטן הערמונית האדם קו התא, Lncap (איור 1b).
איור 2A מראה פיצול כרומטין לאחר הטיפול עם כמויות שונות של MNase בתאי vcap. התייחסו 6 x 106 כדורי תא vcap מקושרים עם 0, 50, 100, 200 ג'ל יחידות של MNase ב 300 μl של מאגר העיכול עבור 10 דקות ב-37 ° c. לאחר טיהור של כרומטין מתעכל, 500 ng של ה-DNA נותחו על 2% agarose ג'ל מוכתם עם אתידיום ברומיד. ללא הוספת MNase, דפוס הכתם עם משקל מולקולרי גבוה מאוד הופיע (ליין 1). התוספת של MNase נתן דפוס סולם (N; מונונואומין יחידה), מראה כי MNase מעכל internucleosome (נתיבים 2-5). איור 2B מראה תבנית עיכול לא נאותה. עיכול מופרז הביא בעיקר לייצור מונונולי (איור 2B, ליין 7). אנחנו צריכים למצוא את התנאים הנכונים המייצרים שברי כרומטין עד 900 bp (אחד עד חמישה נוקלאוטיזומים; למשל, ליין 5).
כדי לבדוק אם שיטת השבבים מבוצעת כראוי, חיוני שיהיו בעלי פקדים מתאימים באותו האופן. עבור immunoprecipitation, האיגים שאינם חסינים מאותו מינים כמו הנוגדנים של הריבית משמשים כפקד המראה איגוד ספציפי לאותו אזור (ראה דיון). בנוסף, מומלץ למדוד את הכריכה של החלבונים (תפוסת) באזורים חיוביים ושליליים. זה התקבל בהרחבה כי תפוסת H3K4me3 מופץ בין כ קילובייט בסיס (kb) במעלה הזרם של שעתוק אתרי התחל10,11. מדדנו H3K4me3 תפוסת הגנום AR הפורש כ 20 kb במעלה דרך 12 kb במורד האתר התחלה של שעתוק AR (AR-TSS) בתאים AR-חיוביים VCaP. דפוס העיכול של כרומטין בתאי VCaP המשמשים בניסוי זה הוצג באיור 3A, המציין את העיכול הנכון של כרומטין. התפוסה הגבוהה ביותר של H3K4me3 נצפתה סביב AR-TSS ו 0.5 kb ו-1 kb במעלה של AR-TSS (איור 3B). כל עוד הגנים פעילים מבחינה מבצעית, האזור יכול להיות "איזורים חיוביים". לעומת זאת, אזורים הממוקמים ב -19 kb ו-8 kb במעלה ו-12 kb במורד הזרם AR-TSS, היתה תפוסה קטנה של H3K4me3 (איור 3B), המציינת כי ניתן להשתמש באלה כ"אזורים שליליים".
זה הוכח כי האנדרוגן מגביר את התפוסה RNA פולימראז II ביזם ה-PSA ומשפר בתאי lncap באמצעות הרואד כרומטין על ידי sonication12,13. לפיכך, בדקנו את תוקפו של הפרוטוקול שלנו על ידי מדידת הפעילות הפעילה RNA פולימראז II (כלומר-RNA פולימאז II ב סרין 5; פוליי (pS5)) בתאים. ביצעו את אותו הניסוי כדי לבדוק את הצורה של השיטה שלנו. תאים LNCaP היו מתורבתים בינונית מורעב סטרואידים במשך 3 ימים ומגורה עם רכב או 10 ננומטר דיהידרוטסטוסטרון (DHT) עבור 4 h. התפוסת פעיל RNA פולימראז II נמדד על ידי immunoprecipitation עם אנטי PolII (pS5), ואחריו ה-PCR בזמן אמת. איור 4A מראה דפוס העיכול החוזר של כרומטין מתאי lncap בשלושה ניסויים עצמאיים. כפי שמוצג באיור 4B, DHT גדל באופן משמעותי את התפוסה של פוליאני (pS5) במקדם ה-PSA ומשפר בעת שימוש בשיטת הקלט באחוזים. אנו גם חישב את התפוסה באמצעות שיטת העשרה קיפול (איור 4C) ומצא כי אין הבדל משמעותי בפוליאני (pS5) במקדם ה-PSA נצפתה עם או בלי טיפול DHT. DHT לא השפיע על האכלוס ביזם "שינד" כפי שפורסם בעבר14. וחשוב מכך, הנתונים שלנו היו דומים לזה שהתקבל מsonication-כרומטין בדוגמאות12,13.
איור 1: מיקרותצלומים מייצגים של כדורי תא מקושרים לפני ואחרי sonication. כדורי VCaP מקושרים (A), 293T (ב), אהרה (C) ו-lncap (D) כדוריות התאים טופלו mnase, וכדורי היו מושהה מחדש במאגר דילול שבב. לפני ואחרי sonication, התמונות של השעיות צולמו. סרגל קנה מידה = 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הנציגה המייצגת ג'ל לניתוח של כרומטין מעוכשית. (א) כרומטין מקושרים הוכן מתאי vcap ומתעכל בכמויות שונות של MNase כמתואר בשלב 2.2. כרומטין מתעכל הפוכה לאחור, מטוהרים, ונותחו ב 2% ג'ל צמח. N יחידה (ב) כרומטין של תאים vcap היה מתעכל עם 250 יחידות ג'ל של MNase עבור 2 x 106 תאים ב 37 ° צ' עבור 20 דקות וניתח (כפי שמתואר ב). כמויות גדולות יותר של MNase ושעות דגירה יותר גרמו לעיכול כמעט מוחלט של כרומטין ליצור מונונואוזומים (150 bp). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: H3K4me3 תפוסת הגנום AR. כרומטין מתעכל הוכנו מתאי VCaP. (א) ניתוח העיכול נותח באמצעות ג'ל שנוצר. (ב) 5 μg של כרומטין מתעכל היה immunoprecipitated עם 2 μg של ארנב נורמלי igg או Anti-H3K4me3 הנוגדן כפי שהוזכר בשלב 3.1 ו-step 3.2. מכלולי החיסון נשטפו והמריאו מחרוזים והפוכים מקושרים. שברי דנ א מטוהרים נותחו באמצעות PCR בזמן אמת עם סטים פריימר המפורטים בטבלה 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אנדרוגן מוגברת פעיל RNA פולימראז II תפוסת הקדם PSA ומשפר. לסטרואידים מורעבים תאים LNCaP טופלו עם או בלי 10 ננומטר DHT עבור 4 h, וכרומטין מתעכל היה מוכן. (א) דפוס העיכול של כרומטין מתאי האינקאפ בשלושה ניסויים עצמאיים. (ב,ג) כרומטין מתעכל היה מimmunoprecipitated עם נוגדן אנטי פוליאני (pS5), ושברי DNA היו מטוהרים כפי שתוארו עבור איור 3. התפוסה הפעילה של RNA פולימראז II במקדם ה-PSA, משפר, ומקדם המקדם של מערכת המידע כקלט באחוזים (B) והעשרת הקיפול (C) נקבע באמצעות PCR בזמן אמת עם הסטים המפורטים המפורטים בטבלה 2. התוצאות המוצגות משמעות ± SE של שלושה ניסויים עצמאיים. (*); p < 0.05, (* *); p < 0.01 לעומת הטיפול 0 ננומטר הDHT. NS לא משמעותי לעומת 0 nM DHT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| קו תאים | יחידות ג'ל לכל 2,000,000 תאים ב 100 μL של מאגר, 37 ° צ' עבור 10 דקות |
| כיפה | 267 |
| ווקאפ | 66.7 |
| 293T | 450 |
| מיכל שלמה | 134 |
| מיכל ברונוביץ | 400 |
טבלה 1: כמות אופטימלית של מיקרוקוקאל נוקלאז בקווי תאים שונים. הערך מייצג את כמויות MNase עבור 2 x 106 תאים ב-100 μl של מאגר, 37 ° c עבור 10 דקות.
| שם תחל | רצף | |
| AR (-18.8 kb) | FWD | מיכאל שגיא |
| REV | מיכל הגנה | |
| AR (-8.8 kb) | FWD | מוטי שגיא |
| REV | מיכל ברקת | |
| AR (-8.2 kb) | FWD | מדריך כמוסות |
| REV | המנון אתיופיה | |
| AR-TSS (0 kb) | FWD | GCAAACTGTTGCATTTGCTC |
| REV | מיכל האור | |
| AR (0.6 kb) | FWD | מיכל ברוך |
| REV | מיכל הגנה | |
| AR (+ 1.0 kb) | FWD | מיכל האור |
| REV | כמוסות מגנט | |
| AR (+ 11.8 kb) | FWD | תג הגנה |
| REV | כמוסות מגנט | |
| יזם PSA | FWD | מיכל בוגנקי |
| REV | מיכל ברקת | |
| משפר PSA | FWD | מיכל ברקת |
| REV | ברוך ש, לארג | |
| למעלה | FWD | מוזיאון הגנה |
| REV | המנון מגאגאג |
טבלה 2: רצפים פריימר מזווג המשמשים עבור השימוש במעבד שבב.
| AR (-18.8 kb) | נגזרותיהם | מ ר | מותאם ל-IP אחד | % קלט | העשרה מקפלים |
| 1% הזנה | 23.49 | 0.815 | 81.5 | 100 | |
| IP עם שליטה IgG | 27.68 | 0.051 | 0.051 | 0.062 | 1 |
| IP עם anti-H3K4me3 | 22.48 | 1.590 | 1.590 | 1.951 | 31.4 |
| AR (-8.8 kb) | נגזרותיהם | מ ר | מותאם ל-IP אחד | % קלט | העשרה מקפלים |
| 1% הזנה | 23.22 | 0.586 | 58.6 | 100 | |
| IP עם שליטה IgG | 26.81 | 0.052 | 0.052 | 0.088 | 1 |
| IP עם anti-H3K4me3 | 23.74 | 0.414 | 0.414 | 0.706 | 8.0 |
| AR (-8.2 kb) | נגזרותיהם | מ ר | מותאם ל-IP אחד | % קלט | העשרה מקפלים |
| 1% הזנה | 23.19 | 0.643 | 64.3 | 100 | |
| IP עם שליטה IgG | 26.99 | 0.048 | 0.048 | 0.075 | 1 |
| IP עם anti-H3K4me3 | 23.63 | 0.477 | 0.477 | 0.742 | 9.9 |
| AR-TSS (0 kb) | נגזרותיהם | מ ר | מותאם ל-IP אחד | % קלט | העשרה מקפלים |
| 1% הזנה | 25.06 | 0.657 | 65.7 | 100 | |
| IP עם שליטה IgG | 28.63 | 0.050 | 0.050 | 0.077 | 1 |
| IP עם anti-H3K4me3 | 20.70 | 15.064 | 15.064 | 22.944 | 299.8 |
| AR (0.6 kb) | נגזרותיהם | מ ר | מותאם ל-IP אחד | % קלט | העשרה מקפלים |
| 1% הזנה | 23.86 | 0.716 | 71.6 | 100 | |
| IP עם שליטה IgG | 26.67 | 0.106 | 0.106 | 0.147 | 1 |
| IP עם anti-H3K4me3 | 19.15 | 17.787 | 17.787 | 24.840 | 168.6 |
| AR (+ 1.0 kb) | נגזרותיהם | מ ר | מותאם ל-IP אחד | % קלט | העשרה מקפלים |
| 1% הזנה | 23.51 | 0.730 | 73.0 | 100 | |
| IP עם שליטה IgG | 25.94 | 0.125 | 0.125 | 0.171 | 1 |
| IP עם anti-H3K4me3 | 19.06 | 18.486 | 18.486 | 25.335 | 147.8 |
| AR (+ 11.8 kb) | נגזרותיהם | מ ר | מותאם ל-IP אחד | % קלט | העשרה מקפלים |
| 1% הזנה | 24.54 | 0.876 | 87.6 | 100 | |
| IP עם שליטה IgG | 29.14 | 0.033 | 0.033 | 0.037 | 1 |
| IP עם anti-H3K4me3 | 24.47 | 0.918 | 0.918 | 1.048 | 27.97 |
שולחן 3: נתונים גולמיים מניתוח PCR כמותי לאיור 3. Cq: מספר מחזור הסף, SQ: כמות מתחילה מחושבת באמצעות עיקול רגיל, מותאם ל-IP אחד: הכפל SQ ב-1% קלט על-ידי 100 כנפח מדגם 1% של IP אחד משמש ל-PCR,% Input: חילוק בדגימת IP על-ידי כניסת SQ בקלט, העשרה מקפלים : לחלק SQ ב-IP עם anti-H3K4me3 על ידי SQ ב-IP עם IgG שליטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שsonication משמש בדרך כלל להשגת כרומטין מפוצלים, היא גוזלת זמן ומסורבלת כדי לזהות תנאים שאינם משתמשים. בפרוטוקול זה, השתמשנו בעיכול MNase מכיוון שעיכול האנזים צריך להיות קל יותר לזהות תנאים הניתנים לשימוש. צעד קצר sonication לאחר העיכול MNase (ראה שלב 2.2) היה הכרחי כדי לשבור את קרום התא ולשחרר את כרומטין מתעכל. לכן, הכוח הsonication בפרוטוקול שלנו צריך להיות נמוך ככל האפשר. אנו משתמשים באותם תנאים sonication עבור כל התאים שאנו המועסקים (ראה איור 1 ושולחן 1) כדי לקבל התמוטטות מלאה של קרום.
העיכול של כרומטין על ידי MNase הוא צעד קריטי בפרוטוקול שלנו, ולכן יש לנו מאמצים גדולים כדי לייעל את התנאים לעיכול של כרומטין בתוך תאים. פעילות העיכול נקבעת לפי כמויות האנזימים והמצע (כרומטין) וזמן דגירה. בנוסף, מאז הפלואידיות משתנה בין תאים שונים, יש לזהות את התנאים האופטימליים עבור העיכול MNase עבור כל סוג תא. הוקמה לאחר, את אותם התנאים ניתן ליישם ללא קשר לטיפולים תאים. אנו תמיד לבדוק את דפוסי העיכול כרומטין בכל ניסוי כדי להבטיח את דפוסי העיכול מתאימים שבב assays, כפי שמוצג באיור 2A, ליין 5.
גורמים מסוימים משפיעים על התוצאות של שבב assays. חשוב להשתמש בכמות הנכונה של כרומטין מתעכל בפרוטוקול שלנו. בפרוטוקולים רבים, מספר התאים אך לא את הכמות של כרומטין עבור IP אחד מוצג15,16. התנאים הניסיוניים הללו מייצרים הבדלים גבוהים בכמות הכרוטין בין התאים בשל הבדלי הפלואידיות. אנו משתמשים 5 μg של כרומטין ו 2 μg של נוגדן לכל אחד IP בתוך הסדר, ולכן הפרוטוקול שלנו הוא יותר פשוט וברור יותר מאשר פרוטוקולים אחרים, למרות הסכומים האופטימליים של נוגדנים עבור IP עשוי להיות צורך. גם מבחר הנוגדנים חשוב; השתמש בנוגדנים מאומת של שבב.
קיימות שתי שיטות לניתוח נתוני שבב ה-PCR: שיטת הקלט של אחוז ושיטת ההעשרה של הקיפול. בשיטת הקלט באחוזים, אותות מדגימות IP מחולקים באמצעות אותות מהכרוטין הכוללת בדגימת ה-IP. בשיטת העשרת הקיפול, אותות מ-IP עם נוגדן ספציפי כגון H3K4me3 מחולקים על ידי אותות מ-IP עם IgG בקרת. השיטה המאוחרת היא ישימה רק כאשר אותות מ-IP עם הפקד IgG הם דומים ומנוסחים ביעדים מרובים או מטרות זהות תחת תנאים פיזיולוגיים שונים. בפועל, רמות האות משתנות כך שערך העשרה הקיפול כולל שינויים גבוהים כפי שמוצג באיור 4C. לכן, איננו ממליצים להשתמש בשיטת ההעשרה לקיפול כדי לייצג נתוני שבב בשיטה שלנו.
MNase מעדיף את הסביבה ' פתוח ' והוא אינו נגיש למבנה של הטרוכרומטין, הרומז כי העיכול MNase עשוי לייצר קצת הטיה. דווח כי העשרת מערכות הכרומטין בתחומי כרומטותין שונים בין sonication-שרות לבין ההכנות לכרומטין המתעכלים17. כך, העיכול MNase בתוך שיטת השבבים לא יכול להיות מתאים לניתוח מולקולות גרעיניות הקשורים במבנה כגון lamin A/C ו-מיוחד ב-עשיר מחייב חלבון כריכה 1 (SATB1).
בפרוטוקולים של שיטת שבבים המיועדים עבור מיקרוarray במורד הזרם (שבב על שבב) או רצף (שבב-seq) ניתוחים, RNase משמש במהלך שלב טיהור ה-DNA, אם כי לא בפרוטוקולים המיועדים ל-PCR ניתוח18. לא בדקנו אם הפרוטוקול שלנו תואם לניתוח שבב-על-שבב ו-ChIP-seq, אך אנו מניחים שהפרוטוקול שלנו ישים כאשר מטפלים בדגימות עם RNase. אם הטיפול RNase נדרש, להשתמש 2 μL של 10 מ"ג/mL DNase-חינם RNase A במקום פרוטאינאז K בשלב 3.3 ו דגירה ב 65 ° c לילה. לפני טיהור ה-DNA (שלב 3.4), להוסיף פרוטטינואז K ו-דגירה עבור תוספת 1 h ב 60 ° c.
אנו באופן קבוע לבצע שבב בחני עם שונה וגורמים שעתוק באמצעות השיטה המתוארת כאן הראו כי שיפוץ כרומטין פקטור, בתחום האינטראקציה העשיר 5b, ויסות הביטוי הגן AR על ידי שינוי התפוסה של polii ( pS5) ו H3K4me3 ביזם AR19. אנו מאמינים כי הפרוטוקול שלנו הוא מבחינה טכנית קל יותר מאשר שבב אחר והוא מקובל במחקר בביולוגיה מולקולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי Genentech תמלוגים על עיר התקווה. עבודה זו אינה נתמכת בכללותה או בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2x iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp DNA ladder | New England Biolabs | N3236S | |
| Agarose | Research Product International | A20090 | |
| Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| ChIP-grade protein G magnetic beads | Cell signaling technology | 9006S | |
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer | Millipore Sigma | 20-153 | Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl. |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Electropheresis grade |
| Glycogen | Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl. |
| Histone H3K4me3 antibody (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 | Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1. |
| Low Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-154 | Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 well) | Millipore Sigma | 20-400 | Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| Micrococcal nuclease | New England Biolabs | M0247S | comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinase K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Real-time PCR system | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim | 100155 | Electropheresis grade |
| sodium acetate | Millipore Sigma | S5636 | |
| Sonicator equipped with a microtip probe | QSONICA | Q700 | Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine. |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
References
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
- Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
- Collas, P.
- Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K.
- Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L.
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
- Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
- Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
- Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
- Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
- Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).
