Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59375
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Genregulation. Das Verfahren birgt jedoch Schwierigkeiten bei der Erlangung reproduzierbarer Chromatinfragmentierung durch mechanisches Scheren. Hier bieten wir ein verbessertes Protokoll für einen ChIP-Assay mit enzymatischer Verdauung.

Abstract

Um zelluläre Phänotypen in Organismen auszudrücken, führen lebende Zellen die Genexpression entsprechend aus, und Transkriptionsprogramme spielen eine zentrale Rolle bei der Genexpression. Die zelluläre Transkriptionsmaschinerie und ihre Chromatin-Modifikationsproteine koordinieren die Transkription. Zur Analyse der Transkriptionsregulation auf molekularer Ebene stehen mehrere experimentelle Methoden wie elektrophoretische Mobilitätsverschiebung, transienter Reporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zur Verfügung. Wir beschreiben einen modifizierten ChIP-Assay im Detail in diesem Artikel wegen seiner Vorteile bei der direkten Darstellung von Histonmodifikationen und den Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA in Zellen. Einer der wichtigsten Schritte in einem erfolgreichen ChIP-Assay ist das Chromatinscheren. Obwohl Beschallung häufig zum Scheren von Chromatin verwendet wird, ist es schwierig, reproduzierbare Bedingungen zu identifizieren. Anstatt Chromatin durch Beschallung zu scheren, nutzten wir die enzymatische Verdauung mit Mikrokokkennuclease (MNase), um reproduzierbarere Ergebnisse zu erzielen. In diesem Artikel stellen wir ein einfaches ChIP-Assayprotokoll mit MNase bereit.

Introduction

Die Genexpression in Säugetierzellen ist eng und dynamisch reguliert, und die Transkription ist einer der wichtigsten Schritte. Die Gentranskription wird hauptsächlich durch Transkriptionsfaktoren und Histonen reguliert. Ein Transkriptionsfaktor ist ein Protein, das an bestimmte DNA-Sequenzen bindet und die Gentranskription steuert. Diese Faktoren fördern oder hemmen entweder die Rekrutierung von RNA-Polymerase II (PolII), die die mRNA-Synthese aus genomischer DNA als Vorlage1initiiert. Histonmodifikationen wie Acetylierung und Methylierung von Histonschwanzrückständen wirken sich positiv und negativ auf die Gentranskription aus, indem sie die Chromatinstruktur ändern2. Da Veränderungen der Genexpression den zellulären Kontext beeinflussen, ist es wichtig, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, durch die die Transkription reguliert wird.

Bis heute stehen mehrere Methoden zur Untersuchung der Regulierung der Gentranskription zur Verfügung. Elektrophoretic mobility shift assay (EMSA), auch Gel shift Assay genannt, wird zur Analyse einer Protein-DNA-Interaktion3verwendet. Ein Kernextrakt aus gefährdeten Zellen wird mit einem radioaktiven Isotop (z. B. 32P)-markierten DNA-Sonde inkubiert und auf einem Polyacrylamidgel elektrophorisiert. Sein Autoradiogramm zeigt, dass der DNA-Protein-Komplex langsamer wandert als die Sonde in einem Gel. In Gegenwart eines Antikörpers gegen das Protein wandert der DNA-Protein-Antikörper-Komplex langsamer in ein Gel als der DNA-Protein-Komplex. Dieses superversetzte Band zeigt eine spezifische Bindung zwischen DNA und Protein. EMSA bestimmt jedoch nur eine spezifische DNA-Protein-Interaktion in einem zellfreien System, und daher bleibt unbekannt, ob die Interaktion die Transkription in lebenden Zellen steuert. Der transiente Reporter-Assay, gemeinhin als Luziferase-Reporter-Assay bezeichnet, wurde entwickelt, um die Genexpressionsregulation in Zellen zu thematisieren. Typischerweise wird eine vorgelagerte genomische Region eines Gens von Interesse in ein Reporterplasmid eingefügt, vorübergehend in Zellen transfiziert, und die Reporteraktivität wird gemessen. Eine Vielzahl von Deletionsmutanten ermöglicht die Identifizierung von Regionen, die für die Genregulation verantwortlich sind. Obwohl ein Reporter-Assay ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung von Transkriptionsfaktoren und zur Bindung von DNA-Sequenzen zur Steuerung der Transkription ist, hat diese Methode einen großen Nachteil, da ein Reporterplasmid frei von Chromatinstruktur ist und nicht "real" widerspiegelt. Transkriptionsmaschinen. Darüber hinaus können Änderungen an Histonmodifikationen nicht vom System bestimmt werden.

Die Entwicklung der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) Methode basierte auf Jackson und Chalkleys Berichten, dass "ganze Zelle" Fixierung mit Formaldehyd konserviertchromatin Struktur4,5. Seitdem wurden viele verwandte Techniken entwickelt und verbessert6. In ChIP-Assays werden Zellen mit Formaldehyd fixiert, um DNA und Proteine miteinander zu vernetzen. Das Chromatin wird fragmentiert und dann mit Antikörpern von Interesse immunpräzipiert. Der Immunkomplex wird gewaschen und die DNA gereinigt. Die PCR-Amplifikation mit Primern, die auf eine bestimmte Region des Genoms ausgerichtet sind, zeigt die Belegung von Proteinen, die für das Genom von Interesse sind.

Obwohl ChIP ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um die Wechselwirkungen von Proteinen wie Transkriptionsfaktoren und modifizierten Histonen mit DNA zu identifizieren, bringt die Methode einige Schwierigkeiten mit sich, wie z. B. einen Chromatinfragmentierungsschritt, in der Praxis. Beschallung wurde weit verbreitet für das Scheren von Chromatin verwendet; es ist jedoch umständlich, reproduzierbare Bedingungen zu identifizieren. Die Mikrokokken-Nuklease (MNase) ist eine alternative Methode zum Chromatinscheren. MNase ist eine Endo-Exonuklease, die doppelsträngige, einsträngige, kreisförmige und lineare DNA und RNA verdaut. Es ist relativ einfach, die Bedingungen, einschließlich der Mengen an Chromatin und Enzym, Temperatur und Inkubationszeit, für eine optimale Chromatinfragmentierung zu bestimmen. Wir haben die bestehenden Protokolle modifiziert und vereinfacht und eine einfache und reproduzierbare Methode etabliert. Dieses Papier stellt das Protokoll für einen ChIP-Test mit MNase in Säugetierzellen bereit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Herstellung von Reagenzien

  1. Machen Sie 18,5% Paraformaldehyd (PFA) Lösung. Fügen Sie 0,925 g PFA, 4,8 ml Wasser (im gesamten Protokoll ultrarifiziertes Wasser verwenden) und 35 l von 1 M KOH in einem 50 ml konischen Kunststoffrohr hinzu. Schließen Sie die Kappe fest und erhitzen Sie das Rohr in einem 400-600 ml Glasbecher, der ca. 200 ml Wasser enthält, mit einer Mikrowelle. Entfernen Sie das Rohr, bevor das Wasser zu kochen beginnt, und wirbeln Sie das Rohr, um PFA aufzulösen. PFA auf Raumtemperatur abkühlen lassen und auf Eis lagern.
    HINWEIS: Wiederholen Sie das Erhitzen und Mischen, bis sich PFA vollständig auflöst. Bereiten Sie die PFA-Lösung unmittelbar vor der Vernetzung vor (Schritt 2.1.3).
  2. Machen Sie 1,25 M Glycinlösung. 14,07 g Glycin in 150 ml Wasser auflösen und durch einen 0,22 m Porenfilter filtern. Bei 4 °C lagern.
  3. Erstellen Sie Den ChIP-Zelllysepuffer. 378 mg PIPES, 10,6 ml 2 M KCl und 1,25 g verzweigtes Octylphenoxy-Poly(Ethylenoxy)Ethanol in Wasser auflösen. PH auf 8,0 bei 1 M KOH bei 4 °C einstellen und bis zu 250 ml aufstellen. Durch einen 0,22 m Porenfilter filtern und bei 4 °C lagern.
  4. Machen Sie Mikrokokken-Nuklease (MNase) Verdauungspuffer. Um 1 ml zu machen, mischen Sie 0,1 ml 10x MNase Verdauungspuffer, 10 l 100x BSA-Lösung, 10 l 0,1 m Dithiothreitol und 0,88 ml Wasser.
  5. Machen Sie 1 M NaHCO3. 4,2 g NaHCO3 in 50 ml Wasser auflösen und durch einen 0,22 m Porenfilter filtern. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
  6. Herstellung von 10% Natriumdodecylsulfat (SDS). 5 g SDS in 50 ml Wasser auflösen. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
  7. Erstellen Sie elutionspuffer. Mischen Sie 15 l von 1 M NaHCO3, 15 l mit 10 % SDS und 120 l Wasser, um 150 l Elutionspuffer für eine Probe zu erhalten.
    HINWEIS: Erhöhen Sie die Volumina proportional, abhängig von der Anzahl der Stichproben.
  8. Machen Sie 3 M Natriumacetat (pH 5.2) Lösung. 24,6 g Natriumacetat wasserfrei in Wasser auflösen. PH mit Essigsäure auf 5,2 einstellen und 100 ml aufstellen. Filtern Sie durch einen 0,22 m Porenfilter und lagern Sie bei Raumtemperatur.

2. Bestimmung der MNase Verdauungsbedingungen

HINWEIS: Im Schritt 2 des Protokolls, einem Beispiel mit VCaP, werden menschliche Prostatakrebszellen vorgestellt. Alle Säugetierzelllinien können verwendet werden; siehe Hinweis in den Schritten.

  1. Herstellung von vernetztem Chromatin
    1. Erhalten Sie VCaP-Zellen in DME-hoher Glukose, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einem Kohlendioxid-Inkubator. Seed VCaP Zellen in 4 x 106 Zellen in sechs 6 cm Geschirr in 4 ml Kulturmedien und Kultur für 3 Tage.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jede Zellenlinie geeignete Kulturmedien. Bis zu 10 x 106 Zellen können in einer 6 cm oder 10 cm Schale gesät werden. Für suspendierte Zellen, Samenzellen in T25-Flaschen. Die Anzahl der Gerichte oder Flaschen hängt davon ab, wie viele Dosen auf MNase-Verdauung getestet werden. Wenn 4 Dosen getestet werden, bereiten Sie 6 Gerichte oder Flaschen zu. Siehe auch Schritt 2.2.
    2. Trennen Sie VCaP-Zellen von einer Schale mit Trypsin und zählen Sie die Zelle. Berechnen Sie die Zellennummer in einer Schale. Entfernen Sie bei suspendierten Zellen eine kleine Menge Zellsuspension aus einem Kolben, und zählen Sie die Zellenzahl.
    3. Fügen Sie 0,229 ml von 18,5% PFA zu einem 6 cm Teller in 4 ml Kulturmedien bei einer Endkonzentration von 1% hinzu. Sanft, aber gründlich wirbeln sie ein Gericht oder einen Kolben, um PFA gleichmäßig zu verteilen. Bei Raumtemperatur genau 10 min inkubieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt sind Chromatin und Proteine vernetzt. Da PFA giftig ist, führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Rauchhaube durch und verwenden Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung.
    4. Nach 10 min 0,47 ml 1,25 m Glycinlösung bei einer Endkonzentration von 125 mM hinzufügen. Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
      HINWEIS: Glycin neutralisiert überschüssiges PFA, um eine weitere Vernetzung zu stoppen.
    5. Aspirat formaldehyd/Glycin/Kulturmedien. Waschen Sie die Zellen, indem Sie zweimal 4 ml Phosphat-gepufferte Saline (PBS) hinzufügen. Bei suspendierten Zellen die Zellsuspension bei Raumtemperatur in ein 15 ml konisches Rohr und eine Zentrifuge bei 300 x g für 5 min übertragen. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie ein mittleres Volumen von PBS und vollständig aussetzen. Wiederholen Sie diesen Schritt. Flüssige Abfälle ordnungsgemäß entsorgen, da sie Formaldehyd enthalten.
    6. Bereiten Sie PBS mit Protease und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (PIC) vor, indem Sie PBS 1/100 Volumen von 100x PIC hinzufügen. PBS von einer Schale aspirieren und 1 ml pro PbS-haltiger Schale hinzufügen. Verschrotten Sie die Zellen und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Bei suspendierten Zellen die Suspension einfach in ein 1,5 ml-Rohr übertragen.
    7. Zentrifugenrohre bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um das Zellpellet zurückzugewinnen. Entfernen Sie die PBS vollständig mit einer Pipette. Zeichnen Sie die Zellzahl pro Rohr auf und speichern Sie das Zellpellet bei -80 °C.
  2. Zelllyse und MNase-Verdauung
    HINWEIS: Das Reagenzvolumen in den folgenden Schritten basiert auf einem Rohr, das 6 x 106 Zellen enthält. Reagenzvolumen proportional anpassen, abhängig von der Zellzahl; Wenn ein Rohr 2 x 106 Zellen enthält, verwenden Sie 100 l ChIP-Zelllysepuffer (Schritt 2.2.1), MNase-Verdauungspuffer (Schritt 2.2.3) und ChIP-Verdünnungspuffer (Schritt 2.2.5) und 10 l 0,5 M EDTA (pH 8,0) (Schritt 2.2.4).
    1. Das gespeicherte Zellpellet (VCaP-Zellen, die 6 x 106 Zellen pro Röhre enthalten) in Schritt 2.1.7 auf Eis auftauen. Bereiten Sie den ChIP-Zelllysepuffer, der durch PIC ergänzt wird, vor, indem Sie dem Puffer 1/100 Volumen von 100x PIC hinzufügen. Fügen Sie 300 L ChIP-Zelllysepuffer mit PIC ergänzt und setzen Sie das Pellet gründlich aus. Wirbeln Sie die Röhre für 15 s und inkubieren Sie die Suspension auf Eis für 10 min.
    2. Zentrifuge bei 9.000 x g für 3 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand vollständig. Setzen Sie das Pellet in 300 l MNase-Verdauungspuffer wieder auf.
    3. MNase (2.000 Geleinheit/L) mit MNase-Verdauungspuffer verdünnen, um 50 Geleinheiten/L zu geben. Fügen Sie 0, 0,5, 1, 2, 4 L von 50 Geleinheiten/L MNase in die Suspension und brüten bei 37 °C für genau 10 min, wobei alle 2,5 min durch Inversion gemischt wird.
      ANMERKUNG: Tabelle 1 zeigt optimale Mengen an MNase in mehreren Zelllinien.
    4. Fügen Sie 30 l 0,5 M EDTA (pH 8,0) hinzu, um die MNase-Verdauung und den Wirbel kurz zu beenden. 5 min auf Eis inkubieren. Zentrifuge bei 9.000 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand vollständig.
    5. Bereiten Sie den ChIP-Verdünnungspuffer, der durch PIC ergänzt wird, durch Hinzufügen eines 1/100-Volumes von 100x PIC zum Puffer vor. Setzen Sie das Pellet in 300 l ChIP-Verdünnungspuffer, ergänzt mit PIC, wieder auf.
    6. Beschallen Sie die Suspension auf Eis mit einem Beschallungsgerät, das mit einer Mikrospitzensonde ausgestattet ist. Verwenden Sie die folgenden Beschallungsbedingungen: Amplitude 2, verarbeitete Zeit 15 s, Puls ON 5 s, Puls OFF 30 s. Nehmen Sie 1 L der Suspension und punktieren Sie auf ein Gleitglas und beobachten Sie sie mit einem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Zellstruktur fast gebrochen ist.
      HINWEIS: Abbildung 1A zeigt repräsentative Mikrofotos der VCaP-Zellsuspension vor und nach der Beschallung. Dieser Schritt dient dazu, verdautes Chromatin durch Brechen von Kernmembranen in den Überstand freizusetzen. Eine Leistungseinstellung sollte auf weniger als 5% der maximalen Leistung eingestellt werden und versuchen Beschallung für 5 s dreimal mit mehr als einem 30 s Intervall. Wenn eine Wattleistungssteuerung verfügbar ist, stellen Sie die Leistungseinstellung auf 5 W ein und verarbeiten Sie die Proben für insgesamt 15 s, wie oben erwähnt, um eine Gesamtleistung von 70-75 J zu ergeben. Prüfen Sie, ob die Zellstruktur wie oben erwähnt gebrochen ist. Wenn nicht genug, wiederholen Sie noch einmal. Der oben beschriebene Zustand wird praktisch auf alle getesteten Zelllinien angewendet.
    7. Zentrifuge bei 9.000 x g für 10 min bei 4 °C, den Überstand auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen und 20 l des verdauten Chromatins für Schritt 2.3 einsparen. Den Rest bei -80 °C aufbewahren.
  3. Umgekehrte Vernetzung, Reinigung der DNA und Analyse von verdautem Chromatin
    1. Fügen Sie 75 l Wasser, 4 l 5 M NaCl und 1 l Proteinase K zu einem 1,5 ml Schraubrohr hinzu. Fügen Sie 20 l verdauliches Chromatin aus verschiedenen MNase-Verdauungsbedingungen, die in Schritt 2.2.7 zubereitet werden, in Röhren mit Wasser, NaCl und Proteinase K. Fügen Sie die Kappe fest, mischen Sie sie vollständig und inkubieren Sie das Rohr bei 65 °C über Nacht.
      HINWEIS: Dieser Schritt dient der Entfernung der Vernetzung zwischen Protein und DNA.
    2. Bereiten Sie zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre pro Zustand vor. Fügen Sie 100 l Phenol:Chlorform:Isoamylalkohol (25:24:1) (PCI) zu einem 1,5 ml-Röhrchen hinzu. Fügen Sie 10 l 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2 l Glykogen in eine andere Röhre.
      HINWEIS: Die Verwendung von Chloroform:isoamylalcohol ist nicht notwendig7. Steigendes Volumen kann zu einer geringen DNA-Rückgewinnung nach Ethanol-Ausfällung8führen.
    3. Zentrifugieren Sie das Rohr, das verdautes Chromatin aus Schritt 2.3.1 enthält, kurz und fügen Sie 100 l PCI hinzu. Schließen Sie die Kappe fest, und Wirbel kräftig zu Emulsion bilden. Zentrifugieren Sie das Rohr bei maximaler Geschwindigkeit (z.B. 20.000 x g)für 30 s bei Raumtemperatur.
    4. Nehmen Sie vorsichtig die obere Phase mit DNA und fügen Sie in der Intube mit PCI hergestellt in Schritt 2.3.2. Wirbel kräftig und Zentrifugieren sie das Rohr als Schritt 2.3.3.
      HINWEIS: Wenn die untere Phase kontaminiert ist, zentrifugieren Sie das Rohr erneut, oder entfernen Sie zuerst den größten Teil der unteren Phase, zentrifugieren Sie das Rohr und nehmen Sie die obere Phase.
    5. Nehmen Sie die obere Phase, wie in Schritt 2.3.4 beschrieben, sorgfältig ein und fügen Sie die in Schritt 2.3.2 hergestellte Röhre mit Natriumacetat und Glykogen in die Röhre ein. Fügen Sie 250 l Ethanol hinzu. Durch Inversion mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie das Rohr mit maximaler Geschwindigkeit (z.B. 20.000 x g) für 30 min bei 4 °C.
      HINWEIS: Die Inkubation der Lösung bei Raumtemperatur hat keinen Einfluss auf die DNA-Wiederherstellung8,9.
    6. Bestätigen Sie die Pellets auf der Unterseite des Rohres. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um das Pellet nicht zu stören, und fügen Sie 500 l 70% Ethanol hinzu. Zentrifugieren Sie das Rohr mit maximaler Geschwindigkeit (z.B. 20.000 x g) für 5 min bei 4 °C.
    7. Entfernen Sie den Überstand vollständig und trocknen Sie das Pellet ca. 5 min bei Raumtemperatur. Lösen Sie das Pellet in 20 l von 10 mM Tris HCl/1 mM EDTA (pH 8.0) (TE). Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem UV-Spektralphotometer.
    8. Mischen Sie 0,5 g DNA mit einem Gel-Ladefarbstoff und wenden Sie sich auf 2% Agarose-Gel auf. Elektrophorese die Proben bei 100 V in Tris-Acetat-EDTA Puffer, bis lila Farbstoff in das zwei Drittel des Gels migriert und Färben eines Gels mit 0,5 g/ml Ethidiumbromid für 10 min. Nehmen Sie ein Bild des Gels.
      HINWEIS: Siehe Abbildung 2 für Details.

3. ChromatinImmunpräzipitation

  1. Zubereitung von verdautem Chromatin
    1. Bereiten Sie die Zellen vor. Für anhaftende Zellen, Samen 2-10 x 106 Zellen pro Schale in 2 Gerichten (6 cm oder 10 cm) pro Behandlungsgruppe und lassen Sie die Zellen an den Boden der Gerichte für mehr als 1 Tag zu befestigen. Für suspendierte Zellen Samen in 2 T25-Flaschen pro Behandlungsgruppe. Behandeln Sie die Zellen nach Belieben.
    2. Nehmen Sie ein Gericht oder einen Kolben aus jeder Gruppe und zählen Sie die Zellenzahl wie in Schritt 2.1.2 beschrieben. Bereiten Sie vernetztes Chromatin wie in den Schritten 2.1.3-2.1.7 erwähnt.
    3. Lyse das Zellpellet und MNase-Verdauung wie in den Schritten 2.2.1-2.2.7 beschrieben. Verwenden Sie die optimale Menge an MNase, um Chromatin zu verdauen, wie in Schritt 2 bestimmt. Verdautes Chromatin bei -80 °C lagern.
    4. Reverse-Crosslink 20 l verdautem Chromatin und reinigen SIE DIE DNA, wie in Schritt 2.3.8 beschrieben. Messung der DNA-Konzentration, wie in Schritt 2.3.7 beschrieben. Elektrophorese die Proben in 2% Agarose-Gel, um die Größe des verdauten Chromatins zu überprüfen, wie in Schritt 2.3 erwähnt.
      HINWEIS: Die DNA-Konzentration ist identisch mit der von gespeichertem verdautem Chromatin, das in Schritt 3.1.3 hergestellt wurde.
    5. Verdünnen Sie eine umgekehrte vernetzte verdaute Chromatinprobe ab Schritt 3.1.4, um 10 ng/l mit Wasser zu geben, und wird seriell verdünnt, um Konzentrationen von 1, 0,1 und 0,01 ng/L zu erzielen. Bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Diese Beispiele werden für Echtzeit-PCR-Standards verwendet.
  2. Immunopräzipitation
    ANMERKUNG: In den Schritten 3.2-3.5 des Protokolls wird die Anti-Trimethylierte Histon-H3-Lysin-4-Belegung (H3K4me3) in VCaP-Zellen bestimmt. Siehe auch Abbildung 3.
    1. Tauverdaut Chromatin ab Schritt 3.1.3. Alle Proben auf Eis halten.
    2. Bereiten Sie den ChIP-Verdünnungspuffer, der durch PIC ergänzt wird, durch Hinzufügen eines 1/100-Volumes von 100x PIC zum Puffer vor. Verdünnung des verdauten Chromatins auf 5 g/500 l mit ChIP-Verdünnungspuffer, ergänzt durch PIC. Bereiten Sie 1.000 l plus extra für (1) IP mit nicht immunem IgG (Control IgG), (2) IP mit H3K4me3 vor.
    3. Fügen Sie einem 1,5 ml Schraubrohr als Eingangsprobe (1% einer IP- und einer IP-Datei) 5 l von 5 g/500 l verdautem Chromatin hinzu. Bewahren Sie die Probe bei -80 °C auf.
    4. Als IP-Probe wird einem 1,5 ml Schraubrohr jeweils 500 l von 5 g/500 l verdautem Chromatin hinzugefügt. Fügen Sie dem Rohr 2 g Antikörper hinzu. Schließen Sie die Kappe und inkubieren Sie das Rohr bei 4 °C über Nacht mit sanftem Mischen mit einer Schaukelplattform.
      HINWEIS: Obwohl die optimale Antikörpermenge empirisch bestimmt werden sollte, werden zunächst 2 g pro IP empfohlen.
    5. Fügen Sie 30 L ChIP-Grade-Protein G-Magnetperlen pro IP hinzu. Inkubieren Sie das Rohr bei 4 °C für 2 h mit sanftem Mischen mit einer Schaukelplattform.
      HINWEIS: Eine Vorwäsche von Magnetperlen ist nicht erforderlich.
  3. Waschen von Immunkomplexen und Umkehrung der Vernetzung
    1. Drehen Sie das Rohr von Schritt 3.2.5 kurz nach unten. Legen Sie das Rohr in ein Polyethylen-Rack mit Neodinium-Magneten für 1 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Aspiration.
    2. Fügen Sie 0,5 ml pro Tube mit niedrigem Salz immunkomplex Waschpuffer. Dispergieren Sie die Perlen, indem Sie sanft tippen oder kurz wirbeln die Röhre. Inkubieren Sie das Rohr bei 4 °C für 5 min mit sanftem Mischen mit einer Schaukelplattform. Nach 5 min, wiederholen Sie Schritt 3.3.1.
    3. Fügen Sie 0,5 ml hochsalzen Immunkomplex Waschpuffer pro Tube hinzu. Die Perlen als Schritt 3.3.2 verteilen und waschen. Wiederholen Sie nach dem Waschen Schritt 3.3.1.
    4. Fügen Sie 0,5 ml LiCl Immunkomplex Waschpuffer pro Tube hinzu. Die Perlen als Schritt 3.3.2 verteilen und waschen. Wiederholen Sie nach dem Waschen Schritt 3.3.1.
    5. Legen Sie das Rohr für 1 min in ein magnetisches Rack. Entfernen Sie den restlichen Überstand vollständig.
    6. Fügen Sie dem Rohr 150 L Elutionspuffer hinzu. Wirbel nieren Sie die Röhre, um die Perlen vollständig zu zerstreuen. Schließen Sie die Kappe und inkubieren Sie das Rohr bei 65 °C für 30 min, mischen Sie durch Inversion oder Wirbel alle 5 min, um die Perlen gründlich zu zerstreuen.
    7. Während der Inkubation ein 1,5 ml Schneckenrohr vorbereiten und 6 l 5 M NaCl und 2 l Proteinase K. Thaw 1% Eingangsprobe in Schritt 3.2.3 zubereiten. Fügen Sie 150 l Elutionspuffer, 6 l von 5 M NaCl und 2 l Proteinase K bis 1% Eingangsprobe hinzu.
    8. Nach der Inkubation die Röhre nach unten drehen. Legen Sie das Rohr 1 min in ein Magnetgestell und übertragen Sie den Überstand auf das Inschritt 3.3.7 hergestellte Schraubrohr mit NaCl und Proteinase K.
    9. Schließen Sie die Kappe und Wirbel alle IP- und Eingangsbeispiele vollständig zu mischen. Inkubieren Sie das Rohr bei 65 °C über Nacht.
  4. DNA-Reinigung
    1. Bereiten Sie das Rohr wie in 2.3.2 beschrieben vor und fügen Sie 150 l PCI anstelle von 100 l hinzu. In einem anderen Röhrchen 12 l 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2 l Glykogen hinzufügen.
    2. Entfernen Sie das Rohr aus dem Inkubator. Drehen Sie das Rohr herunter und fügen Sie 150 L PCI hinzu.
    3. Wirbel kräftig das Rohr, um Emulsion zu bilden. Zentrifugieren Sie das Rohr bei maximaler Geschwindigkeit (z.B. 20.000 x g) für 30 s bei Raumtemperatur.
    4. Übertragen Sie 140 l der oberen Phase vorsichtig in das in Schritt 3.4.1 hergestellte Rohr mit PCI. Wiederholen Sie Schritt 3.4.3.
      HINWEIS: Siehe auch Hinweis in Schritt 2.3.4.
    5. In Schritt 3.4.1 sorgfältig 120 l der oberen Phase in die Inröhre mit Natriumacetat und Glykogen geben.
      HINWEIS: Siehe auch Hinweis in Schritt 2.3.4.
    6. Fügen Sie 300 l Ethanol hinzu. Durch Inversion mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Zentrifugieren Sie das Rohr mit maximaler Geschwindigkeit (z.B. 20.000 x g) für 30 min bei 4 °C. Waschen Sie das Pellet wie in Schritt 2.3.6 beschrieben.
    8. Nach dem Trocknen des Pellets, wie in Schritt 2.3.7 beschrieben, lösen Sie das Pellet in 50 l TE auf. Bei -20 °C lagern.
  5. Detektion von DNA-Fragmenten mit Echtzeit-PCR
    1. Die folgenden Proben auftauen: (1) IP mit Control IgG, (2) IP mit Anti-H3K4me3, (3) 1% Eingangsstichprobe. Tauen Sie auch 4 Dosen von Standards in Schritt 3.1.5 (insgesamt 7 Proben) vorbereitet.
      HINWEIS: Verwenden Sie Standards aus derselben Gruppe für die Quantifizierung von DNA-Mengen in den Eingabe- und IP-Proben.
    2. Machen Sie PCR-Arbeitslösung für 8 Proben. Mischen Sie 40 l mit 2x Echtzeit-PCR-Supermix, 8 l mit jeweils 4-M-Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen und 8 l Wasser.
      HINWEIS: Ein PCR-Reaktionsgemisch enthält 5 l mit 2x Echtzeit-PCR-Supermix, 1 l jeweils 4-M-Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen und 1 l Wasser. Primersequenzen sind in Tabelle 2aufgeführt.
    3. Aliquot 8 l PCR-Arbeitslösung in einem Brunnen einer PCR-Platte. Fügen Sie 2 L Proben aus Schritt 3.4.8 oder Standards aus Schritt 3.1.5 hinzu.
    4. Versiegeln Sie die PCR-Platte und führen Sie PCR unter folgenden Bedingungen: 1) 95 °C für 3 min für die anfängliche Denaturierung, 2) 95 °C für 10 s zur Denaturierung, 3) 56 °C für 30 s zum Glühen, 4) 72 °C für 30 s für Erweiterung und Datenerfassung , wiederholen Sie die Schritte 2) bis 4) für 55 Zyklen. Messen Sie nach dem Radfahren eine Schmelzkurve des PCR-Produkts. Analysieren Sie die Daten.
      HINWEIS: Die Rohdaten für Abbildung 3 sind in Tabelle 3dargestellt. Berechnen Sie die Startmenge (SQ) der Proben mit einer Standardkurve. Multiplizieren Sie SQ in 1% Input mit 100, um eine SQ von 1% Eingangsstichprobe auf eine IP anzupassen, um einen angepassten SQ in Input (Eq. 1) zu geben. Dividieren Sie SQ in IP-Beispiel durch angepasste SQ in Input, um % Eingabewert (Prozent Eingabemethode, Eq. 2) zu geben. Um die Falzanreicherung zu berechnen, teilen Sie SQ in IP mit Anti-H3K4me3 durch SQ in IP mit Steuerung IgG (Faltenanreicherungsmethode, Eq. 3).
      Bereinigter SQ in Eingang = (SQ in 1% Eingang) x 100 (1)
      Prozentualer Eingang von H3K4me3 = 100 x (SQ in IP mit Anti-H3K4me3) / (Adjusted SQ in Input) (2)
      Faltenanreicherung von H3K4me3 = (SQ in IP mit Anti-H3K4me3) / (SQ in IP mit Steuerung IgG) (3)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Das Verdauungschromatin ist einer der wichtigen Schritte für einen ChIP-Assay. Wir verwendeten MNase, um Chromatin zu verdauen, um eine Mischung von Nukleom-Oligomeren zu erhalten. Im MNase-Verdauungsschritt kann MNase durch die Kernmembran gehen und Chromatin verdauen. Das verdaute Chromatin kann jedoch nicht durch die Membran gehen und verbleibt in den Kernen. Um das verdautes Chromatin aus den Kernen zu befreien, ist eine kurze Beschallung erforderlich. Abbildung 1A zeigt Mikrofotos vor und nach der Beschallung der VCaP-Zellsuspension. Ohne Beschallung bleibt die Zellstruktur intakt, was darauf hinweist, dass das Chromatin in den Kernen vorhanden ist. Eine kurze Beschallung bricht die Zellstruktur, und die Überprüfung der Zellen in Mikrofotos hilft, die kurzen Beschallungsbedingungen zu bestimmen. Wir stellten auch andere Beispiele für die kurze Beschallung in 293T-Zellen dar (Abbildung 1B) die menschliche b-Zell-akute lymphoblastische Leukämie-Zelllinie, REH-Zellen (Abbildung 1C) und die menschliche Prostatakrebs-Zelllinie, LNCaP (Abbildung 1D).

Abbildung 2A zeigt die Chromatinfragmentierung nach der Behandlung mit unterschiedlichen Mengen an MNase in VCaP-Zellen. Wir behandelten 6 x 106 vernetzte VCaP-Zellpellets mit 0, 50, 100, 200 Geleinheiten von MNase in 300 l Verdauungspuffer für 10 min bei 37 °C. Nach der Reinigung des verdauten Chromatins wurden 500 ng DNA auf 2% Agarose-Gel analysiert und mit Ethidiumbromid gefärbt. Ohne MNase wurde ein Abstrichmuster mit einem sehr hohen Molekulargewicht (Lane 1) angezeigt. Die Zugabe von MNase gab ein Leitermuster (N; eine Mononukleosomeinheit), die zeigt, dass MNase Internukleosom verdaut (Bahnen 2-5). Abbildung 2B zeigt ein unangemessenes Verdauungsmuster. Überverdauung führte hauptsächlich zur Mononukleosomproduktion (Abbildung 2B, Spur 7). Wir sollten die richtigen Bedingungen finden, die Chromatinfragmente bis zu 900 bp erzeugen (ein bis fünf Nukleosomen; z.B. Spur 5).

Um zu überprüfen, ob der ChIP-Test ordnungsgemäß durchgeführt wird, ist es wichtig, geeignete Kontrollen im Assay zu haben. Bei Immunpräzipitation werden nichtimmune IgGs derselben Spezies wie die Antikörper von Interesse als Kontrollmittel verwendet, die eine unspezifische Bindung an dieselbe Region zeigen (siehe Diskussion). Darüber hinaus wird empfohlen, die Bindung der Proteine (Belegung) sowohl in positiven als auch in negativen Regionen zu messen. Es ist allgemein anerkannt, dass die H3K4me3-Belegung auf etwa eine Kilobasis (kb) vor und nach den Transkriptionsstartstandorten10,11verteilt ist. Wir haben die H3K4me3-Belegung im AR-Genom gemessen, die sich über ca. 20 kb flussaufwärts bis 12 kb flussabwärts der AR-Transkriptionsstartstelle (AR-TSS) in AR-positiven VCaP-Zellen erstreckt. Das Verdauungsmuster von Chromatin in VCaP-Zellen, die in diesem Experiment verwendet wurden, wurde in Abbildung 3Adargestellt, was auf die richtige Verdauung von Chromatin hindeutet. Die höchste Auslastung von H3K4me3 wurde rund um die AR-TSS und 0,5 kb und 1 kb vor dem AR-TSS beobachtet (Abbildung 3B). Solange Gene transkriptionsaktiv sind, können TSS "positive Regionen" sein. Regionen mit 19 kb und 8 kb vor und 12 kb flussabwärts von AR-TSS hatten jedoch eine geringe Auslastung von H3K4me3 (Abbildung 3B),was darauf hindeutet, dass diese als "negative Regionen" verwendet werden können.

Es wurde gezeigt, dass ein Androgen die BElegung von RNA-Polymerase II im PSA-Promotor und Enhancer in LNCaP-Zellen mit geschertem Chromatin durch Beschallung12,13erhöht. Wir haben daher die Gültigkeit unseres Protokolls getestet, indem wir die aktive RNA-Polymerase-II-Belegung (phosphorylierte RNA-Polymerase II an Serin 5; PolII(pS5)) in den Zellen. Wir haben das gleiche Experiment durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit unserer Methode zu überprüfen. LNCaP-Zellen wurden in Steroid-hungrigen Medium für 3 Tage kultiviert und stimuliert mit einem Fahrzeug oder 10 nM Dihydrotestosteron (DHT) für 4 h. Aktive RNA-Polymerase II Belegung wurde durch Immunpräzipitation mit Anti-PolII (pS5) gemessen, gefolgt von Echtzeit-PCR. Abbildung 4A zeigt ein reproduzierbares Verdauungsmuster von Chromatin aus LNCaP-Zellen in drei unabhängigen Experimenten. Wie in Abbildung 4Bdargestellt, erhöhte DHT die PolII(pS5)-Belegung im PSA-Promoter und Enhancer bei Verwendung der prozentualen Eingabemethode signifikant. Wir berechneten auch die Belegung nach der Faltenanreicherungsmethode (Abbildung 4C) und stellten fest, dass kein signifikanter Unterschied in PolII(pS5) im PSA-Promotor mit oder ohne DHT-Behandlung beobachtet wurde. DHT hatte keinen Einfluss auf die Belegung des GAPDH-Projektträgers, wie zuvor veröffentlicht14. Wichtig ist, dass unsere Daten denen aus beschallungsgescheuten Chromatinproben12,13ähneln.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Mikrofotos von vernetzten Zellpellets vor und nach der Beschallung. Vernetzte VCaP (A), 293T (B), REH (C) und LNCaP (D) Zellpellets wurden mit MNase behandelt, und Pellets wurden im ChIP-Verdünnungspuffer resuspendiert. Vor und nach der Beschallung wurden Bilder der Suspensionen gemacht. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Agarose-Gel-Analyse von verdautem Chromatin. (A) Vernetztes Chromatin wurde aus VCaP-Zellen hergestellt und mit verschiedenen Mengen MNase verdaut, wie in Schritt 2.2 beschrieben. Digested Chromatin wurde umgekehrt vernetzt, gereinigt und in einem 2% Agarose-Gel analysiert. N; eine Mononukleomeinheit. (B) Chromatin von VCaP-Zellen wurde mit 250 Geleinheiten von MNase pro 2 x 106 Zellen bei 37 °C für 20 min verdaut und analysiert (wie in A beschrieben). Größere Mengen an MNase und längere Inkubationszeiten führten dazu, dass eine nahezu vollständige Verdauung von Chromatin zu Mononukleosomen (150 bp) führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: H3K4me3 Belegung im AR-Genom. Verdautes Chromatin wurde aus VCaP-Zellen hergestellt. (A) Das Verdauungsmuster wurde mit einem Agarose-Gel analysiert. (B) 5 g verdautes Chromatin wurde mit 2 g entweder normalem Kaninchen-IgG- oder Anti-H3K4me3-Antikörper, wie in Schritt 3.1 und Schritt 3.2 erwähnt, immunpräzipiert. Immunkomplexe wurden aus Perlen gewaschen und verdstoben und umgekehrt vernetzt. Gereinigte DNA-Fragmente wurden mit Echtzeit-PCR mit den in Tabelle 2aufgeführten Primer-Sets analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Androgen erhöhte die aktive RNA-Polymerase-II-Belegung im PSA-Promotor und Enhancer. Steroid-hungrige LNCaP-Zellen wurden mit oder ohne 10 nM DHT für 4 h behandelt, und verdaut es chromatin wurde vorbereitet. (A) Verdauungsmuster von Chromatin aus LNCaP-Zellen in drei unabhängigen Experimenten. (B,C) Verdautes Chromatin wurde mit einem AntipolII(pS5)-Antikörper immunpräzipiert, und DNA-Fragmente wurden wie in Abbildung 3beschrieben gereinigt. Die Belegung der aktiven RNA-Polymerase II im PSA-Promotor, Enhancer und GAPDH-Promotor als prozentiger Input (B) und Faltenanreicherung (C) wurde mit Echtzeit-PCR mit den in Tabelle 2aufgeführten Primer-Sets bestimmt. Die gezeigten Ergebnisse sind mittelwert - SE aus drei unabhängigen Experimenten. (*); p<0,05, (**); p < 0,01 versus 0 nM DHT-Behandlung. NS; nicht signifikant im Vergleich zu 0 nM DHT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zelllinie Geleinheiten pro zwei Millionen Zellen in 100 l Puffer, 37 °C für 10 min
LNCaP 267
VCaP 66,7
293T 450
REH 134
22Rv1 400

Tabelle 1: Optimale Menge an Mikrokokken-Nuklease in verschiedenen Zelllinien. Der Wert stellt die Mengen von MNase pro 2 x 106 Zellen in 100 l Puffer, 37 °C für 10 min dar.

Primername folge
AR (-18,8 kb) Fwd ATTTGGAACTGGGAACATCT
den motor auf touren bringen CACCTTCTCTCCTCT
AR (-8.8kb) Fwd TAACAGCTGTGCATCCAAGT
den motor auf touren bringen TGAAATCTGGGACTAAAGCA
AR (-8.2kb) Fwd CAGTGCTATTCCCTTGTGAC
den motor auf touren bringen TTGGACTGGCTCTCTTGA
AR-TSS (0 kb) Fwd GCAAACTGTTGCATTTGCTC
den motor auf touren bringen GGCCCTTTTTCCCTCTGTC
AR (0,6 kb) Fwd CACGACCCGCCTGGTTAG
den motor auf touren bringen TGAAGACCTGACTGCCTTTTC
AR (+1.0kb) Fwd CCGCAAGTTTCCTTCTCTGG
den motor auf touren bringen CTTCCCAGCCCTAACTGCAC
AR (+11.8kb) Fwd CCTTGCTTGTGGAACTGTAG
den motor auf touren bringen TTTATTGTCTGGTGCTAGGC
PSA-Promoter Fwd CCTAGATGAAGTCTCCATGAGCTACA
den motor auf touren bringen GGGAGGGAGAGCTAGCACTTG
PSA Enhancer Fwd GCCTGGATCTGAGAGAGATATCATC
den motor auf touren bringen ACACCTTTTTTTTGTGGATTTG
GAPDH Fwd TACTAGCGGTTTTACGGGCG
den motor auf touren bringen TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA

Tabelle 2: Gekoppelte Primer-Sequenzen, die für den ChIP-Assay verwendet werden.

AR (-18,8 kb) Cq Sq Angepasst auf eine IP % Input Faltenanreicherung
1% Input 23,49 0,815 81,5 100
IP mit Steuerung IgG 27,68 0,051 0,051 0,062 1
IP mit Anti-H3K4me3 22,48 1.590 1.590 1.951 31,4
AR (-8.8kb) Cq Sq Angepasst auf eine IP % Input Faltenanreicherung
1% Input 23,22 0,586 58,6 100
IP mit Steuerung IgG 26,81 0,052 0,052 0,088 1
IP mit Anti-H3K4me3 23,74 0,414 0,414 0,706 8,0
AR (-8.2kb) Cq Sq Angepasst auf eine IP % Input Faltenanreicherung
1% Input 23.19 Uhr 0,643 64,3 100
IP mit Steuerung IgG 26,99 0,048 0,048 0,075 1
IP mit Anti-H3K4me3 23,63 Uhr 0,477 0,477 0,742 9,9
AR-TSS (0 kb) Cq Sq Angepasst auf eine IP % Input Faltenanreicherung
1% Input 25.06 Uhr 0,657 65,7 100
IP mit Steuerung IgG 28,63 Uhr 0,050 0,050 0,077 1
IP mit Anti-H3K4me3 20,70 Uhr 15.064 15.064 22.944 299,8
AR (0,6 kb) Cq Sq Angepasst auf eine IP % Input Faltenanreicherung
1% Input 23,86 0,716 71,6 100
IP mit Steuerung IgG 26,67 0,106 0,106 0,147 1
IP mit Anti-H3K4me3 19.15 Uhr 17.787 17.787 24.840 168,6
AR (+1.0kb) Cq Sq Angepasst auf eine IP % Input Faltenanreicherung
1% Input 23,51 0,730 73,0 100
IP mit Steuerung IgG 25,94 0,125 0,125 0,171 1
IP mit Anti-H3K4me3 19.06 Uhr 18.486 18.486 25.335 147,8
AR (+11.8kb) Cq Sq Angepasst auf eine IP % Input Faltenanreicherung
1% Input 24,54 0,876 87,6 100
IP mit Steuerung IgG 29.14 Uhr 0,033 0,033 0,037 1
IP mit Anti-H3K4me3 24,47 0,918 0,918 1.048 27,97

Tabelle 3: Rohdaten aus der quantitativen PCR-Analyse für Abbildung 3. Cq: Schwellenwertzykluszahl, SQ: Startmenge berechnet mit einer Standardkurve, Angepasst auf eine IP: Multiplizieren SQ in 1% Input mit 100 als 1% Probenvolumen einer IP wird für PCR verwendet, % Input: Dividieren SQ in IP-Probe durch angepasste SQ in Eingang, Faltenanreicherung : Teilen Sie SQ in IP mit Anti-H3K4me3 durch SQ in IP mit Steuerung IgG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Obwohl Beschallung häufig verwendet wird, um fragmentiertes Chromatin zu erhalten, ist es zeitaufwändig und umständlich, reproduzierbare Bedingungen zu identifizieren. In diesem Protokoll haben wir die MNase-Verdauung verwendet, da die Enzymverdauung leichter reproduzierbare Bedingungen zu identifizieren sein sollte. Ein kurzer Beschallungsschritt nach der MNase-Verdauung (siehe Schritt 2.2) war notwendig, um die Zellmembran zu brechen und das verdaute Chromatin freizusetzen. Daher sollte die Beschallungsleistung in unserem Protokoll so gering wie möglich sein. Wir verwenden die gleichen Beschallungsbedingungen für alle Zellen, die wir eingesetzt haben (siehe Abbildung 1 und Tabelle 1), um einen vollständigen Zerfall der Membran zu erreichen.

Die Verdauung von Chromatin durch MNase ist ein wichtiger Schritt in unserem Protokoll, und daher haben wir große Anstrengungen unternommen, um die Bedingungen für die Verdauung von Chromatin in Zellen zu optimieren. Die Verdauungsaktivität wird durch die Mengen an Enzym und Substrat (Chromatin) und Inkubationszeit bestimmt. Da die Ploidie zwischen den verschiedenen Zellen variiert, müssen außerdem für jeden Zelltyp die optimalen Bedingungen für die MNase-Verdauung ermittelt werden. Einmal etabliert, können die gleichen Bedingungen unabhängig von den Zellbehandlungen angewendet werden. Wir überprüfen immer die Chromatin-Verdauungsmuster in jedem Experiment, um sicherzustellen, dass die Verdauungsmuster für ChIP-Assays geeignet sind, wie in Abbildung 2A, Spur 5 dargestellt.

Einige Faktoren beeinflussen die Ergebnisse von ChIP-Assays. Es ist wichtig, die richtige Menge an verdautem Chromatin in unserem Protokoll zu verwenden. In vielen Protokollen wird die Zellnummer, aber nicht die Chromatinmenge für eine IP15,16angezeigt. Diese experimentellen Bedingungen erzeugen eine hohe Variabilität in der Menge an Chromatin zwischen den Zellen aufgrund von Ploidy-Unterschieden. Wir verwenden im Test 5 g Chromatin und 2 g Antikörper pro IP, daher ist unser Protokoll einfacher und klarer als andere Protokolle, obwohl optimale Mengen an Antikörpern für IP erforderlich sein können. Die Auswahl der Antikörper ist ebenfalls wichtig; ChIP-Assay-validierte Antikörper verwenden.

Es gibt zwei Methoden, um ChIP PCR-Daten zu analysieren: die prozentuale Eingabemethode und die Faltenanreicherungsmethode. Bei der prozentualen Eingangsmethode werden Signale aus IP-Samples durch Signale aus Gesamtchromatin in der IP-Probe geteilt. Bei der Faltenanreicherungwerden werden Signale von IP mit einem spezifischen Antikörper wie H3K4me3 durch Signale von IP mit der Steuerung IgG geteilt. Die spätere Methode ist nur anwendbar, wenn Signale von IP mit der Steuerung IgG bei mehreren Zielen oder identischen Zielen unter den verschiedenen physiologischen Bedingungen ähnlich und reproduzierbar sind. In der Praxis variieren die Signalpegel, so dass der Faltenanreicherungswert eine hohe Variabilität hat, wie in Abbildung 4Cdargestellt. Daher empfehlen wir nicht, die Faltanreicherungsmethode zu verwenden, um ChIP-Daten in unserer Methode darzustellen.

MNase bevorzugt eine "offene" Euchromatin-Umgebung und ist für eine Heterochromatin-Struktur nicht zugänglich, was darauf hindeutet, dass die MNase-Verdauung zu einer gewissen Verzerrung führen kann. Es wurde berichtet, dass die Anreicherung von Lamin A-interagierenden Chromatin-Domänen unterscheidet zwischen Beschallung-geschoren und MNase-verdaute Chromatin-Präparate17. Daher ist die MNase-Verdauung im ChIP-Assay möglicherweise nicht geeignet, kernstrukturassoziierte Moleküle wie Lamin A/C und spezielles AT-reiches Sequenzbindungsprotein 1 (SATB1) zu analysieren.

In ChIP-Assay-Protokollen, die für nachgeschaltete Mikroarray- (ChIP-on-Chip) oder Sequenzierungsanalysen (ChIP-seq) entwickelt wurden, wird RNase während des DNA-Reinigungsschritts verwendet, jedoch nicht in Protokollen, die für PCR-Analysen18entwickelt wurden. Wir haben nicht getestet, ob unser Protokoll mit ChIP-on-Chip- und ChIP-seq-Analysen kompatibel ist, aber wir gehen davon aus, dass unser Protokoll anwendbar ist, wenn Proben mit RNase behandelt werden. Wenn eine RNase-Behandlung erforderlich ist, verwenden Sie 2 l von 10 mg/ml DNase-freie RNase A anstelle der Proteinase K in Schritt 3.3 und inkubieren Sie bei 65 °C über Nacht. Vor der Reinigung der DNA (Schritt 3.4) die Proteinase K hinzufügen und zusätzlich 1 h bei 60 °C inkubieren.

Wir führen routinemäßig ChIP-Assays mit modifizierten Histon- und Transkriptionsfaktoren mit der hier beschriebenen Methode durch und haben gezeigt, dass der Chromatin-Remodellierungsfaktor, AT-reiche Interaktionsdomäne 5B, die AR-Genexpression reguliert, indem die Belegung von PolII( pS5) und H3K4me3 im AR-Promoter19. Wir glauben, dass unser Protokoll technisch einfacher ist als andere ChIP-Assays und in der molekularbiologischen Forschung weithin akzeptabel ist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Forschung wird von Genentech Royalties to City of Hope unterstützt. Diese Arbeit wird weder ganz noch teilweise von den National Institutes of Health unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA (pH 8.0) Thermo Scientific AM9010
2 M KCl Thermo Scientific AM9010
2x iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 1706862
5 M NaCl Thermo Scientific AM9010
50 bp DNA ladder New England Biolabs N3236S
Agarose Research Product International A20090
Branched octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol Millipore Sigma I8896 IGEPAL CA-630
ChIP-grade protein G magnetic beads Cell signaling technology 9006S
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Dilution Buffer Millipore Sigma 20-153 Buffer composition: 0.01% SDS, 1.1% Triton X- 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl.
Gel Loading Dye Purple (6x) New England Biolabs B7024S
Glycine Bio-Rad 161-0724 Electropheresis grade
Glycogen Millipore Sigma G1767 19-22 mg/mL
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78445
High Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-155 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 500 mM NaCl.
Histone H3K4me3 antibody (pAb) Active Motif 39915
LiCl Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-156 Buffer composition: 0.25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.1.
Low Salt Immune Complex Wash Buffer Millipore Sigma 20-154 Buffer composition: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 well) Millipore Sigma 20-400 Any kind of magnetic separation stands that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
Micrococcal nuclease New England Biolabs M0247S comes with 10x buffer (500 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.9 at 25 °C) and 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3 JT Baker 3506-01
Normal rabbit IgG Millipore Sigma 12-370
PIPES Millipore Sigma P6757
Proteinase K Millipore Sigma 3115887001
Real-time PCR system Bio-Rad CFX96, C1000
RNA pol II CTD phospho Ser5 antibody Active Motif 39749
SDS Boehringer Mannheim 100155 Electropheresis grade
sodium acetate Millipore Sigma S5636
Sonicator equipped with a microtip probe QSONICA Q700 Any kind of sonicators that are compatible with a 1.5 mL tube is fine.
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Scientific 15593031 pH 8.05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
  2. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Jackson, V., Chalkley, R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: identification of new viral gene product. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (10), 6081-6085 (1981).
  5. Jackson, V., Chalkley, R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell. 23 (1), 121-134 (1981).
  6. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  7. Ausubel, R. B., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smith, J. A., Struhl, K. Preparation of Genomic DNA. Short Protocols in Molecular Biology. , Second Edition, Unit 2.1, 2-4 (1992).
  8. Crouse, J., Amorese, D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate. Focus. 9 (2), 3-5 (1987).
  9. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  10. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  11. Guenther, M. G., Levine, S. S., Boyer, L. A., Jaenisch, R., Young, R. A. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell. 130 (1), 77-88 (2007).
  12. Louie, M. C., et al. Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-p160 coactivator complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2226-2230 (2003).
  13. Liu, X., et al. Positive feedback loop mediated by protein phosphatase 1alpha mobilization of P-TEFb and basal CDK1 drives androgen receptor in prostate cancer. Nucleic Acids Research. 45 (7), 3738-3751 (2017).
  14. Zhao, H., et al. Identification of valid reference genes for mRNA and microRNA normalisation in prostate cancer cell lines. Scientific reports. 8 (1), 1949 (2018).
  15. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nature. 1 (1), 179-185 (2006).
  16. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  17. Lund, E. G., Duband-Goulet, I., Oldenburg, A., Buendia, B., Collas, P. Distinct features of lamin A-interacting chromatin domains mapped by ChIP-sequencing from sonicated or micrococcal nuclease-digested chromatin. Nucleus. 6 (1), 30-39 (2015).
  18. Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature protocols. 3 (6), 1032-1045 (2008).
  19. Yamakawa, T., Waer, C., Itakura, K. AT-rich interactive domain 5B regulates androgen receptor transcription in human prostate cancer cells. Prostate. 78 (16), 1238-1247 (2018).

Tags

Genetik Ausgabe 147 Genregulation Histonmodifikation Chromatin-Immunpräzipitation Mikrokokken-Nuklease RNA-Polymerase II trimethyliertes Histon H3-Lysin 4
Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin… More

Yamakawa, T., Itakura, K. Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59375, doi:10.3791/59375 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter